頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)分析濃香型竹酒中香氣成分

李 濤， 司夢鑫， 李 沖， 朱洪德， 鄧賢彬， 朱天虎

（1.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都610041； 2.四川活之釀釀酒公社有限公司，四川 瀘州646608）

竹為禾本科（Poaceae）竹亞科（Bambusoideae）植物，我國竹類資源極為豐富，有37 屬500 余種，有“竹子王國”的美譽(yù)，竹類植物的面積、蓄積量和年產(chǎn)竹材量均占世界1／3 左右［1］.

四川省擁有豐富的竹類資源，尤其四川省瀘州市是著名的“川南竹鄉(xiāng)”，是我國主要竹產(chǎn)區(qū)之一［2］.竹類植物的藥用歷史悠久，竹莖和竹葉中含有黃酮及其苷類、酚酸類、多糖類、氨基酸和肽類、蒽醌類、萜類和內(nèi)酯類等活性成分［3］，以及以醛、醇為主的芳香成分等，竹葉、竹茹、竹瀝、竹黃和竹筍等均是傳統(tǒng)中藥，具有極高的藥用和保健價值.中國白酒有12 種香型，其中濃香型白酒占全國白酒產(chǎn)量的60% ～70%［4］，四川省瀘州市是濃香型白酒的主要產(chǎn)地之一.濃香型竹酒（活竹酒和原竹酒）是采用四川省瀘州市豐富的竹類植物品種代替糠殼作為釀酒蓬松物發(fā)酵制成，活竹酒還需在生長活竹莖中浸泡活化后，制成的綠色、生態(tài)和健康的新型酒類飲品.

釀酒的原料、曲種和生產(chǎn)工藝等與白酒的風(fēng)味特征、香味成分等方面密切相關(guān)，香氣成分或揮發(fā)性成分反映了酒的整體組成，是評價白酒品質(zhì)的重要指標(biāo).因此，研究不同生產(chǎn)工藝的竹酒香氣成分，對于評價竹酒產(chǎn)品質(zhì)量，提升竹酒品質(zhì)具有重要意義.

目前，揮發(fā)性成分的提取方法主要有蒸餾萃取法、液-液萃取法、靜態(tài)頂空提取法、動態(tài)頂空提取法和超臨界流體萃取法等.但這些方法均存在一定的缺陷，如液-液萃取法需要大量有機(jī)溶劑，耗時且易導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)的損失；靜態(tài)頂空法易產(chǎn)生過多的蒸汽，影響色譜柱的分離效能［5］.而固相微萃取（SPME）技術(shù)具有操作簡單、萃取迅速、無需溶劑、可自動化、功能多樣、設(shè)備低廉、可在線和活體取樣，而且可在分析系統(tǒng)直接脫附的優(yōu)點(diǎn)［6］，已廣泛用于揮發(fā)性和半揮發(fā)性樣品的處理和分析.

目前，對于新型酒類飲品的研究，果酒是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，而對竹酒的研究報道較少，未見對竹酒香氣成分的研究報道.本課題組采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS -SPME-GC-MS）對不同生產(chǎn)工藝釀造而成的2 種濃香型竹酒（活竹酒和原竹酒）的香氣成分進(jìn)行分析，并結(jié)合嗅覺閾值確定不同香氣成分的相對氣味活度值（ROAV），評價揮發(fā)性成分對新型酒類竹酒總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，確定竹酒的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì).

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 GC-MS -QP 2010 Plus型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；萃取纖維頭50／30 μm DVB／CAR／PDMS，二乙烯基苯／羧基／聚二甲基硅氧烷，Restek 低流失氣相色譜毛細(xì)管柱，5%二苯基／95%二甲基聚硅氧烷交聯(lián)，30 m ×0.25 mm ×0.25 μm（美國Supelco 公司）；手動固相微萃取裝置.活竹酒和原竹酒（四川省瀘州市四川活之釀釀酒公社有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 GC-MS條件 氣相色譜（GC）分析條件：5%二苯基／95%二甲基聚硅氧烷交聯(lián)，30 m ×0.25 mm×0.25 μm色譜柱；分流進(jìn)樣，分流比為3；溶劑延遲0.10 min；載氣為高純氦氣（99.999%），流速為1 mL／min；進(jìn)樣口溫度270 ℃；柱溫40 ℃（2 min）.程序升溫：以10 ℃／min速率升溫至80 ℃保留2 min，以5 ℃／min 速率升溫至180 ℃保留5 min，最后以10 ℃／min 速率升溫至280 ℃保留2 min；柱前壓為49.5 kPa，柱流量為1.00 mL／min.

質(zhì)譜（MS）分析條件：離子源溫度200 ℃；接口溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍33 ～500 m／z.

香氣成分的提?。簩? mL 酒液置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中（裝液率為40%），插入老化的50／30 μm DVB／CAR／PDMS 纖維頭，60 ℃頂空中恒溫萃取50 min 后取出，立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度270 ℃）中，熱解析1 min，同時啟動GC -MS儀進(jìn)行分析.

1.2.2 揮發(fā)性成分的分析 利用計算機(jī)對采集到的質(zhì)譜掃描圖譜進(jìn)行檢索，以人工解析進(jìn)行輔助，與NIST08. LIB 譜庫進(jìn)行對照匹配鑒定，并采用峰面積歸一法計算各揮發(fā)性成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.2.3 主體香氣成分分析 定義氣味活度值（OAV）為嗅感物質(zhì)的絕對濃度（C）與其感覺閾值（T）之比，用來反映香氣成分對整體香氣的貢獻(xiàn)大小.但是對一包含復(fù)雜化合物的樣品進(jìn)行逐一絕對定量不僅工作量繁重且成本高，因此，采用相對氣味活度值（ROAV）來衡量某一香氣成分對整體香氣成分的貢獻(xiàn)［7］.ROAV計算公式如下：

Ci%、Ti分別樣品中為某一香氣成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)和嗅覺閾值，Cs%和Ts分別為樣品中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大的組分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)和嗅覺閾值.

2 結(jié)果與分析

2.1 竹酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分分析 活竹酒和原竹酒經(jīng)過頂空固相微萃取結(jié)合GC -MS 分析后得到的活竹酒、原竹酒揮發(fā)性成分的總離子流圖（圖1（a）和圖1（b））.從色譜圖中可見，活竹酒和原竹酒除部分成分的相對峰面積上有差異外，原竹酒在更多的位置出峰，表明原竹酒含有更多的揮發(fā)性成分，其化學(xué)成分分析結(jié)果見表1.從表1 可見，2 種竹酒中共檢測出105 種揮發(fā)性成分，其中酯類56種，醇類9 種，醛類16 種，酮類7 種，烯酸類3 種，烷烴類8 種，其他類6 種.

活竹酒中共檢測出揮發(fā)性成分64 種，其中酯類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.87%（41 種），醇類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.05%（6 種），醛類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 05%（8種），酮類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.36%（3 種），烷烴類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 28%（3 種），其他類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18%（3 種），未檢測出烯酸類.

原竹酒中共檢測出揮發(fā)性成分71 種，其中酯類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.09%（35 種），醇類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.83%（8 種），醛類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.78%（12 種），酮類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.17%（4 種），烯酸類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22%（4 種），烷烴類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.98%（5種），其他類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.09%（3種）.

圖1 活竹酒（a）和原竹酒（b）的HS-SPME-GC-MS揮發(fā)性成分總離子流圖Fig. 1 Total ion flow chromatogram of volatile components in living bamboo wine（a）and raw bamboo wine（b）by HS-SPME-GC-MS

表1 活竹酒和原竹酒揮發(fā)性成分Tab. 1 Volatile components of living bamboo wine and raw bamboo wine

表1（續(xù)）

表1（續(xù)）

表1（續(xù)）

2.1.1 酯類香氣成分分析 對2 種竹酒來說，在所有的揮發(fā)性化學(xué)成分中，酯類物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在80%以上，在2 種酒樣中含量高的共有成分為己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯和庚酸乙酯，這些酯類都具有令人愉快的花、果香氣，構(gòu)成了竹酒的主體香氣特征.酯類中的己酸乙酯是2 種酒樣中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的揮發(fā)性成分（活竹酒為69.19%，原竹酒為55.5%），己酸乙酯具有濃厚的果香、青蘋果香，符合濃香型白酒國家標(biāo)準(zhǔn)中對其香氣的規(guī)定：以己酸乙酯為主體的復(fù)合香氣［8］.

活竹酒和原竹酒的生產(chǎn)工藝并未改變原有白酒的香氣類型，保留了濃香型白酒的特征香氣，但是活竹酒經(jīng)過楠竹灌注生長發(fā)酵后成為了更具有代表性的濃香型竹酒.辛酸乙酯和乙酸乙酯在2 種竹酒中含量相似且較高（辛酸乙酯在活竹酒為4.90%，原竹酒為5.25%；乙酸乙酯在活竹酒中為3.13%，在原竹酒中為2.88%），辛酸乙酯有著令人愉悅的花果香氣、白蘭地酒香，乙酸乙酯有著醚香、帶果香的酒香，這2 種酯類對竹酒的主體香氣和風(fēng)味具有重要影響.丁酸乙酯具有菠蘿香味，丁酸乙酯在2 種竹酒中的含量也較高（活竹酒為4.11%，原竹酒為1.77%），但丁酸乙酯在活竹酒中含量明顯增高.癸酸乙酯具有椰子香型香氣，在活竹酒中的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.72%，在原竹酒中的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.24%，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯差異.

活竹酒為原竹酒的酒液灌注于楠竹竹莖中隨竹子生長而成，竹莖可認(rèn)為是天然的發(fā)酵容器，酒液在竹莖中又經(jīng)過了一次發(fā)酵過程.酯類，尤其是乙酸酯類在發(fā)酵過程中又發(fā)生了氧化、還原、酯化等一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，形成了其他的高級酯或其他更加穩(wěn)定的香味物質(zhì)，使酒液的香氣物質(zhì)更加持久，不易揮發(fā)［9］.

結(jié)果表明，竹莖生長發(fā)酵的過程使活竹酒的酯類物質(zhì)不僅在種類上比原竹酒多，而且其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)（82.87%）也比原竹酒高，是形成2 種竹酒主體香氣特征差異的重要因素.

2.1.2 醇類香氣成分分析 醇類是白酒的主要助香成分，是香與味的過渡橋梁，起到一個協(xié)調(diào)作用.在2 種竹酒醇類物質(zhì)中，除大部分為乙醇外，2 種竹酒中均檢測出正己醇、正丁醇、正辛醇和2 -乙基己醇，這些成分大多具有青草香和花香的特征香氣.

一般稱具有3 個碳以上的醇類化合物為高級醇，包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、正戊醇和異戊醇等，雜醇油為這些高級醇組成的混合體.適量的高級醇給人醇厚、柔和、圓潤協(xié)調(diào)的感覺，而過量的雜醇油則會給酒液帶來苦澀味［10］.結(jié)果表明，原竹酒中的正戊醇（0.57%）、正丁醇（0.15%）等雜醇油的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，會使原竹酒稍帶苦味.而竹莖生長發(fā)酵的過程使活竹酒中雜醇油的含量降低.

2.1.3 醛酮類香氣成分分析 醛酮類揮發(fā)性物質(zhì)大多具有果香、花香等香氣，使酒液的香味更加令人愉悅.2 種竹酒中共有的醛酮類成分較少，醛類共有成分有壬醛、苯甲醛和癸醛，酮類無共有成分.活竹酒中醛類揮發(fā)性物質(zhì)含量最高的為3 -羥基丁醛，酮類為2 -壬酮；原竹酒中醛類揮發(fā)性成分最高的為己醛二乙縮醛，酮類為（Z）-氧代環(huán)十七碳-8 -烯-2 -酮.

除此以外，活竹酒中還含有糠醛（0.16%），糠醛被認(rèn)為是區(qū)分酒的香型的重要物質(zhì)，在醬香型白酒中含量最高，濃香型次之［11］.活竹酒中含有糠醛的原因可能是活竹酒在楠竹竹莖再次經(jīng)過的發(fā)酵過程中醇類氧化所產(chǎn)生的.而以竹類植物代替糠殼，作為蓬松物發(fā)酵生產(chǎn)的原竹酒中不含糠醛.

2.1.4 其他類香氣成分分析 對于酸類揮發(fā)性物質(zhì)，活竹酒中不含酸類物質(zhì)，原竹酒含有相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22%的烯酸類物質(zhì).酸類化合物的揮發(fā)性較小，呈香性相對較差，對香氣的貢獻(xiàn)不如酯類化合物，主要起協(xié)調(diào)口感的作用［9］.

對于烷烴類揮發(fā)性物質(zhì)，活竹酒和原竹酒的共有成分為1，1 -二乙氧基-3 -甲基丁烷，且1，1 -二乙氧基-3 -甲基丁烷也是2 種竹酒中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的烷烴類揮發(fā)性物質(zhì)，尤其在原竹酒中，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.66%（總烷烴含量為2.98%），這可能也是造成2種竹酒香味差別的原因.

2.2 竹酒中關(guān)鍵風(fēng)味成分分析 竹酒中揮發(fā)性成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)并不能全面說明其對整體香氣貢獻(xiàn)的大小，還需要結(jié)合該種揮發(fā)性物質(zhì)的嗅覺閾值進(jìn)行評價，因此，采用ROAV 值分析各揮發(fā)性化學(xué)成分對竹酒總體香氣的貢獻(xiàn)程度.在全部的揮發(fā)性組分中，己酸乙酯的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，嗅覺閾值也相對較小，對竹酒總體香氣的貢獻(xiàn)最大，所以定義己酸乙酯的xRs＝100，計算其他成分的ROAV值，結(jié)果見表2.當(dāng)xR≥1 時，該化學(xué)成分為竹酒的主體風(fēng)味成分；當(dāng)0.1≤xR＜1 時，認(rèn)為該物質(zhì)對竹酒總體風(fēng)味具有重要的修飾作用［15-16］.由表2 可知，2 種竹酒中xR≥0.1 的揮發(fā)性物質(zhì)共有14 種，其大部分化學(xué)成分為酯類，少數(shù)為醛酮類.

表2 活竹酒和原竹酒中揮發(fā)性成分的ROAV值Tab. 2 ROAV values of volatile components in living bamboo wine and raw bamboo wine

活竹酒中xR≥1 的揮發(fā)性成分有4 種，依次為己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和戊酸乙酯，特別是己酸乙酯和辛酸乙酯，xR＞30，因此，這4 種香氣成分構(gòu)成了活竹酒香氣的主要成分，賦予活竹酒濃郁的花果香氣.雖然乙酸乙酯和庚酸乙酯的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，但因其嗅覺閾值很高，使得其ROAV 值很低，說明相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的物質(zhì)對總體香氣的貢獻(xiàn)并不一定大.活竹酒中0.1≤xR＜1 的揮發(fā)性物質(zhì)依次為己酸丁酯、壬醛、2 -壬酮、異戊酸乙酯和己酸己酯，這5 種物質(zhì)對活竹酒有重要的修飾作用，賦予活竹酒花草清香的獨(dú)特香味.

原竹酒中xR≥1 的揮發(fā)性物質(zhì)有5 種，依次為己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸己酯和丁酸乙酯.雖然己酸己酯在原竹酒中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.24%，但因其較低的嗅覺閾值（10 μg／L），具備較高的相對香氣活度值，從而對原竹酒整體香氣有著重要貢獻(xiàn).原竹酒中0.1≤xR＜1 的揮發(fā)性物質(zhì)有7種，依次為己酸異戊酯、己酸丁酯、3 -苯丙酸乙酯、乙酸異戊酯、壬醛、癸酸乙酯和異戊醛，這些物質(zhì)的果香、甜香使得原竹酒的主體香氣更為豐滿濃厚.

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取技術(shù)對不同生產(chǎn)工藝釀造而成的竹酒的香氣成分進(jìn)行提取，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)性成分進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果表明，生產(chǎn)工藝對竹酒的香氣成分種類及其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)有著明顯影響.2 種濃香型竹酒（活竹酒和原竹酒）中共檢測出105 種揮發(fā)性成分，其中活竹酒中共檢測出64 種揮發(fā)性成分，原竹酒中共檢測出71 種揮發(fā)性成分，共有成分30 種.2 種竹酒中酯類物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在80%以上，含量較高的共有成分為己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯和庚酸乙酯，這些酯類都具有令人愉快的花、果香氣，構(gòu)成了竹酒的主體香氣特征.在活竹酒中，酯類成分種類和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)（82.87%）均大于原竹酒，而醛類、烯酸類、烷烴類和其他類成分的種類和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于原竹酒，而且竹莖生長發(fā)酵的過程使活竹酒中雜醇油的含量降低.

根據(jù)不同揮發(fā)性化合物的嗅覺閾值和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算ROAV值，利用ROAV值衡量某種揮發(fā)性物質(zhì)對主體香氣成分的貢獻(xiàn).結(jié)果表明，活竹酒中的己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和戊酸乙酯，特別是己酸乙酯和辛酸乙酯，對活竹酒的主體香氣有著非常重要的貢獻(xiàn)，形成了活竹酒濃郁的水果香和花香的主體香味；己酸丁酯、壬醛、2 -壬酮、異戊酸乙酯和己酸己酯，這5 種物質(zhì)對活竹酒的主體香氣有重要的修飾作用，賦予活竹酒花草清香的獨(dú)特香味.原竹酒中己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸己酯和丁酸乙酯具備很高的相對香氣活度值，對原竹酒主體香氣貢獻(xiàn)最為顯著；己酸異戊酯、己酸丁酯、3 -苯丙酸乙酯、乙酸異戊酯、壬醛、癸酸乙酯和異戊醛，這些物質(zhì)使原竹酒的主體香氣更為香甜.活竹酒與其它白酒相比較，活竹酒中己酸乙酯的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高［17-18］，占總揮發(fā)性成分的60.91%，活竹酒中酯類香氣成分種類復(fù)雜，更加突出了濃香型白酒的特征，使活竹酒以己酸乙酯為主體的復(fù)合香氣更加濃郁.

致謝 四川大學(xué)瀘州市人民政府戰(zhàn)略合作專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2017CDLZ-S24）對本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意.