桑葉槲皮素對D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化能力及腸道菌群的影響

黃思瑩， 黃春萍， 劉 旭， 佘詩琪， 勾 洵

（四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都610101）

衰老是一種復(fù)雜的生理過程，是機(jī)體隨著年齡的增加而出現(xiàn)的各生理器官和功能的退行性變化.隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的迅速發(fā)展，自由基學(xué)說成為最具有代表性的可能機(jī)制之一：隨著年齡的增大，生物體中清除自由基的抗氧化酶活性下降，自由基逐漸堆積從而加速衰老［1］.因此，如何清除生物體內(nèi)過量的自由基已經(jīng)成為抗氧化研究的重難點(diǎn)問題，天然產(chǎn)物所具有的安全無副作用及特有的多種生物活性物質(zhì)受到了越來越多的關(guān)注.作為“藥食同源”的重要植物資源，桑葉（Morus alba L.）具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖和降低膽固醇等多種藥理作用，含有多糖、氨基酸、黃酮、維生素等多種生物活性組分［2-4］.與多糖類似，黃酮類化合物是桑葉主要活性成分之一，具有多種藥理作用和活性功能.文獻(xiàn)［5］報(bào)道桑葉黃酮類化合物含量在所有植物莖葉中較高，占桑葉干物質(zhì)量的3%左右.研究顯示，桑葉黃酮類化合物能清除人體中超氧離子自由基，是一類天然抗氧化劑，但其作用機(jī)制仍不明確.此外，不同種類和不同結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物的抗氧化功效均不相同［5-6］.作為多羥基黃酮類化合物，槲皮素（quercetin）被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明具有抗腫瘤、降血糖和降血脂等作用［7-8］.桑葉槲皮素（MAQ）對衰老小鼠的抗氧化作用和其攝入后對小鼠腸道菌群的影響及機(jī)制未見報(bào)道.本研究以桑葉槲皮素為研究對象，研究其對D -半乳糖致衰老模型小鼠免疫功能、抗氧化能力以及腸道菌群多樣性的影響，以期探索桑葉槲皮素在預(yù)防衰老方面的作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 桑葉，購自于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定為桑葉.

總抗氧化能力（T -AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、糞便基因組提取試劑盒（中國天根生化科技有限公司）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（四川省維克奇生物科技有限公司），石油醚、乙醇、抗壞血酸、D -半乳糖、亞硝酸鈉、硝酸鋁和NaOH 等均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器與設(shè)備 電子天平（萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），紫外可見分光光度計(jì)Spekoll 500（AJ 耶拿），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R -3（Buchi），電泳儀（Bio-RAD），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD）.

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR 小鼠60 只，雄性，18 ～22 g，購自四川省成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（生產(chǎn)許可證：SCXK（川）2015 -030）.小鼠自由進(jìn)食、飲水，室溫保持25 ℃左右（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證：SYXK（川）2013 -185）.

1.4 試驗(yàn)方法

1）桑葉中槲皮素的提取［9］.將桑葉粉與石油醚以1∶ 20 的比例，在50 ℃、200 W的條件下超聲波處理20 min，過濾出殘?jiān)?，將殘?jiān)貜?fù)提取一次；隨后將殘?jiān)胖?0 ℃烘箱烘干；按料液比1∶ 25的比例加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，超聲波提取3 次（溫度70 ℃，功率200 W，時(shí)間30 min）；抽濾，合并濾液后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空減壓濃縮，回收乙醇.利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法檢測槲皮素含量.

2）動(dòng)物分組與衰老模型建立. ICR 雄性小鼠60 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為空白對照組（CG）、衰老模型組（MG）、陽性對照組（PC）、MAQ高（MAQ - H）、MAQ 中（MAQ - M）和MAQ 低（MAQ-L）劑量組.空白對照組腹腔注射0.9%生理鹽水；其余5 組腹腔注射D -半乳糖120 mg／（kg·d），持續(xù)8 周建立小鼠衰老模型.

3）槲皮素的灌胃治療.建模完成后，桑葉槲皮素低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg／（kg·d）；陽 性 對 照 組 灌 胃 抗 壞 血 酸100 mg／（kg·d）；空白對照組與衰老模型組給予等量的生理鹽水灌胃，給藥持續(xù)30 d.

4）指標(biāo)檢測及方法.治療結(jié)束后禁食1 d，眼球采血，根據(jù)試劑盒說明書檢測GSH - Px 活性、T-AOC、SOD活性和MDA 含量.同時(shí)無菌條件下取小鼠胸腺、脾臟，稱重并計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)如下：

5）小鼠腸道細(xì)菌總DNA提取.小鼠灌胃治療期間，每10 d 測量小鼠體質(zhì)量并收集小鼠新鮮糞便.稱取0.2 g糞便樣品，按照糞便基因組提取試劑盒使用說明操作.通過超微量核酸蛋白測定儀以O(shè)D260／OD280 評價(jià)DNA的純度并測定DNA濃度，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?

6）16S rDNA V3 可變區(qū)PCR擴(kuò)增.利用帶GC夾子的細(xì)菌通用引物對16S rDNA 的V3 區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.引物序列為341F -GC：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC CTACGGGAGGCAGCAG-3'和534R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG - 3'. PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：ddH2O 8. 5 μL，2 × Easy Taq PCR Super Mix 12.5 μL，上下游引物均為1 μL，DNA 模板2 μL.PCR 反應(yīng)條件：94 ℃，預(yù)變性5 min，94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共30 次 循 環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃保存.1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物.

7）變性梯度凝膠電泳（DGGE）.本次實(shí)驗(yàn)使用美國Bio -Rad 公司Dcode DGGE 系統(tǒng)，將16S rDNA V3 區(qū)的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于8%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離.變性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為30% ～60%，變性梯度方向與電泳方向一致，電泳在恒溫60 ℃下的1 ×TAE緩沖液中進(jìn)行，90 V電泳8 h，電泳結(jié)束后使用AgNO3染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測并用Quantity One? v4.6.2（Bio -Rad，Hercules，CA）軟件（簡稱Quantity軟件）拍照記錄結(jié)果.

8）腸道菌群的多樣性分析.利用Quantity軟件將PCR-DGGE圖譜變換為條帶圖譜和波峰圖譜，采集圖中條帶數(shù)目和灰度值，然后用Shannon -Weaver（H′）指數(shù)來分析各組小鼠腸道菌群的多樣性，

公式中ni為個(gè)體第i條條帶的峰面積，N為此個(gè)體所有條帶的峰面積之和.

9）數(shù)據(jù)分析.所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0 軟件處理，正態(tài)性檢驗(yàn)后，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以ˉx ±s表示，進(jìn)行單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉槲皮素對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響 與空白對照組相比，衰老模型組的胸腺和脾臟指數(shù)均顯著降低（P ＜0.05）.與衰老模型組相比，桑葉槲皮素低劑量和中劑量組的胸腺指數(shù)增加明顯（P ＜0.05），高劑量組和陽性對照組極顯著提高（P ＜0.01）；而桑葉槲皮素中、高劑量組的脾臟指數(shù)有所增加（P ＜0.05），低劑量組無明顯差異（P ＞0.05），陽性對照組升高明顯（P ＜0.01，見表1）.

表1 桑葉槲皮素對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響（n ＝10，±s）Tab. 1 Effects of MAQ on thymus and spleen indices in mice（n ＝10，±s）

表1 桑葉槲皮素對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響（n ＝10，±s）Tab. 1 Effects of MAQ on thymus and spleen indices in mice（n ＝10，±s）

注：與空白對照組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與衰老模型組相比*P ＜0.05，**P ＜0.01.

組別 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)空白對照組（CG） 0.04 ±0.06 0.67 ±0.12衰老模型組（MG） 0.29 ±0.04 ## 0.46 ±0.09 #陽性對照組（PC） 0.39 ±0.05 ** 0.63±0.11**MAQ低劑量組（MAQ-L） 0.35 ±0.04 * 0.53 ±0.15 MAQ中劑量組（MAQ-M） 0.36 ±0.04 * 0.55 ±0.14 *MAQ高劑量組（MAQ-H） 0.36 ±0.06 ** 0.57 ±0.17*

2.2 桑葉槲皮素對小鼠血清中T -AOC、SOD 和MDA含量的影響 由表2 可知，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠在D -半乳糖的作用下，血清的T -AOC、SOD 和GSH -Px 活性顯著降低（P ＜0.01），MDA含量升高（P ＜0.01）.在灌胃桑葉槲皮素后，與衰老模型組小鼠相比，桑葉槲皮素低劑量組GSH-Px活性有所提升（P ＜0.05），MDA 含量降低（P ＜0.05）；中、高劑量和陽性對照組小鼠血清的T-AOC、SOD和GSH-Px活性均有不同程度增加（P ＜0. 05），MDA 含量極顯著降低（P ＜0.01）.

2.3 V3 區(qū)16S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果 小鼠腸道菌群如圖1 瓊脂糖凝膠電泳所示，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度在200 bp左右，與預(yù)期相符.

表2 桑葉槲皮素對小鼠血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px的影響（n ＝10，±s）Tab. 2 Effects of MAQ on T-AOC，SOD，MDA and GSH-Px in serum of mice（n ＝10，±s）

表2 桑葉槲皮素對小鼠血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px的影響（n ＝10，±s）Tab. 2 Effects of MAQ on T-AOC，SOD，MDA and GSH-Px in serum of mice（n ＝10，±s）

注：與空白對照組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與衰老模型組相比*P ＜0.05，**P ＜0.01.

組別 T-AOC水平／（U／mL） SOD活性／（U／mL） MDA含量／（nmol／mL） GSH-Px活性／（U／mL）空白對照組（CG） 16.38 ±2.11 119.75 ±4.99 6.61 ±1.22 16.52 ±0.87衰老模型組（MG） 6.73 ±1.20 ## 103.79 ±.5.35 ## 13.89 ±1.76 ## 9.23 ±0.65 ##陽性對照組（PC） 14.93 ±2.53 ** 117.54 ±4.21 ** 7.24 ±1.12 ** 14.64 ±0.66 **MAQ低劑量組（MAQ-L） 8.27 ±0.88 105.52 ±6.15 11.54 ±0.68 * 11.80 ±0.74 *MAQ中劑量組（MAQ-M） 10.32 ±0.43 * 108.17 ±4.49 * 9.51 ±1.01 ** 13.12 ±0.69 **MAQ高劑量組（MAQ-H） 12.43 ±1.65 ** 115.23 ±5.38 ** 8.35 ±1.18 ** 14.27 ±0.61**

2.4 腸道菌群的多樣性分析 灌胃治療第0 d，即8 周衰老模型完成時(shí)，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠腸道菌群多樣性顯著降低（P ＜0.01），表明衰老可能會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道菌群多樣性下降.與衰老模型組相比，陽性對照及治療組沒有差異（P ＞0.05）.灌胃治療第10 d，衰老模型組小鼠腸道菌群多樣性低于空白對照組和陽性對照組（P ＜0.05）.灌胃治療第30 d，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠腸道菌群多樣性較低，但差異不顯著（P ＞0.05）；與衰老模型組相比，陽性對照組和桑葉槲皮素低劑量組小鼠腸道菌群多樣性有所增加，但差異不顯著（P ＞0.05），桑葉槲皮素中劑量組小鼠腸道菌群多樣性增加明顯（P ＜0.05），高劑量組小鼠腸道菌群多樣性有極顯著增加（P ＜0.01）.見圖2 ～3.

3 討論

根據(jù)衰老的代謝紊亂學(xué)說，在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)注射D-半乳糖可導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，自由基氧化與抗氧化作用動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，使個(gè)體細(xì)胞易受自由基的傷害，導(dǎo)致機(jī)體加速衰老［10］.本實(shí)驗(yàn)中的衰老模型組小鼠在注射過D -半乳糖后，T -AOC 水平、GSH-Px和SOD活性顯著降低，MDA含量升高，證明D-半乳糖建立衰老模型成功.

圖1 小鼠腸道菌群16S rDNA的V3區(qū)PCR產(chǎn)物Fig. 1 16S rDNA PCR products of gut microbiota from different groups of mice

圖2 桑葉槲皮素對衰老小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)的影響（n ＝5，±s）Fig. 2 Effects of MAQ on indices of gut microbiota diversity in aged mice（n ＝5，±s）

圖3 灌胃第30 d桑葉槲皮素對衰老小鼠腸道菌群多樣性的影響（n ＝5，±s）Fig. 3 Effects of MAQ on gut microbiota diversity of aged mice in 30 d（n ＝5，±s）

機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在密切的關(guān)系，作為機(jī)體重要的免疫器官，胸腺和脾臟指數(shù)反應(yīng)機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖程度，與免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān).T-AOC是對機(jī)體抗氧化能力的總體評價(jià)，抗氧化酶類能夠清除和分解體內(nèi)過量的和H2O2等自由基，其中SOD就是重要的抗氧化酶之一，維持機(jī)體抗氧化動(dòng)態(tài)平衡.GSH -Px 能通過阻斷氧化還原反應(yīng)防止過氧化物對機(jī)體的損害.MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物，可反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化程度，MDA含量的高低間接反映了機(jī)體受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度［11-12］.

本研究與衰老模型組相比，桑葉槲皮素高劑量組T-AOC 水平、GSH -Px 和SOD 活性顯著升高，MDA含量顯著降低，與陽性對照組效果相似；中、低劑量組也能不同程度提高機(jī)體抗氧化能力.說明桑葉槲皮素具有清除體內(nèi)自由基、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的作用.

現(xiàn)有研究表明，人和動(dòng)物體內(nèi)腸道菌群的狀態(tài)和宿主的健康密切相關(guān).正常菌群可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，拮抗許多致病菌的生長，清除體內(nèi)有毒物質(zhì)［13］.病理狀態(tài)下的腸道微生態(tài)受到破壞，而外源性的調(diào)節(jié)劑如益生菌能夠改善微生態(tài)環(huán)境，起到良好的預(yù)防和治療作用［14-15］.

本研究中，小鼠在接受D -半乳糖持續(xù)給藥建立衰老模型后，腸道菌群多樣性降低，表明體內(nèi)腸道微生態(tài)紊亂.在桑葉槲皮素灌胃治療后，小鼠腸道菌群多樣性逐漸升高，證明桑葉槲皮素可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群，增加菌群多樣性，從而改善機(jī)體的部分生理功能，起到延緩衰老的作用.

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，槲皮素可顯著提高衰老小鼠機(jī)體的總抗氧化能力T-AOC 水平，降低衰老小鼠脂質(zhì)過氧化物MDA 含量，有效清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基，具有明顯的抗氧化作用.同時(shí)腸道菌群多樣性研究表明，桑葉槲皮素灌胃后能明顯改善小鼠腸道菌群多樣性，改善機(jī)體生理功能，但抗氧化機(jī)制、腸道菌群多樣性的具體變化與桑葉槲皮素的構(gòu)效關(guān)系仍然需要進(jìn)一步的研究.

致謝 四川師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理項(xiàng)目（SYJS2017028）對本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意.