鋅離子螯合劑對抗NMDA受體腦炎 致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

李振宏

摘要：目的? 研究鋅離子螯合劑（TPEN）干預(yù)抗抗N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體腦炎誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制，為治療抗NMDA受體腦炎提供新的研究靶點(diǎn)。方法? 選取成年Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為TPEN組、ZnSO4組、對照組和正常組4組，各10只。建立抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)的體外神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型，應(yīng)用臺盼藍(lán)染色、細(xì)胞免疫組織化學(xué)、TUNEL神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測和熒光鋅離子探針技術(shù)檢測鋅離子螯合劑干預(yù)抗NMDA受體腦炎導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制。結(jié)果? 谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨著谷氨酸濃度升高而上升（P<0.05）;在谷氨酸濃度為200﹑300﹑400 μmol/L時(shí)，神經(jīng)元凋亡率隨著濃度上升而下降（P<0.05）。凋亡后24、48、72 h，TPEN組、ZnSO4組及對照組神經(jīng)元凋亡率高于正常組，神經(jīng)元存活率低于正常組，且TPEN組神經(jīng)元凋亡率低于ZnSO4組及對照組，神經(jīng)元存活率高于ZnSO4組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TPEN組、ZnSO4組及對照組Caspase-3陽性率高于正常組，且TPEN組Caspase-3陽性率低于ZnSO4組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TPEN組鋅離子陽性細(xì)胞數(shù)低于對照組及ZnSO4組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? TPEN干預(yù)神經(jīng)元損傷的機(jī)制可能是通過抑制鋅離子流向細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)Caspase-3表達(dá)減少，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：鋅離子螯合劑;抗NMDA受體腦炎;神經(jīng)元

中圖分類號：R741? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.08.029

文章編號：1006-1959（2020）08-0092-04

Abstract：Objective? To study the effect and mechanism of zinc ion chelating agent （TPEN） on anti-N-methyl-D-aspartic acid （NMDA） receptor encephalitis-induced neuronal damage， for the treatment of anti-NMDA receptor encephalitis Provide new research targets.Methods? 40 adult Wistar rats were selected and randomly divided into 4 groups of TPEN group， ZnSO4 group， control group and normal group， 10 rats each. Establish anti-NMDA receptor encephalitis-induced neuronal cell damage model in vitro， using trypan blue staining， cellular immunohistochemistry， TUNEL neuronal cell apoptosis detection and fluorescent zinc ion probe technology to detect zinc ion chelating agents to interfere with anti-NMDA The mechanism of body encephalitis causing neuron damage.Results? When the glutamate concentration is 100， 200 μmol/L， the apoptosis rate increases with the glutamate concentration （P<0.05）; when the glutamate concentration is 200， 300， 400 μmol / L， the nerve rate of meta-apoptosis decreased with increasing concentration （P<0.05）. At 24， 48， and 72 h after apoptosis， the neuronal apoptosis rate in the TPEN group， ZnSO4 group， and control group was higher than that in the normal group， the neuron survival rate was lower than that in the normal group， and the neuron apoptosis rate in the TPEN group was lower than that in the ZnSO4 group and in the control group， the neuron survival rate was higher than that in the ZnSO4 group and the control group， the difference was statistically significant（P<0.05）; The positive rate of Caspase-3 in TPEN group， ZnSO4 group and control group was higher than that in normal group， and the positive rate of Caspase-3 in TPEN group was lower than that in ZnSO4 group and control group， the difference was statistically significant（P<0.05）; zinc ion positive in TPEN group The number of cells was lower than that in the control group and the ZnSO4 group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion? The mechanism by which TPEN interferes with neuronal damage may be by inhibiting the flow of zinc ions into the cell， promoting the decrease of Caspase-3 expression， and thus reducing the occurrence of apoptosis.

Key words：Zinc ion chelator;Anti-NMDA receptor encephalitis;Neurons

抗N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體腦炎是一種神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病，若治療不及時(shí)，會嚴(yán)重地威脅患者生命安全[1]。鋅是一種對維持神經(jīng)細(xì)胞正常功能必需的微量元素，生理濃度的鋅可維持神經(jīng)細(xì)胞的正常功能，但鋅離子在細(xì)胞內(nèi)濃度過高，則會對神經(jīng)細(xì)胞造成損害[2]。有研究表明[3]，鋅離子螯合劑（tetrakis pyridylmethyl ethylenedia，TPEN）可以與游離鋅離子形成復(fù)合物，并且減少神經(jīng)元細(xì)胞對鋅離子的攝取，減輕海馬神經(jīng)元的缺血性損傷。本研究通過建立體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，觀察TPEN干預(yù)神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制，以期為抗NMDA受體腦炎提供新的研究靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物? 清潔級成年Wistar大鼠40只，2～3月齡，體質(zhì)量200～250 g，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SYXK（贛）2015-0001。選擇Wistar大鼠培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，隨機(jī)分為TPEN組、ZnSO4組、對照組和正常組4組，各10只大鼠;同時(shí)，每組設(shè)立24﹑48和72 h共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)15個(gè)標(biāo)本。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)? 選擇Wistar大鼠，酒精消毒后，仔細(xì)分離出大腦海馬，剪碎后，胰蛋白酶濃液消化成小塊，胎牛血清終止反應(yīng)后，調(diào)節(jié)細(xì)胞液濃度為1×105/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)10天后，再進(jìn)行神經(jīng)元鑒定。

1.2.2神經(jīng)細(xì)胞損傷模型? 細(xì)胞培養(yǎng)第10天，將細(xì)胞分為對照組及不同濃度谷氨酸組，谷氨酸濃度分別為100、200、300、400 μmol/L。對照組加入緩沖液處理，谷氨酸作用于神經(jīng)元15 min后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行神經(jīng)元臺盼藍(lán)染色和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測。

1.2.3細(xì)胞存活率檢測? 采用臺盼藍(lán)染色神經(jīng)細(xì)胞后，死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色，存活細(xì)胞不著色。隨機(jī)計(jì)數(shù)15個(gè)細(xì)胞視野，計(jì)數(shù)染成藍(lán)色的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)及不著色的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞存活率（%）=（存活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.4細(xì)胞凋亡率檢測? 采用TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞被染成深棕色，存活細(xì)胞不著色。隨機(jī)計(jì)數(shù)15個(gè)細(xì)胞視野，計(jì)數(shù)染成深棕色的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)及不著色的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.5 Caspase-3基因檢測? 采用細(xì)胞免疫組化法，Caspase-3陽性細(xì)胞被染成棕色，隨機(jī)計(jì)數(shù)15個(gè)視野，計(jì)數(shù)棕色細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，Caspase-3陽性率（%）=（棕色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.6 TPEN干預(yù)神經(jīng)元損傷? 把神經(jīng)細(xì)胞分為ZnSO4組﹑TPEN組、對照組和正常組4組，每組分24﹑48和72 h時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)15個(gè)標(biāo)本。在加入谷氨酸誘導(dǎo)前1 d，分別加入ZnSO4（50 μmol/L）和TPEN（2.5 μmol/L），對照組中加入相同劑量緩沖液，正常組不加入任何液體。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第10天，將100 μmol/L谷氨酸加入ZnSO4組﹑TPEN組和對照組細(xì)胞中，15 min后換回正常神經(jīng)元培養(yǎng)液，正常組細(xì)胞不加入任何液體。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至24﹑48和72 h進(jìn)行神經(jīng)元存活率、凋亡率和Caspase-3基因檢測。

1.2.7細(xì)胞內(nèi)鋅離子含量的檢測? 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第10天，ZnSO4組﹑TPEN組和對照組中加入100 μmol/L谷氨酸，15 min后換回正常細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至24﹑48和72 h，進(jìn)行鋅離子含量細(xì)胞檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定? 神經(jīng)元接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，24 h后可見大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，少數(shù)細(xì)胞可見神經(jīng)軸突長出;48 h后大多數(shù)細(xì)胞有軸突生長;72 h后神經(jīng)元胞體變大;細(xì)胞培養(yǎng)至第8天，神經(jīng)元軸突相互連接成網(wǎng)狀;培養(yǎng)第10天，進(jìn)行神經(jīng)元微管相關(guān)蛋-2（MAP2）免疫熒光鑒定，熒光顯微鏡下可見紅色的MAP2陽性神經(jīng)元胞體及其突起，其中胞體較大，突起細(xì)長，見圖1。

2.2體外神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型? 采用臺盼藍(lán)染色神經(jīng)細(xì)胞后，24 h后可見腫脹神經(jīng)元細(xì)胞裂解，隨著谷氨酸濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸下降，見圖2。采用TUNEL試劑盒檢測，24 h后可見凋亡的神經(jīng)細(xì)胞體積變小，神經(jīng)元胞核固縮，在谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨著谷氨酸濃度升高而上升;在谷氨酸濃度為200﹑300﹑400 μmol/L時(shí)，神經(jīng)元凋亡率隨著濃度上升而下降，見表1。

2.3 TPEN干預(yù)神經(jīng)元損傷作用

2.3.1神經(jīng)細(xì)胞凋亡率? 神經(jīng)細(xì)胞凋亡后，采用TUNE試劑盒進(jìn)行檢測，可見凋亡的神經(jīng)元胞核呈棕色，神經(jīng)元體積變小，胞核固縮，見圖3。凋亡后24、48、72 h，TPEN組、ZnSO4組及對照組神經(jīng)元凋亡率高于正常組，且TPEN組神經(jīng)元凋亡率低于ZnSO4組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3.2細(xì)胞存活率? 谷氨酸誘導(dǎo)凋亡后，可見神經(jīng)元細(xì)胞腫脹裂解，突起消失，見圖4;采用臺盼藍(lán)染色神經(jīng)細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率，凋亡后24、48、72 h，TPEN組、ZnSO4組及對照組神經(jīng)元存活率低于正常組，且TPEN組神經(jīng)元存活率高于ZnSO4組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.3.3 Caspase-3基因表達(dá)? 采用細(xì)胞免疫組化技術(shù)，Caspase-3陽性細(xì)胞被染成棕色，突起消失，見圖5;凋亡后24、48、72 h，TPEN組、ZnSO4組及對照組Caspase-3陽性率高于正常組，且TPEN組Caspase-3陽性率低于ZnSO4組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

2.3.4細(xì)胞內(nèi)鋅離子含量的檢測? 谷氨酸誘導(dǎo)凋亡后，采用鋅離子熒光探針技術(shù)，熒光顯微鏡下可見綠色的鋅離子陽性細(xì)胞，見圖6;隨機(jī)計(jì)數(shù)鋅離子陽性細(xì)胞，結(jié)果顯示培養(yǎng)后24、48、72 h，TPEN組鋅離子陽性細(xì)胞數(shù)低于對照組及ZnSO4組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表5。

3討論

NMDA受體腦炎是一種主要累及大腦邊緣系統(tǒng)的免疫性腦炎，可以急性或亞急性起病。NMDA受體是谷氨酸通道受體，當(dāng)通道異常失活可導(dǎo)致癲癇發(fā)作及記憶力下降等癥狀[4]。Jun JS等[5]研究表明，在反復(fù)驚厥發(fā)作的大鼠神經(jīng)細(xì)胞中存在鋅離子相關(guān)基因表達(dá)，其中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnT-1、ZnT-2表達(dá)量減少，而鋅離子流入蛋白Zip-6、Zip-7表達(dá)量增加，提示在驚厥過程中存在鋅離子向細(xì)胞內(nèi)的流動。當(dāng)鋅離子流向細(xì)胞內(nèi)則會損傷神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[6]。有研究表明[7]，使用TPEN可以減輕腦卒中后的海馬神經(jīng)元損傷。Pruss H等[8]研究表明，在全腦缺血大鼠模型注射鋅離子螯合劑后神經(jīng)元凋亡率明顯降低。TPEN（金屬離子螯合物）含有可作為電子供體的吡啶基團(tuán)，是一種膜滲透性特異性鋅螯合劑，可以不受限制地通過神經(jīng)細(xì)胞膜，可以用來螫合神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鋅離子，從而抑制鋅離子向細(xì)胞內(nèi)的流動。

本研究在谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡前，將鋅螯合劑TPEN加入到培養(yǎng)好的神經(jīng)元中，觀察TPEN對神經(jīng)元的保護(hù)作用，鋅離子熒光探針結(jié)果顯示，呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞為鋅離子陽性細(xì)胞，凋亡后24、48、72 h，TPEN組鋅離子陽性細(xì)胞率低于ZnSO4組及對照組（P<0.05），提示TPEN可以螯合神經(jīng)元內(nèi)的游離鋅離子，抑制鋅離子流向細(xì)胞內(nèi)，從而降低細(xì)胞內(nèi)的鋅離子濃度;TPEN組凋亡基因Caspase-3陽性率低于ZnSO4組及對照組（P<0.05），提示TPEN可抑制Caspase-3的表達(dá);TUNE凋亡檢測顯示，TPEN組神經(jīng)元凋亡率低于ZnSO4組及對照組（P<0.05），提示TPEN可能通過抑制Caspase-3的表達(dá)，減少神經(jīng)元的凋亡;臺盼藍(lán)染色檢測顯示，TPEN組神經(jīng)元存活率高于ZnSO4組及對照組（P<0.05），提示在神經(jīng)元中加入TPEN后，鋅離子陽性神經(jīng)元數(shù)量及神經(jīng)元凋亡率減少，而神經(jīng)元存活率升高，說明TPEN對神經(jīng)元具有保護(hù)作用，而其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過抑制神經(jīng)元對鋅離子的攝取，減少鋅離子向神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)流動，抑制凋亡基因Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而減輕對神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，鋅離子螯合劑對NMDA受體腦炎導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用，可能是通過抑制鋅離子流向細(xì)胞內(nèi)，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dong Y，Kalueff AV，Song C.N-methyl-d-aspartate receptor-mediated calcium overload and endoplasmic reticulum stress are involved interleukin-induced neuronal apoptosisin rat hippocampus[J].Neuroimmunol，2017，307（15）：7-13.

[2]Sayin U，Hutchinson E，Meyerand ME.Age-dependent long-term structural and functional effects of early-life seizures：Evidence for a hippocampal critical period influencing plasticity in adulthood[J].Neuroscience，2015，288（12）：120-134.

[3]Tian T，Ni H，Sun BL.Neurobehavioral deficits in a rat model of recurrent neonatal seizures are prevented by a ketogenic diet and correlate with hippocampal Zinc/Lipid transporter signals[J].Biol Trace Elem Res，2015，167（11）：251-258.

[4]Kumari K，Sahni N，Kumari V.Anti-N-Methyl-D-Aspartate-Receptor Encephalitisin Young Females[J].Anaesthesiol Reanim，2017，45（6）：377-379.

[5]Jun JS，Seo HG，Lee ST.Botulinum toxin treatment for hypersalivation in anti-NMDA receptor encephalitis[J].Ann Clin Transl Neurol，2017，4（11）：830-834.

[6]Li C，Liu C，Lin F.Anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitisassociated with mediastinal teratoma：a rare case report and literature review[J].Thorac Discovery，2017，9（12）：1118-1121.

[7]Phillips GD，Jones GN，Callaghan M.Hemiataxia：A Novel Presentation of Anti-NMDA Receptor Antibody Mediated Encephalitisin an Adolescent[J].Case Report Psychiatry，2017，69（12）：25-28.

[8]Pruss H，F(xiàn)inke C.N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in herpes simplex encephalitis[J].Ann Neurol，2012，72（2）：902-904.

收稿日期：2020-02-24;修回日期：2020-04-01

編輯/成森