建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的研究進(jìn)展

王淑琪 李慧 楊曉強(qiáng) 白云綺 林繄依 高照 孫克寒 聶波

[摘要] 動(dòng)脈粥樣硬化是受累動(dòng)脈從內(nèi)膜開始病變的一種常見血管病，是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要發(fā)病原因，嚴(yán)重危害人類身體健康。建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型對(duì)深入了解動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制、發(fā)生發(fā)展過程、臨床診斷和防治都具有重大意義。通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，本文歸納和總結(jié)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化建模方法，比較各種建模方法的優(yōu)缺點(diǎn)，概述建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的現(xiàn)狀與進(jìn)展，總結(jié)發(fā)現(xiàn)單純高脂飼料喂養(yǎng)很難形成動(dòng)脈粥樣硬化病變，而高脂飼料結(jié)合維生素D只能造成早期病變且造模時(shí)間較長(zhǎng)，但高脂飼料結(jié)合維生素D的同時(shí)，加以手術(shù)機(jī)械損傷作用可形成與人類動(dòng)脈粥樣硬化相似的較成熟的病變斑塊。

[關(guān)鍵詞] 大鼠;動(dòng)脈粥樣硬化;動(dòng)物模型;研究進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R-332 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）04（c）-0045-05

Progress in the establishment of atherosclerosis models in rats

WANG Shuqi1，2 ? LI Hui1，2 ? YANG Xiaoqiang3 ? BAI Yunqi2 ? LIN Yiyi2 ? GAO Zhao2 ? SUN Kehan1 ? NIE Bo1，2▲

1.School of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing ? 100029， China; 2.Key Laboratory of Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine of Ministry of Education， Beijing Key Laboratory， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing ? 100700， China; 3.Department of Stomatology ， Army Equipment Department Clinic， Beijing ? 100012， China

[Abstract] Atherosclerosis is a common vascular disease that affects the arteries from the intima， and it is the main cause of coronary heart disease， cerebral infarction and peripheral vascular disease. The establishment of an animal model of atherosclerosis is of great significance in understanding the pathogenesis， development， clinical diagnosis and prevention of atherosclerosis. By referring to relevant literatures at home and abroad， this paper summarizes the modeling methods of atherosclerosis in rats， compares the advantages and disadvantages of various modeling methods， and summarizes the current situation and progress of establishing animal models of atherosclerosis. Through the review of related literature at home and abroad， this article induces and summarizes the modeling method of atherosclerosis in rats， and compares the advantages and disadvantages of various modeling methods， an overview of the current situation and progress of establishing animal models of atherosclerosis， and concludes that the simple high-fat feed is difficult to form the atherosclerosis lesions， and high-fat feed combined with vitamin D can cause early pathological changes and the build mode for a long time， but the high fat feedstuff combined with vitamin D at the same time， the mechanical damage to surgery can form and human similar mature lesions of atherosclerosis plaques.

[Key words] Rat; Atherosclerosis; Animal models; Research progress

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為一種慢性炎癥性疾病，是由多種因素共同作用引起的，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1]。構(gòu)建AS動(dòng)物模型對(duì)于探究AS的病因、發(fā)病機(jī)制、防治和藥物研發(fā)具有重要意義[2]。目前有關(guān)AS的發(fā)病機(jī)制的假說有：脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說、鈣超載學(xué)說、內(nèi)膜損傷學(xué)說、免疫反應(yīng)學(xué)說等。雖然這些假說都從某一方面解釋了AS的發(fā)病機(jī)制，但這些假說并不能全面的闡述AS的發(fā)生、發(fā)展過程與機(jī)理。在AS的發(fā)展過程中，大量脂質(zhì)在血管中積累，鈣質(zhì)也在血管沉積從而導(dǎo)致血管鈣化、血管內(nèi)皮損傷，此變化加劇了脂質(zhì)的侵入和損傷，同時(shí)又有炎性因子引起的免疫反應(yīng)，多種因素共同作用導(dǎo)致AS[3]。因此，為了深入探究AS的發(fā)病機(jī)制，構(gòu)建一個(gè)合適的AS動(dòng)物模型是非常重要的。

動(dòng)物模型對(duì)于假設(shè)驗(yàn)證和臨床實(shí)驗(yàn)研究是必不可少的，但也存在發(fā)病機(jī)制不同、病理進(jìn)程難以控制、操作受限等缺點(diǎn)[4]。目前，AS未有完美的動(dòng)物模型，常用于研究該疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有：豬、猴、家兔、鵪鶉、大鼠和小鼠等。鼠類因其體型小、生存能力強(qiáng)、繁殖迅速、獲取容易等優(yōu)勢(shì)一直被作為臨床試驗(yàn)中應(yīng)用范圍最廣、應(yīng)用數(shù)量最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其是ApoE-/-等轉(zhuǎn)基因小鼠被廣泛用于復(fù)制AS模型，其優(yōu)點(diǎn)為能自發(fā)AS，普食喂養(yǎng)便可形成嚴(yán)重的高脂血癥，高脂飲食喂養(yǎng)可加速斑塊的形成，且其斑塊的分布與人類AS的分布極為相似，但由于體型小、可獲得的血液樣本少等缺點(diǎn)無法進(jìn)行類似多指標(biāo)血液檢測(cè)等的實(shí)驗(yàn)研究。由于大鼠具有應(yīng)用范圍廣泛、體型較大、獲取容易、飼養(yǎng)方便、死亡率低、能夠獲取足夠的血液及其組織標(biāo)本等特點(diǎn)，越來越多研究學(xué)者更傾向于用大鼠來建立AS模型，故本文對(duì)建立大鼠AS模型方法的研究進(jìn)展做一綜述。

1 單純高脂飼料建立AS模型

AS發(fā)病因素多樣，其中膽固醇沉積是發(fā)生AS的初始過程，脂類是AS形成的物質(zhì)基礎(chǔ)前提條件，其能沉積于血管內(nèi)膜，從而形成粥樣斑塊。脂類包括膽固醇及其酯、三酰甘油等物質(zhì)，脂質(zhì)代謝紊亂在AS的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，是導(dǎo)致AS的根本原因。大部分AS模型的建立都是基于大量的脂質(zhì)再結(jié)合其他方法共同構(gòu)建模型，血漿膽固醇水平與AS的產(chǎn)生呈正相關(guān)[5]。因此，建模時(shí)的高脂飼料配方多以高比例的膽固醇、豬油等作為脂質(zhì)來源。高脂飼料配方多由1%～3%膽固醇、8%～10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、81.3%～85.3%普通飼料組成。大量學(xué)者研究表明[6-8]，在高脂飼料中添加抑制甲狀腺功能的丙基硫氧嘧啶可以引起動(dòng)物高脂血癥的形成和早期粥樣硬化病變，且此類藥物可以一定程度地降低膽固醇代謝，盡量多地保存動(dòng)物體內(nèi)的膽固醇含量;添加膽酸鈉可提高脂肪和膽固醇的吸收程度，提高大鼠體內(nèi)膽固醇含量;加入豬油的目的也是為了提高脂肪含量，并且豬油的黏合度較高可使飼料更好成形，幫助大鼠更好的咀嚼，刺激飲食欲;白糖可以一定程度地轉(zhuǎn)化成脂肪積累，還可以改善丙基硫氧嘧啶和膽酸鈉帶來的高脂飼料過苦的味道，增強(qiáng)大鼠食欲。

添加丙基硫氧嘧啶的高脂飼料容易導(dǎo)致大鼠食欲減退、食量減少甚至體重下降等現(xiàn)象，給予丙基硫氧嘧啶的方式有直接添加進(jìn)飼料中、灌胃等，可按不同造模需求進(jìn)行選擇，但劑量的選擇則會(huì)因不同的喂養(yǎng)方式有一定的差別。純高脂飼料喂養(yǎng)法構(gòu)建AS模型的方法優(yōu)點(diǎn)是操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本也比較低廉，但缺點(diǎn)就是動(dòng)物成模率較低，且造模周期也較長(zhǎng)，無法形成穩(wěn)定的AS斑塊[9]。因此大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究更傾向于在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用其他損傷操作，達(dá)到構(gòu)建模型更好更快的目的。

2 高脂飼料聯(lián)合維生素D建立AS模型

由于大鼠無膽囊的生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，造成大鼠對(duì)膽固醇等脂質(zhì)吸收較少，單純的高脂飼料喂養(yǎng)只能造成大鼠體內(nèi)脂質(zhì)沉積，難以造成與人類相似的AS斑塊產(chǎn)生與病變，因此高脂飼料結(jié)合一些可以導(dǎo)致或加速AS形成的藥物共同作用于大鼠，可有效的提高模型復(fù)制效率。大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，人類AS患者的血管壁中含有大量的鈣物質(zhì)，其含量與冠心病的病變程度呈正相關(guān)[10]。維生素D3作為鈣離子誘導(dǎo)劑，可促進(jìn)血鈣吸收，損傷動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮，破壞其完整性，有利于脂質(zhì)侵入并加重血管壁損傷，再結(jié)合鈣鹽沉積，使平滑肌細(xì)胞變性，從而加速動(dòng)脈病變形成斑塊[11]。Yang等[12]采用含1%膽固醇高脂飼料聯(lián)合維生素D3（700 000 U/kg）的制備方法于飼養(yǎng)6周后成功建立穩(wěn)定、可重復(fù)的AS模型。Song等[13]以高脂飼料為誘導(dǎo)聯(lián)合腹腔注射維生素D3注射液，6周后成功復(fù)制AS大鼠模型。AS模型大鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，泡沫細(xì)胞堆積，主動(dòng)脈內(nèi)膜介質(zhì)明顯厚于正常組的主動(dòng)脈內(nèi)膜，與正常組大鼠的AS病變比較，AS模型組病變明顯增加。

通常高脂飼料結(jié)合維生素D3來建立AS模型，但也有不少研究采用維生素D2來代替維生素D3復(fù)制AS模型。董兆旻等[14]利用高脂飲食和1次維生素D2注射成功建立了SD大鼠模型。維生素D3與維生素D2沒有太大的區(qū)別，兩者之間的區(qū)別在于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，維生素D2為麥角骨化醇，維生素D3為膽骨化醇，而對(duì)于體內(nèi)的代謝與作用機(jī)制完全相同，通過肝臟和腎臟的羥化作用，最終代謝產(chǎn)物是一樣的，文獻(xiàn)中均有使用[15]。

使用維生素D配合制備AS模型的方法有多種，常用腹腔注射法、灌胃或直接大劑量添加到飼料中，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求和目的自行選擇。關(guān)于維生素D給藥劑量和給藥時(shí)間經(jīng)查閱文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，各研究者的結(jié)論不盡相同，缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)與規(guī)范。Hu等[16]在制備AS模型開始時(shí)，將每只大鼠腹腔注射維生素D3 700 000 U/kg，分3次給藥，1次/d，以此復(fù)制大鼠AS模型。周紅等[17]在制備大鼠AS模型前每只大鼠腹腔注射600 000 U/kg，造模后第3、6、9周各腹腔注射100 000 U/kg的維生素D3是比較有效的構(gòu)建AS大鼠模型的方法，具有成模率高、死亡率低等優(yōu)點(diǎn)，且發(fā)現(xiàn)用高脂飼料聯(lián)合維生素D3制備AS大鼠模型時(shí)，維生素D3劑量過小，很難造成典型的AS血管病變;而劑量過大更易誘導(dǎo)出AS病變，但會(huì)導(dǎo)致大鼠體重下降明顯，飲食量降低，造成高達(dá)40%的死亡率。

高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合維生素D2/D3復(fù)制模型的實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作比較簡(jiǎn)單，大鼠的整個(gè)AS發(fā)生發(fā)展過程比較穩(wěn)定，這種方法比較好地彌補(bǔ)了AS病變過程中里只有膽固醇沉積而缺少鈣沉積的缺點(diǎn)，是一種比較有效且常見的AS模型復(fù)制方法[18]。此方法發(fā)生的主要病理變化為血管壁鈣質(zhì)沉積，內(nèi)膜損傷，中膜纖維細(xì)胞明顯增生，并形成纖化灶，內(nèi)膜下層有泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)，主要體現(xiàn)出AS早期的病理狀態(tài)，無法快速形成成熟的粥樣斑，但動(dòng)脈鈣質(zhì)沉積且鈣化對(duì)于評(píng)估和預(yù)測(cè)心肌梗死、腦卒中或死亡以及積極預(yù)防和治療心腦血管疾病亦具有重要的臨床意義[19]。

采用此方法制備AS模型時(shí)對(duì)于維生素D的給藥劑量及給藥周期要求比較嚴(yán)格，給藥劑量太高或者過低都不利于模型的成功復(fù)制。劑量過高會(huì)導(dǎo)致大鼠厭食嚴(yán)重、體型消瘦、體重減輕甚至死亡，過低又不易形成AS典型病理狀態(tài)，因此，在造模過程中應(yīng)密切觀察動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲食情況和體重變化，結(jié)合自身的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行復(fù)制模型，但此造模方式耗時(shí)較長(zhǎng)，要保持足夠的耐心。

3 高脂飼料聯(lián)合免疫炎癥建立AS模型

1999年，Ross[20]提出AS是一種炎癥性疾病，炎性細(xì)胞通過吞噬作用清除脂質(zhì)物質(zhì)，同時(shí)形成泡沫細(xì)胞，并形成脂質(zhì)沉積核心，引起AS斑塊的形成[21]。此外，可能與其他炎性因子相互作用促進(jìn)AS的發(fā)生。隨著研究的不斷深入，AS中新的細(xì)胞因子不斷檢出，炎性因子已成為AS病變過程中的重要因素[22]。周麗程等[23]利用大鼠腹腔注射維生素D3和卵清白蛋白致敏，造成大鼠免疫炎癥，高脂飼料喂養(yǎng)14周后大鼠主動(dòng)脈出現(xiàn)AS斑塊。

從免疫學(xué)角度建立AS模型是可行的，遵從AS的形成是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，但此方法尚在起步階段，許多方面不成熟，且此方法難免會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生免疫損傷等不良反應(yīng)。

4 機(jī)械損傷法建立AS模型

雖然以上3種方法在操作性和可行性上都能成功的復(fù)制AS模型，但不足的是實(shí)驗(yàn)周期過長(zhǎng)，為了彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，研究學(xué)者們?cè)诟咧暳衔桂B(yǎng)下聯(lián)合手術(shù)的直接損傷作用于大鼠可加速AS的病變進(jìn)程。主要的手術(shù)應(yīng)用有以下幾種：

4.1 球囊損傷術(shù)

球囊損傷術(shù)是制備血管損傷后再狹窄模型的常見方法，此方法的主要操作是將一定直徑大小的球囊放入動(dòng)脈血管后充盈球囊，通過反復(fù)拖拉充盈后的球囊造成動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成內(nèi)皮細(xì)胞的即刻脫落，彈力板及中膜嚴(yán)重?fù)p傷，引起局部血管狹窄。Yin等[24]以高脂飼料喂養(yǎng)為基礎(chǔ)聯(lián)合腹腔注射維生素D3和球囊損傷手術(shù)于飼養(yǎng)大鼠8周后成功復(fù)制AS模型，手術(shù)組大鼠較假手術(shù)組大鼠有明顯的AS斑塊形成。蔡宏文等[25]將高脂飼料喂養(yǎng)、維生素D3腹腔注射和球囊損傷術(shù)聯(lián)合應(yīng)用建立大鼠AS模型，給予大鼠1次性腹腔注射維生素D3 400 000 U/Kg，高脂喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行球囊手術(shù)，6周后造模成功。

進(jìn)行球囊損傷手術(shù)時(shí)需要注意選擇內(nèi)徑大小適宜的球囊，牽拉過程中速度、力度的把握以及對(duì)球囊擴(kuò)張壓力的控制。球囊擴(kuò)張?zhí)^、來回牽拉太快或操作人員用力過大都會(huì)容易造成動(dòng)脈的破裂，過度損傷;反之?dāng)U張不夠、牽拉過于緩慢又不能造成有效的內(nèi)膜損傷，所以建立成功的AS模型[26]，球囊損傷術(shù)對(duì)操作人員技術(shù)要求比較高。在球囊損傷手術(shù)之后的3～5 d需密切觀察動(dòng)物狀態(tài)，還需腹腔注射青霉素鈉防止術(shù)后感染，造成不必要的死亡與損傷。

4.2 電擊損傷術(shù)

此方法原理為通過一定的電擊刺激可引起血管內(nèi)膜損傷，激活血小板，血小板聚集后會(huì)釋放出一些活性物質(zhì)，這些物質(zhì)則會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使其損傷加重，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可形成明顯的AS斑塊。尚曉玲等[27]利用高脂飼料及頸動(dòng)脈電擊損傷聯(lián)合作用制備AS模型，通過對(duì)影響因素的多次實(shí)驗(yàn)篩查，最終大鼠高脂飲食聯(lián)合腹腔注射維生素D2加頸動(dòng)脈電擊損傷（1 mA、5 min）復(fù)合因素所致的AS模型建立成功。

此手術(shù)方法對(duì)于電流強(qiáng)度與電擊時(shí)間要求比較嚴(yán)格，電流強(qiáng)度過大時(shí)容易造成動(dòng)脈血管壁出現(xiàn)比較明顯的焦灼痕且容易導(dǎo)致動(dòng)脈穿孔，電擊造成的損傷嚴(yán)重破壞動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大鼠死亡率增高，這也是大多數(shù)研究者不常采用此方法的原因之一;電流強(qiáng)度過小時(shí)即使增加電擊時(shí)間也不易引起血管壁損傷，形成AS病變。

4.3 動(dòng)脈鉗夾術(shù)

手術(shù)動(dòng)脈鉗夾法的原理是機(jī)械壓迫阻斷動(dòng)脈正常供血，導(dǎo)致局部血管缺血缺氧，頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，引發(fā)炎性反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生。王慶林等[28]使用血管鉗夾住大鼠一側(cè)頸動(dòng)脈20 min，手術(shù)后以高脂飲食喂養(yǎng)，6周時(shí)大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜便有明顯增厚，大量泡沫細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，10周時(shí)形成典型纖維帽，成功建立大鼠AS模型。

此方法建立AS大鼠模型的優(yōu)點(diǎn)在于能夠人為控制AS的形成或病變部位，比較有利于對(duì)AS的并發(fā)癥腦卒中的研究[29]，但此種造模方法的缺點(diǎn)是對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求較高，且手術(shù)中的不穩(wěn)定因素較多，在大鼠造模中的個(gè)體差異較大，不易形成穩(wěn)定的AS病變和統(tǒng)一的AS模型。

5 結(jié)語

AS是常見的心血管疾病，建立不同階段的人類AS病理變化和發(fā)病過程的理想動(dòng)物模型對(duì)于提高心血管疾病的防治尤為重要。

從AS的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，脂類沉積、血管鈣化、炎癥、免疫機(jī)制或機(jī)械損傷引起內(nèi)膜受損是建立大鼠AS模型的前提，各種構(gòu)建AS動(dòng)物模型的方法在模型形成時(shí)間、動(dòng)脈硬化程度及病變發(fā)展上都有所不同，應(yīng)根據(jù)研究目的來選擇。

從AS的病理變化狀態(tài)出發(fā)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)血脂異常升高時(shí)，升高的脂質(zhì)會(huì)聚集于動(dòng)脈壁，形成肉眼可見的脂質(zhì)條紋，進(jìn)而演化為纖維斑塊，最后生成黃色粥樣斑塊，這是AS典型的病理變化[30]。就以上所述的幾種建模方法而言，純高脂飼料喂養(yǎng)很難導(dǎo)致AS病變，且造模周期較長(zhǎng);高脂飼料結(jié)合維生素D誘導(dǎo)只是導(dǎo)致大鼠形成AS早期的病理狀態(tài)，并沒有形成成熟的與人類病變相似的AS斑塊;大鼠高脂飼料喂養(yǎng)及維生素D損傷的同時(shí)，結(jié)合手術(shù)機(jī)械損傷作用可形成與人類AS相似的較成熟的AS斑塊。隨著研究學(xué)者們對(duì)AS的不斷深入了解與探究，相信一定會(huì)有一種比較完美的規(guī)范的與人類病理狀態(tài)相似的大鼠AS模型。

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（收稿日期：2019-09-09 ?本文編輯：顧家毓）