基于SRAP標(biāo)記的紫溪山華山松種子園無性系遺傳多樣性分析

劉成 徐劍 羅正平 董云祥 董章宏 瞿紹宏 李顯煌 辛培堯

摘 要： 為明確云南楚雄市紫溪山華山松種子園內(nèi)不同種源無性系間的遺傳背景，該研究收集了園內(nèi)6個(gè)種源的60個(gè)華山松無性系單株針葉，采用改良CTAB法提取其總DNA，并利用SRAP分子標(biāo)記對其進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：（1）從100對引物組合中共篩選出15對具有多態(tài)性的SRAP引物，經(jīng)SRAP-PCR擴(kuò)增后，共獲得出194個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為85.05 %，Nei′s 基因多樣性指數(shù)（H）為0.233 7，Shannons信息指數(shù)（I）為0.341 9，種源間的遺傳分化系數(shù)（GST）為 0. 355 5。（2）華山松6個(gè)種源遺傳多樣性較高，且遺傳變異主要存在于華山松種源內(nèi)，種源地會(huì)澤（HZ）與巍山（WS）種源的遺傳距離最近（D=0.050 1），會(huì)澤（HZ）與宜良（YL）種源的遺傳距離最遠(yuǎn)（D=0.361 8）。（3）聚類分析顯示將6個(gè)華山松種源一共聚為3類：會(huì)澤（HZ）和巍山（WS）種源聚為一類;楚雄（CX）、南華（NH）和宜良（YL）種源聚為一類;騰沖（TC）種源單獨(dú)為一類。綜合上述結(jié)果顯示，紫溪山華山松種子園內(nèi)無性系間的遺傳分化處于較高水平，為華山松雜交育種時(shí)親本的選配及種質(zhì)資源的評價(jià)提供了分子水平的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 華山松， 種子園， 無性系， SRAP， 遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： Q943 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2020）04-0462-09

Abstract： In order to clear genetic background of different provenances Pinus armandii colnes from seed orchard in Zixi Mountain of Chuxiong City， Yunnan Province， the needles of 60 clones were taken from six provenances which was used to extract total DNA by modified CTAB method， and the genetic diversity was analyzed by SRAP molecular markers. The results were as follows： （1） Fifteen pairs of polymorphic SRAP primers were screened from 100 pairs of primer combinations. After SRAP-PCR amplification， a total of 194 loci were obtained， and the percentage of polymorphic loci PPB=85.05%， Nei′s gene diversity index H=0.233 7， Shannons information index I=0.341 9， genetic differentiation coefficient between population GST=0.355 5. （2） The genetic diversity of 6 provenances of P. armandii was high， and the genetic variation was mainly existed within provenances of P. armandii. The genetic distance between the Huize （HZ） provenance and the Weishan （WS） provenance was the closest （D=0.050 1）， that the Huize （HZ） provenance and Yiliang （YL） provenance was the farthest （D =0.361 8）. （3） The cluster analysis showed that six P. armandii provenances there were classified into three categories： Huize （HZ） and Weishan （WS） provenances were in one category; Chuxiong （CX）， Nanhua （NH） and Yiliang （YL） provenances were in the second category; Tengchong （TC） provenance was a separate category. The results indicate that genetic differentiation in P. armandii clones from seed orchard in Zixi Mountain of Chuxiong City has a high level， and it can provide theoretical information and practical guidance for parent selections during the cross breeding and evaluation of germplasm resources of P. armandii as well.

Key words： Pinus armandii， seed orchard， clone， SRAP， genetic diversity

華山松（Pinus armandii）是松科（Pinaceae）松屬（Pinus）單維管束亞屬的植物（陳有民，1990; 袁紅寧和陳文輝，2010），是我國特有的五針?biāo)筛叽髥棠荆瑫r(shí)也是高海拔地區(qū)重要的造林樹種之一（趙楊等，2003;辛培堯等，2010）。20世紀(jì)70年代起，云南和貴州等地相繼對華山松進(jìn)行遺傳改良，各自營建了數(shù)個(gè)優(yōu)良無性系初級(jí)種子園，之后對其進(jìn)行了遺傳測定、優(yōu)良家系選擇及輔助授粉等工作（王秀榮等，2007;翟思萬等，2007）。紫溪山華山松無性系種子園位于楚雄市紫溪山，為國家級(jí)林木良種基地。由于缺乏對園內(nèi)種質(zhì)的不斷改良，該種子園仍然處于建園初期低級(jí)階段，繼而出現(xiàn)病蟲害嚴(yán)重及生產(chǎn)力低下的問題，因此，急需對園內(nèi)種質(zhì)進(jìn)行改良和創(chuàng)新。已有實(shí)踐證實(shí)，雜交育種是迄今為止對植物不良性狀進(jìn)行遺傳改良的最為有效的方法之一。多年來，華山松的雜交育種工作較為滯后，雜交親本的選配多以形態(tài)及種源地為主要參考依據(jù)，不能明確所收集的種質(zhì)資源間遺傳多樣性的豐度及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，從而影響改良的程度及效果。因此，在種子園內(nèi)進(jìn)行華山松雜交育種時(shí)，需有針對性地明確園內(nèi)種質(zhì)的遺傳多樣性程度及各種質(zhì)間的親緣關(guān)系顯得尤為重要。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入及相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)水平的進(jìn)步，華山松遺傳多樣性的檢測方法不斷得到完善。例如：趙楊等（2012）利用ISSR標(biāo)記對貴州平壩華山松無性系種子園內(nèi)的85個(gè)無性系進(jìn)行遺傳多樣性分析后發(fā)現(xiàn)，其遺傳變異主要在種源內(nèi);祝娟（2016）利用SSR分子標(biāo)記對華山松52個(gè)自然分布群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明遺傳變異主要存在于個(gè)體內(nèi)，且其遺傳多樣性水平較高;朱曉丹（2006）利用RAPD分子標(biāo)記對紫溪山華山松種子園內(nèi)的部分無性系進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)果表明各種源之間具有較大的遺傳差異，且遺傳多樣性較豐富。但由于RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）標(biāo)記相對較早，且與新型分子標(biāo)記比較，存在一定的缺陷（阮楨媛等，2016），其研究結(jié)果可能存在一定的局限性。上述相關(guān)研究為華山松的遺傳改良及種質(zhì)資源的分子評價(jià)提供了重要的理論基礎(chǔ)。

在眾多的分子標(biāo)記中，SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism）憑借其多態(tài)性高、操作簡單、易于分離測序，且多數(shù)標(biāo)記在相關(guān)實(shí)驗(yàn)樣本基因組中相對均勻分布的特點(diǎn)（Li et al.， 2001;Tilman et al.， 2006），目前在較多的林木遺傳多樣性分析中得到廣泛應(yīng)用（張冬東，2008;向暉等，2016;陳慧等，2017;孟慧等，2018;張安世等，2018;姜武等，2019）。趙楊等（2012）對貴州平壩華山松種子園無性系進(jìn)行了SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，但未對其遺傳多樣性進(jìn)行具體分析。目前，對華山松遺傳多樣性進(jìn)行SRAP分析的相關(guān)研究，國內(nèi)外鮮見報(bào)道。

針對云南省楚雄市紫溪山華山松種子園的生產(chǎn)現(xiàn)狀，實(shí)驗(yàn)選取6個(gè)種源共60個(gè)華山松優(yōu)良無性系，開展了以雜交育種及種質(zhì)資源評價(jià)為最終目的的華山松SRAP遺傳標(biāo)記分析，研究結(jié)果可為該種子園內(nèi)華山松種質(zhì)資源的評價(jià)以及雜交育種時(shí)親本的選配提供分子水平的理論與實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

材料采集于云南省楚雄市紫溪山華山松種子園內(nèi)60個(gè)無病蟲害的不同無性系新鮮幼嫩針葉，分別按無性系單株編號(hào)后裝入自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于 -80 ℃冰箱，備用。所有材料均來自云南省內(nèi)的6個(gè)種源（表1）。

1.2 總DNA提取

取4～5根松針，采用改良的CTAB法，提取華山松基因組DNA（謝冬梅等，2014）。加入50 μL TE buffer稀釋所提取的DNA至50 ng·μL-1，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并保存于-20 ℃冰箱中。

1.3 SRAP-PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增所用引物序列來自公開發(fā)表的相關(guān)報(bào)道（李正鵬等，2011;蔡元保等，2014）。選擇正向和反向引物各10條，隨機(jī)組合后獲得100對引物（表2）。經(jīng)初篩和復(fù)篩后成功篩選出15對多態(tài)性較好且條帶清晰的SRAP引物（表3）。華山松SRAP-PCR 25 μL反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL、Green Taq Mix12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、正向和反向引物各1 μL。其PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán);94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

吸取6 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2 μL 6×Loading buffer混合后，加入到8%聚丙烯酰氨凝膠孔中進(jìn)行電泳檢測，電壓設(shè)為230 V，電泳時(shí)間為150 min。電泳結(jié)束后進(jìn)行凝膠的固定、染色和顯影，拍照保存檢測結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將擴(kuò)增得到清晰可辨的多態(tài)性條帶， 作為參考帶型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的聚丙烯凝膠電泳圖，同一位點(diǎn)清晰的條帶，記“1”;無帶或者弱帶記“0”，模糊不清的不予計(jì)數(shù)，從而構(gòu)成（0，1）矩陣，調(diào)整格式以符合軟件分析要求。

利用Excel表對60株華山松進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性百分比統(tǒng)計(jì)計(jì)算;通過POPGENE version 1. 32分析軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析[觀測等位基因（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）等參數(shù)];利用NTSYS 2.10軟件對6個(gè)種源的華山松進(jìn)行聚類，形成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 華山松基因組DNA提取結(jié)果

將華山松基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠檢測，部分結(jié)果如圖1所示，DNA條帶清晰且無拖帶和彌散現(xiàn)象，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用15對具有多態(tài)性的引物對6個(gè)種源共60株不同華山松無性系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，共擴(kuò)增出165個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其結(jié)果列于表4。

從表4可以看出，在各種源間，華山松多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為 85.05%;在各種源內(nèi)，各個(gè)種源的PPB為41.24%～81.96%，平均值為59.37%。PPB最低的是宜良（YL）種源，為41.24%;PPB最高的是騰沖（TC）種源，為81.96%。把華山松6個(gè)種源根據(jù)PPB大小進(jìn)行排序：騰沖（TC）>會(huì)澤（HZ）>巍山（WS）>楚雄（CX）>南華（NH）>宜良（YL）。

2.3 遺傳多樣性分析

華山松6個(gè)不同種源的Nei′ s基因多樣性（H）范圍為0.187 3～0.323 4，楚雄（CX）的最低，為0.187 3，騰沖（TC）的最高，為0.323 4。Shannons信息指數(shù)（I）范圍為0.277 0～0.471 6，楚雄（CX）的最低，為0.277 0，騰沖（TC）的最高，為0.471 6。等位基因數(shù)（Na）最高的是騰沖（TC），為1.819 6，最低的是宜良（YL），為1.142 4，有效等位基因數(shù)（Ne）最高的是騰沖（TC），為1.580 9，最低的是宜良（YL），為1.269 1。6個(gè)種源的H和I均表明，各種源的遺傳變異從大到小依次為騰沖（TC）>會(huì)澤（HZ）>巍山（WS）>南華（NH）>宜良（YL）>楚雄（CX）（表5）。

2.4 遺傳分化分析

由Nei′s指數(shù)估算可知，6個(gè)華山松種源的總基因多樣度（Ht）為0.342 0，種源內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.220 4。遺傳分化系數(shù)（GST）為0.355 5，說明在華山松種源間有35.55%的遺傳變異， 而在華山松種源內(nèi)則有64.45%的遺傳分化，體現(xiàn)了華山松種源內(nèi)的遺傳分化遠(yuǎn)大于華山松種源間的遺傳分化。華山松各種源間的基因流（Nm）為0.906 5<1，表明華山松各種源間的基因交流較少。

2.5 遺傳相似度與遺傳距離分析

為了進(jìn)一步分析華山松種源間的遺傳關(guān)系，對華山松種源的遺傳相似度和遺傳距離進(jìn)行分析，其結(jié)果如表6所示。由表6可知，華山松6個(gè)種源的遺傳相似度在0.696 4～0.951 1之間，平均值為0.814 1;遺傳距離在0.050 1～0.361 8之間，平均值為0. 212 3。其中，遺傳距離最大的是宜良（YL）和會(huì)澤（HZ）（D=0.361 8），而它們之間的遺傳相似度相對較?。℅s=0.696 4），說明宜良（YL）和會(huì)澤（HZ）之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn);會(huì)澤（HZ）與巍山（WS）之間的遺傳距離最?。―=0.050 1），它們之間的遺傳相似度最大（Gs =0.951 1），這表明會(huì)澤（HZ）與巍山（WS）的遺傳差異較小，親緣關(guān)系最近。

2.6 群體間遺傳關(guān)系聚類分析

根據(jù)6個(gè)華山松種源遺傳相似度，對華山松種源進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果如圖2所示。以0.87為閾值，華山松6個(gè)種源被分為三個(gè)類群。其中，會(huì)澤（HZ）和巍山（WS）種源分為一類;楚雄（CX）、南華（NH）、宜良（YL）種源被聚為一類;騰沖（TC）種源單獨(dú)聚為一類。

3 討論與結(jié)論

遺傳分化系數(shù)（GST）是衡量種群基因分化程度的重要指標(biāo)，能較好地反映群體的遺傳分化水平。按照GST的大小可分為4種情況：GST在0～0.05之間時(shí)，種群的遺傳分化水平基本不存在;GST在0.05～0.15之間時(shí)，種群遺傳分化水平為中等水平;GST在0.15～0.25之間時(shí)，種群遺傳分化水平較高;GST大于0.25時(shí)，種群遺傳分化水平相當(dāng)高（孫文婷等，2016;蔣謙才等，2018）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，華山松6個(gè)種源的總基因多樣度（Ht）為0.342 0，種源內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.220 4，GST為0.355 5，其遺傳變異達(dá)35.55%，在華山松種源內(nèi)有64.45%的遺傳分化，體現(xiàn)了華山松種源內(nèi)的遺傳分化遠(yuǎn)大于華山松種源間的遺傳分化，說明這6個(gè)種源的遺傳分化處于較高的水平。這和Wheeler & Jech（1992）研究發(fā)現(xiàn)種子園不會(huì)因?yàn)槿后w數(shù)量有限可能導(dǎo)致遺傳多樣性較天然種群低相一致。此外，朱曉丹（2006）曾對楚雄華山松種子園4個(gè)種源不同無性系進(jìn)行RAPD遺傳多樣性分析，其PPB為71.42%，Ne為1.364 9，H為0.140 4，I為0.219 3，說明這4個(gè)種源64個(gè)個(gè)體間的遺傳差異較大，該種子園遺傳多樣性較豐富。本實(shí)驗(yàn)利用與朱曉丹（2006）所研究的同一種子園內(nèi)材料進(jìn)行SRAP遺傳多樣性分析，得到多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為85.05%，Ne為1.386 6，H為0.233 7，I為0.341 9，各項(xiàng)參數(shù)均有顯著提高，且主要遺傳變異也存在于種源內(nèi)。由于RAPD標(biāo)記本身具有重復(fù)性低，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定，特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能有一定的局限性，而SRAP標(biāo)記，多態(tài)性強(qiáng)、標(biāo)記分布均勻且比較穩(wěn)定（周延清，2008）。因此，相比RAPD標(biāo)記可以獲得更加豐富且可靠的遺傳變異信息，同時(shí)，種子園內(nèi)各單株間不同程度的遺傳變異，也有利于在園內(nèi)更加方便地就地進(jìn)行華山松的遺傳改良工作。

在生物自然進(jìn)化中，基因流（gene flow）有助于提高物種種源的遺傳多樣性水平，防止種群分化（Ellstrand et al.， 1993）。Widen & Svensson（1992）統(tǒng)計(jì)了124種植物的基因流（Nm）認(rèn)為，遺傳漂變對種群分化的影響較大。而Wright（1950）認(rèn)為當(dāng)基因流Nm<1時(shí)，遺傳漂變是導(dǎo)致種群之間存在明顯遺傳分化的主要原因。有學(xué)者還指出，如果植物種群的基因流（Nm>0.5）從原來的較高水平，到后來呈現(xiàn)較大下降趨勢，則猜想原因可能是植物生存的環(huán)境斑塊化、傳粉的減少、自然選擇作用的加強(qiáng)等降低了基因流（楊章旗等，2014）。本研究結(jié)果表明，紫溪山華山松種子園內(nèi)無性系Nm= 0.906 5<1，說明供試華山松6個(gè)種群間基因交流水平相對較低，華山松的遺傳變異主要存在于種源內(nèi)，即種源內(nèi)的不同優(yōu)良單株之間的遺傳差異較大。那么，在雜交育種時(shí)，可在種源內(nèi)進(jìn)行親本的選配，這樣不僅有利用于提高其雜交親合性，同時(shí)還可豐富雜種后代的基因型，從而更有利于人工選擇。

在進(jìn)行植物遺傳多樣性分析時(shí)，遺傳距離是一個(gè)用來反映物種和種源間遺傳變異水平及遺傳分化程度的重要指標(biāo)，可為雜種優(yōu)勢提供基本遺傳參數(shù)（睢鑫洲等，2017）。利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對6個(gè)華山松種源共60個(gè)單株樣本進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)：在閾值為0.95時(shí)，可以分成五類，其中，會(huì)澤（HZ）和巍山（WS）種源最先聚為一類，楚雄（CX）、南華（NH）、騰沖（TC）、宜良（YL）4個(gè)種源各自被聚為一類，而在閾值為0.87時(shí)，6個(gè)種源被聚為三類，其中騰沖（TC）單獨(dú)聚為一類;會(huì)澤（HZ）和巍山（WS）種源分為一類;南華（NH）、宜良（YL）和楚雄（CX）三個(gè)種源被聚為一類，說明會(huì)澤（HZ）和巍山（WS）之間的親緣關(guān)系較近。由于種源間的親緣關(guān)系與其分布的地理種源存在相關(guān)性。一般認(rèn)為，地理位置相近的種源其遺傳基礎(chǔ)也較為接近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，曲靖會(huì)澤（HZ）種源與大理巍山（WS）種源就被聚為一類，顯然這種聚類與物種地域性的分布不相符。鄢家俊等（2009）研究老芒麥遺傳多樣性時(shí)也被發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。而對裸果木利用SCoT標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，其種群地理距離與遺傳距離也不存在顯著相關(guān)性（狄林楠，2018）。研究認(rèn)為，植物群體間當(dāng)前的遺傳構(gòu)成不僅與目前的分布地理距離有關(guān)，還可能和該植物的進(jìn)化歷史和各種群受人為干擾程度等各種因素有關(guān)（劉柳，2012;宋春鳳等，2014;狄林楠，2018）。因此，在進(jìn)行植物雜交育種中，以目前兩親本地理位置的遠(yuǎn)近為選配親本的主要標(biāo)準(zhǔn)，顯然存在較大的局限性。在今后的育種工作中，應(yīng)以DNA水平分析的結(jié)果為主要依據(jù)，結(jié)合形態(tài)，地理位置等綜合評判，最后確定較為理想的親本組合。通過雜交，從其子代中進(jìn)行選擇，有望獲得更多的具有優(yōu)異性狀（如抗病蟲害能力的提高、速生性等）的優(yōu)良個(gè)體，再通過無性擴(kuò)繁的手段對其優(yōu)良性狀加以固定，最終獲得良種，繼而在生產(chǎn)上大面積推廣。

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（責(zé)任編輯 何永艷）