基于SSR分子標(biāo)記的部分烤煙種質(zhì)資源遺傳多樣性研究

丁永亮 陳仁霄 苑舉民 管成偉 何寬信 張興偉 李卓 張啟明

摘 ?要：為準(zhǔn)確評價部分煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利用42對已發(fā)表多態(tài)性較好的煙草SSR標(biāo)記引物對38份烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行分析，篩選出22對引物在這些種質(zhì)間存在多態(tài)性，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.68個，Neis多樣性指數(shù)平均為0.451，Shannon信息指數(shù)平均達(dá)0.789。UPGMA聚類分析表明，紅花大金元有明顯特異性。遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，參試材料可分為2個類群，類群1和類群2分別包含16份和22份種質(zhì)材料，且類群1變異范圍大于類群2，類群2材料多表現(xiàn)為自然株高在210 cm以下，葉數(shù)20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴(yán)重，青枯病發(fā)病相對較輕。研究結(jié)果為提升SSR分子標(biāo)記篩選效率和部分烤煙種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙草;種質(zhì)資源;SSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性;遺傳結(jié)構(gòu)

Genetic Diversity of Flue-cured Tobacco Germplasm Resources Based on SSR Molecular Markers

DING Yongliang1， CHEN Renxiao1， YUAN Jumin1， GUAN Chengwei1， HE Kuanxin1，

ZHANG Xingwei2， LI Zhuo1， ZHANG Qiming1*

（1. Tobacco Science Institute of Jiangxi Province， Nanchang 330009， China; 2. Institute of Tobacco Research of CAAS， Qingdao 266101， China）

Abstract： In order to accurately evaluate the genetic diversity of introduced tobacco germplasm resources， 38 tobacco germplasm resources were analyzed with 42 SSR primers with good polymorphism. A total of 22 pairs of polymorphic primers were selected based on higher identification ability. The average number of alleles was 3.68. The average diversity index of Nei was 0.451， and the average Shannon information index was 0.789. The UPGMA cluster analysis showed the specificity of Honghuadajinyuan. The genetic structure analysis showed that these 38 accessions were classified into two groups （group 1 and group 2）， which included 16 and 22 accessions， respectively. The range of variation of group 1 was larger than that of group 2. Most accessions in group 2 showed less than 210 cm in plant height， more than 20 in the number of leaves， 10-11 cm in the stem circumference. Furmore，the accessions in group 2 were susceptible to brown spot disease but resistant to bacterial wilt. The results can provide theoretical basis for improving SSR molecular marker screening efficiency and innovative utilization of some flue-cured tobacco germplasm.

Keywords： tobacco; germplasm resources; SSR molecular marker; genetic diversity; genetic structure

煙草是我國重要經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。優(yōu)質(zhì)煙葉是卷煙工業(yè)的重要原料，而品種是彰顯煙葉質(zhì)量特色的關(guān)鍵因素之一，對煙葉品質(zhì)起主導(dǎo)作用[1]。種質(zhì)資源是選育優(yōu)良煙草品種的重要基礎(chǔ)[2]，烤煙遺傳背景狹窄是煙草育種發(fā)展中的突出問題[3-4]。因此，建立遺傳資源豐富的種質(zhì)庫尤為重要。分子標(biāo)記技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于煙草的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，而且在煙草化學(xué)成分、普通農(nóng)藝性狀和抗病性等性狀連鎖基因定位中也取得了一定進(jìn)展[5]。在基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記方法中，SSR（Simple Sequence Repeats）標(biāo)記具有多態(tài)性高、操作簡單、穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，在許多作物的遺傳多樣性研究中廣泛應(yīng)用[6]。對于煙草，BINDLER等[7-8]首次報(bào)道了其SSR標(biāo)記，構(gòu)建了包括2317個SSR標(biāo)記和2363個位點(diǎn)，并覆蓋24個連鎖群的高密度遺傳圖譜，總遺傳長度為3267 cM，標(biāo)記間的平均距離小于1.5 cM。此后，SSR分子標(biāo)記在煙草種質(zhì)間遺傳多樣性研究中大量應(yīng)用。葉蘭欽等[9]利用92對煙草SSR標(biāo)記分析了云南省13個煙草主栽品種的遺傳多樣性，檢測到20對SSR多態(tài)性引物。陳夏曄等[10]從960對引物中篩選出34對SSR多態(tài)性引物，分析73份煙草抗黑脛病種質(zhì)，認(rèn)為其遺傳背景較狹窄。尹國英等[6]從278對引物中篩選出32對多態(tài)性較好的SSR引物并對140份煙草種質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明晾曬煙具有豐富的遺傳多樣性。本研究直接利用前人研究中多態(tài)性較高的SSR分子標(biāo)記，對江西省自存和引進(jìn)的烤煙種質(zhì)資源開展遺傳多樣性分析，旨在為煙草新品種的創(chuàng)育和分子標(biāo)記輔助育種提供理論指導(dǎo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用烤煙種質(zhì)資源共計(jì)38份（表1），其中18份由國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺煙草種質(zhì)資源子平臺提供;4份為江西省內(nèi)自育品系和收集的突變體，其余均從國內(nèi)各省引進(jìn)。

1.2 ?試驗(yàn)地點(diǎn)和方法

1.2.1 ?試驗(yàn)地點(diǎn) ?所有材料于2018年3月10日移栽到江西省煙草科學(xué)研究所樂安試驗(yàn)田內(nèi)，土壤為

砂壤土，無嚴(yán)重病蟲害發(fā)生。土壤肥力狀況：pH值5.3，有機(jī)質(zhì)含量19.1 g/kg，速效氮含量90.3 mg/kg，速效磷含量24.5 mg/kg，速效鉀含量99.5 mg/kg，氯離子含量0.12 mg/kg。

1.2.2 ?農(nóng)藝性狀及病害調(diào)查 ?采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每份材料種植40株，設(shè)3次重復(fù)，行株距1.20 m×

0.50 m，田間管理和調(diào)制按照當(dāng)?shù)亟y(tǒng)一模式進(jìn)行。按照YC/T 142—2010煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法調(diào)查各種質(zhì)單株著生葉數(shù)、自然株高、莖圍和節(jié)距等農(nóng)藝性狀，每個小區(qū)調(diào)查10株。赤星病和青枯病參照GB/T 23222—2008煙草病蟲害分級及調(diào)查方法進(jìn)行調(diào)查，其中赤星病每個小區(qū)調(diào)查50片葉，青枯病調(diào)查全部煙株。

1.2.3 ?煙草DNA提取 ?以每份種質(zhì)嫩葉為材料，利用磁珠法植物DNA提取試劑盒KFR-804496（Thermo Fisher公司）提取總DNA，用超微量分光光度計(jì)NANODROP 2000（Thermo Fisher公司）檢測DNA濃度和純度，將其稀釋至約50 ng/μL，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ?PCR擴(kuò)增與檢測 ?采用已發(fā)表多態(tài)性較好的42對煙草SSR標(biāo)記引物[6，11-15]，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系參照Ex Taq試劑盒（購自TAKARA公司）說明配制。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，PCR擴(kuò)增35個循環(huán)，每循環(huán)94 ℃變性30 s，55 ℃（視引物而變）退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在180 V恒壓下電泳3 h，用銀染法顯影。

1.2.5 ?數(shù)據(jù)處理 ?利用Excel 2013軟件統(tǒng)計(jì)農(nóng)藝性狀和病害病情指數(shù)。對于SSR帶型，在相同遷移率的位置上，有帶記錄為“1”，無帶記錄為“0”。利用Dataformater軟件對0、1矩陣進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，并過濾無多態(tài)位點(diǎn)。利用Popgene軟件計(jì)算基因多樣性和Shannon信息指數(shù)。利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建UPGMA（非加權(quán)組平均法）聚類圖，并利用DCENTER和EIGEN模塊對供試煙草材料進(jìn)行主成分分析（PCA）。利用Structure 2.3軟件對煙草材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，潛在的分組數(shù)值K的范圍設(shè)置在1～10。根據(jù)原始結(jié)果，每一個K值將獨(dú)立運(yùn)行10次再取平均值，其中burn-in period 10 000 步，MCMC重復(fù)100 000，ΔK參考EVANNO等[16]的算法用來決定最佳組群數(shù)量。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?SSR引物多態(tài)性分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過10%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測結(jié)果表明，篩選的42對SSR標(biāo)記中有27對檢測出等位變異。利用Dataformater軟件對0、1矩陣進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，并過濾無多態(tài)位點(diǎn)，篩選出22對具有多態(tài)位點(diǎn)的SSR標(biāo)記（表2）。觀測等位基因數(shù)變幅在2～5之間，平均為3.68個。有效等位基因數(shù)變幅在1.174～2.885之間，平均為1.94個，Shannon信息指數(shù)平均為0.789，Neis多樣性指數(shù)變幅在0.148～0.653之間，平均為0.451，其中PT20213多樣性指數(shù)最高，表明具有較高的鑒別能力（圖1）。

2.2 ?種質(zhì)資源聚類分析

為確定38份種質(zhì)材料在基因組上的遺傳關(guān)系，利用NTSYS軟件按UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建了參試材料的親緣關(guān)系圖。由圖2可知，22對多態(tài)性引物可將36份種質(zhì)材料區(qū)分歸類，聚類結(jié)果與已知種質(zhì)親緣關(guān)系大致相近，美國引進(jìn)種質(zhì)和部分突變體材料遺傳距離較近，國內(nèi)各種質(zhì)間距離較近。利用DCENTER和EIGEN對供試材料進(jìn)行主成分分析（圖3），結(jié)果表明，38份種質(zhì)材料大致可分為2個類群，且兩個類群的離散程度存在較大差異。

2.3 ?群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure軟件對煙草種質(zhì)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析（圖4）得出，群體等位變異頻率特征類型數(shù)K呈逐漸增大的趨勢，通過EVANNO等[16]ΔK值來確定K值。ΔK值在K=2時值最大，表明等位變異頻率特征類型數(shù)K=2時其模型后驗(yàn)概率最大，由此可將38份種質(zhì)材料分為2個類群。煙草38個種質(zhì)材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)如圖5，其中類群1（POP 1）包括G80、K326、Coker86、CV70、CV87、中煙98、中煙102、云煙97、云煙99、云煙110、HY06、粵煙98、FJ109、閩煙9號、紅花大金元、新豐變等16個種質(zhì)材料，類群2（POP2）包括剩余的22份種質(zhì)材料。遺傳結(jié)構(gòu)分析與聚類分析在云煙110、云煙97和Coker86等材料的群體劃分結(jié)果上存在差異，與主成分分析在云煙110、NC2514、豫煙10號等材料的群體劃分結(jié)果上存在差異。

2.4 ?兩個遺傳群體農(nóng)藝性狀與抗病性變異分析

如圖6所示，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析所得兩個群體的農(nóng)藝性狀和田間主要病害發(fā)病情況存在差異。POP1在各農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)范圍內(nèi)均有分布，POP2自然株高均在210 cm以下，99.91%的種質(zhì)材料自然株高不超過185 cm，著生葉片17.6片以上，莖圍在10.1～11.0 cm范圍內(nèi)種質(zhì)數(shù)占比高達(dá)86.36%，節(jié)距集中在3.6～4.9 cm。在赤星病方面，POP1有12.5%的個體發(fā)病指數(shù)在10以內(nèi)，POP2發(fā)病指數(shù)均在10.1以上。在青枯病方面，兩個類群病情指數(shù)主要處于0～5.0之間，POP1和POP2在此范圍內(nèi)的株數(shù)分別占比56.25%和81.82%，其中POP2發(fā)病指數(shù)均在15.0以下。由此可見，POP1的農(nóng)藝性狀變異范圍大于POP2，POP2材料多表現(xiàn)為株高在210 cm以下，葉片數(shù)20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴(yán)重，青枯病發(fā)病相對較輕。

3 ?討 ?論

篩選出多態(tài)性較好的SSR分子標(biāo)記是開展煙草SSR相關(guān)研究的基礎(chǔ)。張銘真等[17]從250對引物中篩選出64對SSR引物，分析了81份煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性，平均等位位點(diǎn)數(shù)為4.2個。馬冰等[18]從2317對引物中篩選出24對核心引物對20份烤煙種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.54個。鞠馥竹等[19]從580對引物中篩選出43對多態(tài)性引物，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.39個。為充分利用前人研究成果，本研究利用42對已發(fā)表的多態(tài)性較好的SSR標(biāo)記引物對38份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選到22對引物在這些種質(zhì)間存在多態(tài)性，檢測到81條多態(tài)性擴(kuò)增條帶，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.68個，與前人研究相當(dāng)，但較大程度減少了標(biāo)記篩選工作量，提升了效率。Neis多樣性指數(shù)平均為0.451，Shannon信息指數(shù)平均達(dá)0.789，說明這些引物總體上有較好的鑒別能力，種質(zhì)材料具有較高的遺傳多樣性。

本研究所用種質(zhì)材料包括國外引進(jìn)種質(zhì)、國內(nèi)地方種質(zhì)和本省自有突變體等，聚類分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)紅花大金元與大部分種質(zhì)材料遺傳距離大，可以考慮將其作為親本材料拓寬遺傳背景，發(fā)掘優(yōu)異性狀。聚類及遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示美國引進(jìn)的種質(zhì)材料遺傳距離近，遺傳背景相似，與MOON等[20]研究結(jié)果相一致。聚類分析未能將參試的38份種質(zhì)材料劃分成明顯的類群，主成分分析初步顯示38份材料可劃分為2個類群，與類群2相比，類群1種質(zhì)間變異和離散程度更大，這與類群遺傳結(jié)構(gòu)分析的類群間農(nóng)藝性狀及抗病性變異分析相一致。但是兩個分類結(jié)果在云煙110、云煙97和Coker86 3個材料的類群劃分上存在差異，造成這種差異的主要原因是兩者分類依據(jù)不同。聚類分析依據(jù)的是烤煙材料間的遺傳距離，反映其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近;而群體遺傳結(jié)構(gòu)分類依據(jù)服從Hardy-Weinberg平衡的群體數(shù)目，基于數(shù)學(xué)模型之上，并計(jì)算各供試材料間相應(yīng)的Q值[21]。因此，本試驗(yàn)利用Structure軟件將供試烤煙材料分為2個類群，具有較高的準(zhǔn)確性。此外，關(guān)聯(lián)分析已廣泛應(yīng)用于大麥[22]、玉米[23]、小麥[24]、水稻[25]、花生[26]等作物的遺傳育種研究，煙草與農(nóng)藝性狀[21]、抗病性[27]、致香物質(zhì)[28]等方面的關(guān)聯(lián)分析也大量出現(xiàn)，本研究可進(jìn)一步在農(nóng)藝性狀、抗病性、化學(xué)成分等方面開展多年重復(fù)試驗(yàn)，尋找與性狀緊密相關(guān)的標(biāo)記，以用于分子標(biāo)記輔助育種研究。

4 ?結(jié) ?論

利用已發(fā)表多態(tài)性較好的42對煙草SSR標(biāo)記引物對38份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行分析，篩選到22對引物在這些種質(zhì)間存在多態(tài)性，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.68個。參試的38份煙草種質(zhì)具有較高的遺傳多樣性，UPGMA聚類分析顯示紅花大金元具有明顯特異性。遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，參試材料可分為2個類群，在農(nóng)藝性狀和抗病性方面，類群1變異范圍大于類群2，類群2材料多表現(xiàn)為株高在210 cm以下，葉數(shù)20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴(yán)重，青枯病發(fā)病相對較輕。本研究結(jié)果為提升SSR分子標(biāo)記篩選效率和部分烤煙種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步與農(nóng)藝性狀、抗病性、化學(xué)成分等方面開展關(guān)聯(lián)分析奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所. 中國煙草栽培學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005.

Institute of Tobacco Research of CAAS. Tobacco cultivation in China[M]. Shanghai： Shanghai Science And Technology Press， 2005.

[2]張艇. 煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究[J]. 農(nóng)技服務(wù)，2010，27（1）：101-103.

ZHANG T. Research on genetic diversity of tobacco germplasm resource[J]. Agricultural Technology Services， 2010， 27（1）： 101-103.

[3]孫計(jì)平，吳照輝，李雪君，等. 21世紀(jì)中國烤煙種植區(qū)域及主栽品種變化分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2016，37（3）：86-92.

SUN J P， WU Z H， LI X J， et al. Analysis of regional variation and major varieties of flue-cured tobacco planted in China in the 21 century[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（3）： 86-92.

[4]陳雅瓊，王衛(wèi)峰，丁安明，等. 基于SSR熒光標(biāo)記分析我國主要審（認(rèn)）定烤煙及白肋煙品種遺傳多樣性[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2013，19（2）：98-105.

CHEN Y Q， WANG W F， DING A M， et al. Analysis of genetic diversity in national listed tobacco varieties using SSR fluorescent marker data[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2013， 19（2）： 98-105.

[5]羅昭標(biāo)，陳歡，毛華，等. 分子標(biāo)記在煙草性狀連鎖基因定位中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊，2014，25（1）：139-142.

LUO Z B， CHEN H， MAO H， et al. Progress of the application of molecular markers in gene mapping of tobacco characters [J]. Letters In Biotechnology， 2014， 25（1）： 139-142.

[6]尹國英，楊小燕，何其波，等. 鑒定煙草種質(zhì)資源SSR核心引物篩選和驗(yàn)證[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（5）：960-965.

YIN G Y， YANG X Y， HE Q B， et al. Screen and identification of SSR core primers for tobacco germplasm[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2013， 14（5）： 960-965.

[7]BINDLER G， VAN DER HOEVEN R， GUNDUZ I， et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2007， 114（2）： 341-349.

[8]BINDLER G， PLIESKE J， BAKAHER N， et al. A high density genetic map of tobacco （Nicotiana tabacum L.） obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2011， 123（2）： 219.

[9]葉蘭欽，辛明明，杜金昆，等. SSR標(biāo)記應(yīng)用于煙草品種遺傳多樣性研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（1）：56-62.

YE L Q， XIN M M， DU J K， et al. Genetic diversity revealed by SSR markers of the tobacco cultivars[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2009， 25（1）： 56-62.

[10]陳夏曄，劉艷華，張興偉，等. 抗黑脛病煙草種質(zhì)的遺傳多樣性分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（7）：58-63

CHEN X Y， LIU Y H， ZHANG X W， et al. Genetic diversity analysis on resistant tobacco germplasm to black shank disease[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2014， 30（7）： 58-63.

[11]賴瑞強(qiáng)，李榮華，夏巖石，等. 煙草種質(zhì)的SSR標(biāo)記遺傳多樣性及青枯病抗性的關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2018，24（6）：67-77.

LAI R Q， LI R H， XIA Y S， et al. SSR marker-based genetic diversity analysis of tobacco germplasm and association analysis with resistance to bacterial wilt[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（6）： 67-77.

[12]張興偉，任民，劉艷華，等. 煙草核心引物的篩選[C]//中國煙草2013年學(xué)術(shù)年會論文集. 北京：中國煙草學(xué)會，2013：109-114.

ZHANG X W， REN M， LIU Y H， et al. Screening of SSR core primers with polymorphism on 12 tobacco accessions[C]//Proceedings of the 2013 China tobacco annual conference. Beijing： China Tobacco Society， 2013： 109-114.

[13]向世鵬，胡日生，周向平，等. 煙草種質(zhì)資源黑脛病抗性鑒定及親緣關(guān)系SSR分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，31（1）：156-161.

XIANG S P， HU R S， ZHOU X P， et al. Identification of resistance to black shank disease of tobacco germplasm resources and analysis of genetic relationship of SSR[J]. Acta Agriculturae Boreali-sinica， 2016， 31（1）： 156-161.

[14]陳芳，徐世曉，李曉輝，等. 基于SSR標(biāo)記的80份煙草種質(zhì)指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J]. 作物雜志，2019（1）：22-31.

CHEN F， XU S X， LI X H， et al. Construction of molecular fingerprinting and analysis of genetic diversity for 80 tobacco （Nicotiana tabacum） germplasms[J]. Crops， 2019（1）： 22-31.

[15]張銘真，邢雪霞，李曉輝，等. 煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2016，37（4）：42-47.

ZHANG M Z， XING X X， LI X H， et al. Analysis of genetic diversity and population structure of germplasm resources in Nicotiana tobacum[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（4）： 42-47.

[16]EVANNO G， REGNAUT S， GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software structure： a simulation study[J]. Molecular Ecology， 2005， 14（8）： 2611-2620.

[17]張銘真，李曉輝，王袁，等. 81份煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29（1）：62-68.

ZHANG M Z， LI X H， WANG Y， et al. Analysis of genetic diversity of 81 tobacco germplasm resources[J]， Acta Agricultural Jiangxi， 2017， 29（1）： 62-68.

[18]馬冰，代帥帥，程亞增，等. 烤煙種質(zhì)資源SSR核心引物的篩選及驗(yàn)證[J]. 中國煙草科學(xué)，2016，37（5）：1-5，9.

MA B， DAI S S， CHENG Y Z， et al. Screen and identification of SSR core primers for flue-cured tobacco germplasm[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（5）： 1-5， 9.

[19]鞠馥竹，趙文濤，劉元德，等. 不同產(chǎn)區(qū)晾曬煙資源多樣性的鑒定與評價[J]. 中國煙草科學(xué)，2019，40（2）：8-15.

JU F Z， ZHAO W T， LIU Y D， et al. Identification and evaluation of the diversity of air/sun-cured tobacco germplasm resources in different producing areas[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（2）： 8-15.

[20]MOON H S， NIFONG J M， NICHOLSON J S， et al. Microsatellite-based analysis of tobacco （Nicotiana tabacum L.） genetic resources[J]. Crop Science， 2009， 49： 2149-2159.

[21]童治軍，陳學(xué)軍，方敦煌，等. 231份烤煙種質(zhì)資源SSR標(biāo)記遺傳多樣性及其與農(nóng)藝性狀和化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2017，23（5）：31-61.

TONG Z J， CHEN X J， FANG D H， et al. SSR marker-based analyses on genetic diversity and relevant variations of agronomic traits and chemical composition of 231 flue-cured tobacco germplasm resource[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2017， 23（5）： 31-61.

[22]IVANDIC V， HACKETT C A， NEVO E， et al. Analysis of simple sequence repeats （SSR） in wild barley from the fertile crescent： associations with ecology， geography and flowering time[J]. Plant Molecular Biology， 2002， 48： 511-527.

[23]FLINT-GARCIA S A， THUILLET A C， YU J， et al. Maize association population： a high-resolution platform for quantitative trait locus dissection[J]. The Plant Journal， 2005， 44（6）： 1054-1064.

[24]ROY J K， BANDOPADHYAY R， RUSTGI S， et al. Association analysis of agronomical important traits using SSR， SAMPL and AFLP markers in bread wheat[J]. Current Science， 2006， 90（5）： 683-689.

[25]AGRAMA H A， EIZENGA G C， YAN W. Association mapping of yield and its components in rice cultivars[J]. Molecular Breeding， 2007， 19（4）： 341-356.

[26]李東霞，石鵬，楊偉波，等. 利用SSR分子標(biāo)記分析海南與國內(nèi)外花生種質(zhì)資源的遺傳多樣性[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，42（20）：118-124.

LI D X， SHI P， YANG W B， et al. Analysis of genetic diversity in peanut（Arachis hypogaea L.）germplasm resources from Hainan and other regions by using SSR markers[J]. Guangdong Agricultural Sciences， 2015， 42（20）： 118-124.

[27]叢鑫，劉艷華，戴培剛，等. 抗PVY煙草種質(zhì)的遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15（3）：679-684.

CONG X， LIU Y H， DAI P G， et al. Genetic diversity analysis of tobacco germplasm resistance to PVY[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2014， 15（3）： 679-684.

[28]任民，張長靜，蔣彩虹，等. 基于高密度SSR連鎖群的煙草致香物質(zhì)關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2014，20（4）：88-93.

REN M， ZHANG C J， JIANG C H， et al. Association analysis of tobacco aroma constituents based on high density SSR linkage group[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（4）： 88-93.

基金項(xiàng)目：江西省煙草公司科技項(xiàng)目“煙草種質(zhì)資源的收集引進(jìn)與種質(zhì)庫建立”（201401001）

作者簡介：丁永亮（1990-），男，農(nóng)藝師，碩士，從事煙草育種及生物技術(shù)研究。E-mail：yld9001@163.com

*通信作者，E-mail：zhangqiming1979@163.com

收稿日期：2019-10-23 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2020-02-14