濕地松雄性不育和可育系小孢子葉球形態(tài)和細(xì)胞發(fā)育動(dòng)態(tài)變化

周洋 楊章旗 黃永利

摘 要： 為了解濕地松‘松泰小孢子葉球在發(fā)育過(guò)程形態(tài)是否有差異變化，明確其敗育過(guò)程、敗育方式及影響因素，為濕地松雄性不育品種利用和后期開(kāi)展相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。該研究以‘松泰 s10敗育系和s9可育系為材料，觀察小孢子葉球形態(tài)發(fā)育變化，并對(duì)其小孢子葉球進(jìn)行石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育過(guò)程。結(jié)果表明：s10敗育系和s9可育系在小孢子母細(xì)胞減速分裂前無(wú)明顯差異，小孢子葉球生長(zhǎng)趨勢(shì)也一致;四分體時(shí)期，s10小孢子細(xì)胞發(fā)育異常，小孢子葉球形態(tài)發(fā)育也出現(xiàn)異常，二者異常發(fā)育具有同步性;可育系從四分體到單核小孢子發(fā)育階段的時(shí)間為5 d左右，而敗育系持續(xù)發(fā)育長(zhǎng)達(dá)20 d左右，持續(xù)時(shí)間為可育系的4倍。在此期間出現(xiàn)小孢子絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常、降解緩慢，小孢子囊壁組織排列紊亂、降解延遲等現(xiàn)象，s10形成異常二核花粉，且無(wú)花粉散出。因此，推論s10小孢子敗育的原因主要是小孢子囊壁細(xì)胞發(fā)育異常，其小孢子葉球形態(tài)異常，相對(duì)應(yīng)的絨氈層在四分體時(shí)期發(fā)育異常，不能適時(shí)地分泌胼胝質(zhì)酶來(lái)降解圍繞著四分體的胼胝質(zhì)壁，也不能適時(shí)地合成輸送花粉形成所需能量物質(zhì)，同時(shí)囊壁細(xì)胞出現(xiàn)降解延遲和層積，這一系列的異常變化導(dǎo)致不能形成正常四分體，從而使花粉敗育。

關(guān)鍵詞： 濕地松， 小孢子葉球， 雄性不育， 細(xì)胞發(fā)育， 形態(tài)變化

中圖分類(lèi)號(hào)： Q944.46 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2020）04-0482-10

Abstract： In order to understand whether there are differences in morphology of microstrobilus of Pinus elliottii ‘Songtai during development， to clarify its abortion process， abortion mode and influencing factors， and to provide scientific basis for utilization and later research of male sterile varieties of Pinus elliottii， the morphological changes of microstrobilus were observed by using ‘Songtai s10 abortive line and s9 fertile line as materials， and the microstrobilus was sliced in paraffin and the development of microspore was observed under optical microscope. The results were as follows： There was no significant differences between s10 abortion line and s9 fertile line before meiotic phase of microsporocy deceleration and division， and the growth trend of microstrobilus was the same. In the period of tetrad， s10 microspore cell development and microstrobilus morphological development were abnormal. The time from tetrad to monocyte microspore development of fertile lines is about 5 d. However， the abortion line continued to develop for about 20 d， and the duration was four times that of the fertile line. In the meantime， the development of tapetum cells was abnormal， the degradation was slow， the tissue arrangement of microsporangium wall was disordered， and the degradation was delayed. Finally， s10 forms abnormal dinuclear pollen and no pollen dispersion. So it can be reasoned that the abnormal development of microsporangium wall cells， and the abnormal morphology of microstrobilus.The tapetum develops abnormally in the tetrad period， and the callose enzyme can not be secreted at appropriate time to degrade the callosum wall surrounding the tetrad， nor can it synthesize and transport the energy substances needed for pollen formation in a timely manner. At the same time， the cystic wall cells showed delayed degradation and lamination. This series of abnormal changes leaded to the normal tetrad could not be formed， which made the pollen abortion.

Key words： Pinus elliottii， microstrobilus， male sterile， cell development， morphological changes

濕地松（Pinus elliottii）原產(chǎn)于美國(guó)東南部溫濕多雨的低海拔地區(qū)，海拔600 m以上，常綠大喬木（鄭萬(wàn)鈞等，1978;朱志淞，1993）。我國(guó)最早在20世紀(jì)30年代開(kāi)始引種濕地松，并于1964年在廣東省臺(tái)山縣建立了第一個(gè)濕地松初級(jí)種子園（唐國(guó)強(qiáng)，2015）。從20世紀(jì)70年代開(kāi)始大面積推廣濕地松以來(lái)，從海南島屯昌縣（110°26′ E、19°22′ N，年平均溫度23.16 ℃）到山東半島的青島（120°25′ E、36°09′ N，年均溫11.9 ℃），再到煙臺(tái)（122° E、37°25′ N，年均溫12 ℃），西至云南均有濕地松分布（潘志剛和游應(yīng)天，1994）。目前濕地松在我國(guó)的人工林種植面積已超過(guò)300萬(wàn)公頃，成為了人工喬木林十大主要優(yōu)勢(shì)樹(shù)種之一（張帥楠，2017）。

雄性不育（male sterility， MS）在高等植物中普遍存在，是指植物體不能產(chǎn)生正常有功能的花粉、花藥或雄配子的遺傳現(xiàn)象（范彥君等，2016）?！爸参镄坌圆挥钡母拍钭钤缭?876年由Coleman提出，迄今為止己在43個(gè)科、162個(gè)屬、320個(gè)種中發(fā)現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象（Kaul， 1988; Wise & Pring， 2002）。當(dāng)前雄性不育的研究主要以經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物為主，研究也較為全面和深入，而林木由于育種時(shí)間長(zhǎng)、不育材料發(fā)現(xiàn)少、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)以及后期生長(zhǎng)觀測(cè)較難等原因，致使其研究較為復(fù)雜和困難，可查及的文獻(xiàn)相對(duì)較少，研究深度也較淺，而松科類(lèi)等裸子植物的雄性不育研究報(bào)道更為少見(jiàn)。‘松泰來(lái)源于美國(guó)佛羅里達(dá)州濕地松種源，于20世紀(jì)80年代，全國(guó)國(guó)外松協(xié)作組開(kāi)展了濕地松引種種源試驗(yàn)，利用廣西點(diǎn)種源試驗(yàn)的結(jié)果，1992年—1993年在南寧市林科所營(yíng)建濕地松改良1代無(wú)性系種子園。團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)連續(xù)5年以上的物候觀測(cè)，‘松泰均無(wú)花粉散出，表現(xiàn)出雄性敗育特征（唐國(guó)強(qiáng)，2015）。本次研究采用南寧市林科所濕地松改良1代種子園內(nèi)‘松泰s10敗育系和可育系s9為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)其小孢子葉球的形態(tài)發(fā)育過(guò)程、小孢子及其囊壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察，跟蹤和了解‘松泰小孢子葉球的敗育過(guò)程、敗育方式及敗育時(shí)間等，以期為濕地松雄性不育的敗育機(jī)制及今后濕地松敗育相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。同時(shí)，豐富林木雄性不育材料的不育機(jī)制理論，對(duì)松樹(shù)雜交育種及其雜種優(yōu)勢(shì)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料均采自廣西南寧市林業(yè)科學(xué)研究所濕地松改良1代25年生種子園內(nèi)‘松泰s10敗育系和s9可育系植株。種子園位于108°00′ E、23°10′ N，屬南亞熱帶南緣季風(fēng)氣候區(qū)，年均氣溫21.5 ℃，年均降雨量1 246 mm，年均蒸發(fā)量1 613.8 mm，全年無(wú)霜期358 d，干濕季節(jié)變化明顯，平均相對(duì)濕度約79%，林地建在石灰?guī)r峰林峰叢間寬闊的緩丘臺(tái)地帶，海拔高約120 m，土壤為赤紅壤，pH為5.5～6.5，土層深厚。

1.2 研究方法

在濕地松種子園內(nèi)分別確定3株‘松泰s10敗育系和s9可育系作為取樣植株，于2018年12月13日（小孢子葉球開(kāi)始大量出現(xiàn)）開(kāi)始取樣，直到敗育系小孢子葉球脫落（2月13號(hào)）和正常系小孢子葉球散粉完畢時(shí)（2月中旬）停止取樣。2019年1月23號(hào)前，間隔6～7 d采一次;1月23號(hào)到2月7號(hào)，間隔3～4 d采一次;取樣量每株樹(shù)不少于15個(gè)小孢子葉球，并用FAA固定液固定于50 mL離心管內(nèi)，貼上標(biāo)簽保存于4 ℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2.1 小孢子葉球形態(tài)觀測(cè) 按照取樣時(shí)間的不同選擇具有代表性的小孢子葉球，觀察記錄其外部形態(tài)發(fā)育變化;每次采樣隨機(jī)選擇30個(gè)小孢子葉球測(cè)量其長(zhǎng)度與寬度，并記錄分析其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。

1.2.2 小孢子及囊壁組織發(fā)育觀測(cè) 采用常規(guī)石蠟制片方法，通過(guò)愛(ài)氏蘇木精整體染色、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、封片等步驟（葉寶興等，2011），對(duì)小孢子葉進(jìn)行橫切（切片厚度為5 μm），中性樹(shù)膠封片，選取最具有代表性且清晰的樣片，利用電動(dòng)光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：Axio Imagr Z2m）觀測(cè)不同時(shí)期小孢子內(nèi)部形態(tài)的發(fā)育變化并做好相關(guān)記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1‘松泰s10敗育系與s9可育系小孢子葉球生長(zhǎng)期發(fā)育的動(dòng)態(tài)變化

通過(guò)兩個(gè)月連續(xù)采樣，‘松泰s10與s9小孢子葉球生長(zhǎng)發(fā)育變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。由圖1可知，1月中旬前，敗育系和可育系小孢子葉球個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育較慢，s10與s9小孢子葉球的孢子長(zhǎng)和寬并無(wú)明顯差異，表明二者在生長(zhǎng)速率上差異不明顯，生長(zhǎng)趨勢(shì)基本相同;1月下旬，小孢子葉球進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，小孢子葉球莖長(zhǎng)開(kāi)始急速增長(zhǎng)，s10與s9小孢子葉球的莖長(zhǎng)生長(zhǎng)量也開(kāi)始出現(xiàn)差異，且隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，差異越來(lái)越明顯，猜測(cè)s10小孢子葉球中的小孢子在1月下旬時(shí)敗育已經(jīng)發(fā)生，其敗育開(kāi)始時(shí)間點(diǎn)在1月下旬前，這在形態(tài)觀察及后期的切片觀察實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。2月份后，s9小孢子葉球生長(zhǎng)放慢，s10小孢子葉球在2月初即停止生長(zhǎng)發(fā)育，小孢子葉球干枯萎縮，體型縮小，s10與s9小孢子的莖長(zhǎng)差異急劇加大，直至2月中旬小孢子葉球脫落時(shí)二者的莖長(zhǎng)生長(zhǎng)量差達(dá)到最大值;而s10與s9小孢子葉球的寬長(zhǎng)從小孢子葉球的開(kāi)始生長(zhǎng)直到脫落均無(wú)顯著差異。

2.2 ‘松泰s10敗育系與s9可育系小孢子葉球形態(tài)發(fā)育比較

通過(guò)對(duì)‘松泰s10敗育系與s9可育系小孢子葉球形態(tài)發(fā)育觀察發(fā)現(xiàn)，‘松泰s10敗育系在1月中旬時(shí)，小孢子葉球頂端開(kāi)始出現(xiàn)干癟枯散的異?，F(xiàn)象，在1月底表現(xiàn)最為明顯，且無(wú)花粉散出，而同時(shí)期s9小孢子葉球發(fā)育正常，故推測(cè)s10小孢子葉球敗育時(shí)間開(kāi)始于1月中旬，即頂端出現(xiàn)干癟枯散現(xiàn)象時(shí)，具體不同時(shí)間階段比較分析如下。12月中旬：小孢子葉球聚集成簇腋生，被鱗片包裹著，鱗片黃褐色，呈卵型（圖2： a， s9），與s9形態(tài)發(fā)育相同，無(wú)異常發(fā)育（圖2： A， s10）。12月底：頂端露出鱗片，小孢子葉呈紫黑色（圖2： b， s9）。次年1月初：緩慢發(fā)育，呈圓錐形，小孢子葉呈紫黑色（圖2： C， s9），頂端露出鱗片，小孢子葉呈紫黑色（圖2： B， s10）。1月中旬：緩慢發(fā)育，呈圓錐形，小孢子葉呈紫黑色，并出現(xiàn)排列松散、不飽滿(mǎn)等異常狀態(tài)（圖2： C， s10）。1月底：小孢子葉球快速生長(zhǎng)露出鱗片，小孢子葉成列或交互對(duì)生的排列在小孢子葉球中軸上，緊密飽滿(mǎn)，呈淺紫色（圖2： d， s9），小孢子葉球露出鱗片，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，小孢子葉排列與可育系相同，小孢子葉球頂端，干癟枯散更加明顯，呈淺紫色（圖2： D， s10）。2月初：小孢子葉膨大飽滿(mǎn)，小孢子葉球松軟，呈黃色，開(kāi)始散粉（圖2： e， s9），小孢子葉球整體呈枯散干癟狀，頂端呈紫紅色，底部呈淡黃色，開(kāi)始脫落，但未見(jiàn)花粉散出（圖2： E， s10）。2月中旬：散粉后期，小孢子葉球大量散粉，并開(kāi)始脫落（圖2： f， G， s9），小孢子葉球干癟萎縮，明顯小于可育系，大量脫落且無(wú)花粉散出（圖2： F， G， s10）。

2.3 ‘松泰s10敗育系和s9可育系小孢子葉球橫切觀察

松科植物的花粉（雄性配子體）是在小孢子囊中孕育而來(lái)（林金星，2013），小孢子發(fā)育過(guò)程主要?dú)v經(jīng)初生造孢細(xì)胞（primary sporulation tissue period）、造孢細(xì)胞（sporulation tissue period）、小孢子母細(xì)胞（microsporocyte period）、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂（meiotic phase of microsporocyte）、四分體（microspore tetrad period）、單核（mononuclear period）、二核細(xì)胞（dinuclear period）、散粉期（loose powder period）等時(shí)期（林金星，2013;Sanchez， 2018）。通過(guò)對(duì)小孢子葉球橫切觀察（圖3，圖4）發(fā)現(xiàn)，濕地松小孢子葉球從小孢子造飽細(xì)胞出現(xiàn)直到散粉完成需要60 d左右;與s9可育系小孢子相比，s10敗育系小孢子在四分體時(shí)期發(fā)育異常，部分小孢子明顯萎縮變形，并在后期的發(fā)育中同一小孢子葉球的發(fā)育情況不一致;小孢子囊壁組織也在四分體時(shí)期出現(xiàn)明顯差異，s10敗育系小孢子絨氈層細(xì)胞排列異常、降解緩慢，中層和內(nèi)壁組織在單核小孢子時(shí)期也出現(xiàn)層積，降解緩慢延遲等現(xiàn)象;具體不同發(fā)育時(shí)期的比較分析如下。

初生造孢組織期：小孢子葉球生長(zhǎng)發(fā)育初始階段，小孢子葉還未形成成熟小孢子囊（圖3： a， s9），與s9可育系發(fā)育情況一致（圖4： A， s10）。

造孢組織時(shí)期：每個(gè)小孢子葉孕育兩個(gè)小孢子囊腔，呈同心體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。小孢子囊分層清晰，從內(nèi)到外分別是造胞細(xì)胞、絨氈層、中層、內(nèi)壁和表皮細(xì)胞;造胞細(xì)胞和絨氈層排列緊密分明，細(xì)胞質(zhì)稠密，整個(gè)細(xì)胞著色;中層、內(nèi)壁及表皮細(xì)胞圍繞絨氈層排列整齊，核大染色清晰（圖3： b1， b2， s9），與s9可育系發(fā)育情況一致，形成同心體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞層次清晰（圖4： B， s10）。

小孢子母細(xì)胞時(shí)期：小孢子母細(xì)胞體積增大，呈圓形，核大染色深，核周?chē)幸蝗Σ恢珔^(qū)域（空泡化）;絨氈層細(xì)胞核分裂，出現(xiàn)雙核，體積增大，細(xì)胞質(zhì)稠密，著色深，圍繞小孢子母細(xì)胞排列;中層、內(nèi)壁細(xì)胞拉長(zhǎng)，核著色深;表皮細(xì)胞核開(kāi)始消失（圖3： c， s9），囊腔體積明顯小于同時(shí)期s9可育系，其他細(xì)胞發(fā)育情況與s9一致（圖4： C， s10）。

小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期：每個(gè)小孢子母細(xì)胞散落分布在小孢子囊腔內(nèi)，進(jìn)行著減數(shù)分裂但不同步。絨氈層繼續(xù)緊緊圍繞在小孢子母細(xì)胞外（圖3： d， s9），小孢母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂，小孢子散落分布于囊腔中;絨氈層圍繞在小孢子外，被拉長(zhǎng)。觀察到同一個(gè)小孢子葉球，從頂端往下發(fā)育階段不一致，分別是四分體時(shí)期、減數(shù)分裂中、后時(shí)期、母細(xì)胞減數(shù)分裂間期（圖4： D， s10）。

小孢子四分體時(shí)期：小孢子母細(xì)胞形成四分體，4個(gè)小孢子被胼胝質(zhì)壁包圍，散落分布于小孢子囊腔中;絨氈層繼續(xù)圍繞小孢子四分體，染色變淺;小孢子囊壁細(xì)胞生長(zhǎng)增快，囊腔體積增大明顯，中層和內(nèi)壁細(xì)胞被拉長(zhǎng)降解，表皮細(xì)胞發(fā)生角質(zhì)化加厚（圖3： e1， e2， s9），小孢子母細(xì)胞分裂形成四分體，4個(gè)小孢子被胼胝質(zhì)壁包圍，部分小孢子形態(tài)明顯萎縮變形;絨氈層在此時(shí)期排列不整齊，被拉長(zhǎng)，核染色較深;小孢子壁細(xì)胞生長(zhǎng)較快，囊腔體積增大（圖4： E1， E2， s10）。

單核時(shí)期：胼胝質(zhì)釋放出小孢子，形成單核小孢子，核染色明顯，具有兩個(gè)氣囊;絨氈層染色淺，開(kāi)始降解;中層及內(nèi)壁繼續(xù)降解（圖3： f1， f2， s9），單核時(shí)期同一小孢子葉球中發(fā)育情況不一致。a-c. s9小孢子葉球緩慢發(fā)育期; d-e. s9小孢子葉球急速增長(zhǎng); f. s9散粉期; A， B. s10小孢子葉球緩慢發(fā)育期; C. s10小孢子葉球頂端出現(xiàn)異常; D-F. s10小孢子葉球異常發(fā)育; G. 散粉期對(duì)比。

（1）有形態(tài)不一的單核花粉形成，有氣囊;絨氈層降解明顯，排列紊亂;中層、內(nèi)壁細(xì)胞組織層積，降解延遲，細(xì)胞核染色可見(jiàn)。（2）無(wú)單核花粉形成，囊腔中只有一些形態(tài)怪異干癟萎縮的殘留物，形成空囊（圖4： F1， F2， s10）。

二核時(shí)期：形成二核花粉，氣囊膨大明顯;絨氈層已經(jīng)降解但還具有殘留物;中層降解完，全部液泡化（圖3： g1， g2， s9），同一小孢子葉球中發(fā)育情況不一致。（1）單核小孢子發(fā)生解體，破碎化，發(fā)生敗育，但有少部分形態(tài)異常2核花粉形成，有氣囊;絨氈層已降解，還有部分殘留物;中層及內(nèi)壁細(xì)胞膨大液泡化，開(kāi)始大量降解。（2）小孢子囊腔形成空囊，只見(jiàn)一些殘留物（圖4： G1， G2， s10）。

散粉初期和散粉后期：囊腔內(nèi)擠滿(mǎn)發(fā)育成熟的二核花粉，絨氈層、中層及內(nèi)壁完全消失，表皮層開(kāi)裂，開(kāi)始散粉（圖3： h1， h2， s9），后期完成散粉，只見(jiàn)殘留囊壁（圖3： i， s9），無(wú)正常花粉散出，且同一小孢子葉球中發(fā)育情況不一致。（1）有部分形態(tài)異常成熟花粉形成，氣囊萎縮不飽滿(mǎn);絨氈層，中層及內(nèi)壁細(xì)胞消失，表皮不開(kāi)裂;（2）小孢子囊腔中無(wú)花粉形成，只有一些干癟萎縮的殘留物（圖4： H1， H2， s10）。

2.4 ‘松泰 s10敗育系與s9可育系小孢子葉球及小孢子發(fā)育進(jìn)程比較

結(jié)合小孢子葉球形態(tài)變化和小孢子石蠟切片觀察比較發(fā)現(xiàn)，s10敗育系和s9可育系在小孢子母細(xì)胞減速分裂前并無(wú)明顯差異，小孢子葉球生長(zhǎng)趨勢(shì)也一致;四分體時(shí)期，s10小孢子細(xì)胞發(fā)育異常，小孢子葉球形態(tài)發(fā)育也出現(xiàn)異常，二者異常發(fā)育具有同步性;從四分體到單核小孢子發(fā)育階段，s10敗育系與s9可育系差異最為顯著，s9小孢子葉球在這一階段快速增長(zhǎng)，發(fā)育迅速，直至散粉，s10小孢子葉球則增長(zhǎng)緩慢，發(fā)育延遲，出現(xiàn)干癟萎縮現(xiàn)象，直至脫落;因此，推測(cè)四分體到單核小孢子發(fā)育階段是s10小孢子敗育發(fā)生的主要時(shí)期。二者具體發(fā)育進(jìn)程比較見(jiàn)表1。DP. 二核花粉; E. 表皮; En. 內(nèi)皮層; Mc. 減數(shù)分裂細(xì)胞; ML. 中層; MMC. 小孢子母細(xì)胞; MM. 單核小孢子; MP. 花粉母細(xì)胞; T. 絨氈層; Tds. 四分體。下同。

3 討論

對(duì)濕地松‘松泰小孢子葉球發(fā)育過(guò)程的研究結(jié)果表明：從1月中旬開(kāi)始，小孢子葉球頂端開(kāi)始出現(xiàn)干癟松散異?，F(xiàn)象，該時(shí)期的一個(gè)小孢子葉球從頂端到底部，小孢子發(fā)育時(shí)期不一致（頂端為四分體、中部為減數(shù)分裂中、后時(shí)期、底部為減數(shù)分裂間期），并在四分體釋放單核小孢子這一時(shí)期出現(xiàn)異常，造成敗育。因此研究認(rèn)為‘松泰小孢子葉球敗育時(shí)期開(kāi)始于四分體時(shí)期，這與Kaul（1988）的研究結(jié)果類(lèi)似， Kaul （1988）對(duì)多種雄性不育類(lèi)型花粉敗育時(shí)期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，花粉敗育在造胞細(xì)胞至二核花粉各時(shí)期均有可能發(fā)生，其中有70%的材料敗育時(shí)期發(fā)生在四分體以后。而在四分體后續(xù)的發(fā)育過(guò)程中，同一個(gè)小孢子葉球中小孢子的發(fā)育分為兩種趨勢(shì)，一種是在小孢子葉球中上部分，胼胝質(zhì)不能釋放單核小孢子，沒(méi)有單核小孢子的形成，直接降解萎縮，與絨氈層一起形成絮狀物，形成空囊，直至小孢子葉球脫落，囊壁表皮不開(kāi)裂;另外一種發(fā)育趨勢(shì)則是在小孢子葉球的中下部分，四分體在胼胝質(zhì)解體后，可以釋放出小孢子，形成異常單核小孢子繼續(xù)發(fā)育。這種同一個(gè)小孢子葉球中存在兩種不同的敗育方式，在杉木中也有發(fā)現(xiàn)（林金星等，2013）。而呂洪飛和余象煜（1999）在對(duì)杉木雄性不育細(xì)胞學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)同一個(gè)小孢子葉球中同時(shí)存在無(wú)小孢子囊型、減數(shù)分裂I期前中層細(xì)胞增生型、減數(shù)分裂I期后中層細(xì)胞增生3種敗育類(lèi)型，該研究認(rèn)為小孢子囊壁的中層、內(nèi)壁出現(xiàn)層積和降解延遲、表皮不開(kāi)裂的異常發(fā)育現(xiàn)象也會(huì)影響小孢子的后續(xù)發(fā)育，造成敗育發(fā)生。

絨氈層是構(gòu)成花藥壁的最內(nèi)層組織結(jié)構(gòu)，圍繞著小孢子分布，在物質(zhì)代謝合成與分泌上都十分活躍，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是物質(zhì)輸送的最后中轉(zhuǎn)站，對(duì)花粉的正常發(fā)育具有關(guān)鍵作用（范彥君等，2016;Tian et al.， 2017）。本次研究結(jié)果顯示，‘松泰小孢子葉球在四分體時(shí)期之前與可育系相比并無(wú)異常，但在四分體時(shí)期，小孢子葉球開(kāi)始出現(xiàn)異常，其胼胝質(zhì)溶解緩慢，絨氈層及中層細(xì)胞降解延遲;可育系從四分體到單核小孢子發(fā)育階段的時(shí)間為5 d左右，而敗育系持續(xù)發(fā)育長(zhǎng)達(dá)20 d左右，持續(xù)時(shí)間為可育系的4倍。在此期間，敗育系的絨氈層與可育系相比發(fā)育緩慢，降解延遲，導(dǎo)致其不能及時(shí)的分泌和轉(zhuǎn)化小孢子發(fā)育所需能量物質(zhì)，造成敗育發(fā)生，這與唐國(guó)強(qiáng)（2015）對(duì)濕地松小孢子葉球敗育研究結(jié)果一致，劉望舒等（2019）在對(duì)楊樹(shù)雄性不育小孢子敗育過(guò)程的研究中也認(rèn)為絨氈層的延遲降解會(huì)導(dǎo)致小孢子發(fā)生敗育;譚智文等（2013）與李六林（2007）分別對(duì)不同梨品種有關(guān)小孢子敗育過(guò)程的研究中也發(fā)現(xiàn)存在絨氈層、中層細(xì)胞的異常發(fā)育現(xiàn)象;這種現(xiàn)象在小麥（趙卜等，2015）、棉花（孔祥軍，2017）等其他植物有關(guān)雄性不育的細(xì)胞學(xué)觀察中，也有發(fā)生。同時(shí)，敗育系胼胝質(zhì)降解緩慢，不釋放或不能及時(shí)的釋放單核小孢子，直接影響到小孢子的正常發(fā)育;而胼胝質(zhì)合成于母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，降解于四分體釋放小孢子時(shí)期，在這過(guò)程中它的合成、積累、抑或降解，任何一個(gè)步驟出現(xiàn)異常，都可能會(huì)造成敗育的發(fā)生（ Down et al.， 2008; Wan et al.， 2011;楊莉芳和刁現(xiàn)民，2013）。

4 結(jié)論

小孢子發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞學(xué)觀察是了解濕地松雄性敗育途徑、方式的重要研究手段，也是濕地松雄性不育家系在雜交育種優(yōu)勢(shì)利用中的研究基礎(chǔ)。本次研究以‘松泰 s10敗育系和s9可育系為材料，通過(guò)對(duì)其小孢子葉球形態(tài)和細(xì)胞發(fā)育動(dòng)態(tài)變化觀察發(fā)現(xiàn)，s10敗育系和s9可育系在小孢子母細(xì)胞減速分裂前無(wú)明顯差異，小孢子葉球生長(zhǎng)趨勢(shì)也一致;但在四分體時(shí)期，‘松泰小孢子細(xì)胞組織發(fā)育異常，同時(shí)在小孢子葉球形態(tài)上也能觀察到干癟枯散現(xiàn)象，表明其外部形態(tài)變化和細(xì)胞異常發(fā)育具有同步性;此外，敗育系從四分體到單核小孢子階段與可育系相比發(fā)育時(shí)間較長(zhǎng)，且在此期間敗育系出現(xiàn)小孢子絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常、降解緩慢，小孢子囊壁組織排列紊亂、降解延遲等現(xiàn)象，最后，s10形成異常二核花粉，且無(wú)花粉散出。因此推論s10小孢子敗育的原因主要為小孢子囊壁細(xì)胞發(fā)育異常，其小孢子葉球形態(tài)異常，相對(duì)應(yīng)的其絨氈層在四分體時(shí)期發(fā)育異常，不能適時(shí)地分泌胼胝質(zhì)酶來(lái)降解圍繞著四分體的胼胝質(zhì)壁，也不能適時(shí)地輸送花粉形成所需能量物質(zhì)，同時(shí)囊壁細(xì)胞出現(xiàn)降解延遲和層積。這一系列的異常變化導(dǎo)致不能形成正常四分體，從而使花粉敗育。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）