近海水體環(huán)境DNA沉降對沉積物中纖毛蟲分子多樣性評估的影響*

黃平平 趙 峰 徐奎棟

近海水體環(huán)境DNA沉降對沉積物中纖毛蟲分子多樣性評估的影響*

黃平平1, 2趙 峰1徐奎棟1, 2①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生物分類與系統(tǒng)演化實驗室 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

在陸架海區(qū)沉積物中, DNA高通量測序技術(shù)可檢獲大量浮游寡毛類和舞毛類等非底棲纖毛蟲, 這些源于水體的環(huán)境DNA (eDNA)如何影響對沉積物中纖毛蟲分子多樣性的評估, 以及影響程度如何尚不明確。本研究選取了黃海冷水團中的兩個站位, 通過提取水體和沉積物中DNA和RNA, 并采用直接提取法和洗脫法提取沉積物DNA, 結(jié)合DNA和cDNA測序技術(shù), 探討了水體和沉積物中纖毛蟲分子多樣性的關(guān)系。研究表明, 基于洗脫DNA法、直接提取DNA法和cDNA法獲得的沉積物中纖毛蟲OTUs數(shù)分別為451、312和324個, 其中211個OTUs同時由三種方法檢獲; 而164個OTUs僅通過洗脫DNA法檢獲, 其中89%為相對豐度低于0.1%的稀有類群。直接提取DNA法所獲的寡毛類和舞毛類序列數(shù)占比達46%, 而在洗脫DNA法和cDNA法中占比僅為12%和10%。沉積物中檢獲的43%—71%的舞毛類和寡毛類OTUs與淺層水(<40m)共有, 僅19%—29%與深層水(>40m)共有, 且這些共有的OTUs可同時在淺層水中檢獲。本研究發(fā)現(xiàn), 對沉積物中纖毛蟲分子多樣性評價造成影響的浮游類群主要來自淺層水, 洗脫DNA與cDNA測序均可顯著降低浮游類群eDNA的影響。鑒于洗脫DNA法較之cDNA法操作更簡便, 且避免了反轉(zhuǎn)錄過程導(dǎo)致的偏差, 因此推薦用于對近海沉積物中纖毛蟲等真核微生物的分子多樣性研究。

纖毛蟲; 海洋水體; 海洋沉積物; 分子多樣性; DNA高通量測序; cDNA高通量測序

纖毛蟲具有較高的生物多樣性, 是微食物網(wǎng)中的重要組成部分, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)學(xué)功能(Fenchel, 2008; 宋微波等, 2009)。研究者們已采用經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法開展了多項淺海水體或者沉積物中纖毛蟲多樣性的研究, 并揭示了浮游與底棲環(huán)境具有截然不同的纖毛蟲群落構(gòu)成(Meng, 2012; 李潔等, 2016)。海水中, 舞毛亞綱(Choreotrichia, 73.3%)和寡毛亞綱(Oligotrichia, 13.3%)等典型浮游纖毛蟲為物種數(shù)最高的類群, 且豐度占據(jù)絕對優(yōu)勢(Liu, 2016); 而沉積物中, 前口綱(Prostomatea, 40%—47%)和裂口綱(Litostomatea, 9%—25%)纖毛蟲為最優(yōu)勢類群, 而舞毛和寡毛類群則罕見(Meng, 2012; 周百靈等, 2016; Zhou, 2016)。但是, 形態(tài)學(xué)方法本身存在的問題和不足限制了人們對纖毛蟲多樣性的深入了解, 如: 容易忽視數(shù)量少、個體微小且難以培養(yǎng)的類群, 且操作過程復(fù)雜, 需要豐富的分類學(xué)鑒定經(jīng)驗等(黃平平等, 2017)。

近年來, 基于基因測序的方法, 尤其是DNA高通量測序, 可檢獲較之形態(tài)學(xué)方法更高的多樣性, 極大地擴展了對海洋纖毛蟲多樣性的認(rèn)識。Gimmler等(2016)通過18S rRNA基因的高通量測序技術(shù), 在大洋真光層水體中檢獲了1274個纖毛蟲的可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs), 其分子多樣性遠高于基于形態(tài)研究的結(jié)果; 類群構(gòu)成上, 分子手段與形態(tài)學(xué)手段研究結(jié)果類似, 主要隸屬于舞毛亞綱和寡毛亞綱。在沉積物中, DNA高通量測序技術(shù)檢獲了極高的纖毛蟲分子多樣性, 但是浮游生舞毛亞綱的多樣性占比高達20%, 為多樣性最高的類群, 且序列數(shù)所占比例最高達20%, 這與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果截然不同(Li, 2019)。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象, 浮游生舞毛亞綱和寡毛亞綱纖毛蟲的序列在沉積物中占比高達42%, 而通過形態(tài)學(xué)手段并未在相同站位的沉積物中檢獲該類群(黃平平等, 2017)。沉積物中不僅包括底棲活動蟲體的DNA, 還富集了來自上層水體中浮游類群的包囊和死亡個體, 以及胞外DNA等的eDNA (Torti, 2015)。Corinaldesi等(2005)研究發(fā)現(xiàn)近海沉積物中胞外DNA濃度約為胞內(nèi)DNA濃度的40倍以上, 將這些胞外eDNA包含在內(nèi)會直接影響沉積物中纖毛蟲分子多樣性的評價。

較之DNA, RNA降解快, 不易在環(huán)境中保存, 因此環(huán)境RNA(反轉(zhuǎn)錄成cDNA, complementary DNA), 即cDNA測序被應(yīng)用于活動蟲體多樣性的研究(Xu, 2017)。而且, 我們前期研究發(fā)現(xiàn)cDNA測序檢獲的底棲纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)與形態(tài)學(xué)結(jié)果更為相似(黃平平等, 2017)。因此, 基于cDNA測序的方法會降低水體纖毛蟲對沉積物中纖毛蟲分子多樣性評價的干擾。

迄今, 研究者們主要針對水體或者沉積物單一生境中的纖毛蟲多樣性開展了研究, 尚未有工作同時研究相同站位的水體和沉積物中的纖毛蟲多樣性, 因此, 海水中的eDNA如何影響沉積物中纖毛蟲分子多樣性的評價, 以及影響程度依然不明。

本研究以黃海冷水團內(nèi)的兩個站位(水深約70m)為研究對象, 同時提取不同水層和沉積物中的DNA和RNA, 其中沉積物中DNA提取采用直接提取和洗脫兩種方法, 通過核糖體18S DNA及其cDNA V4區(qū)高通量測序獲得纖毛蟲的分子多樣性信息, 探明來源于上層水體纖毛蟲的eDNA對沉積物中纖毛蟲多樣性評價的影響, 為陸架海域纖毛蟲的分子多樣性研究提供可靠的技術(shù)體系和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查站位與樣品采集

本研究于2018年8月搭乘“科學(xué)3號”科學(xué)考察船在南黃海冷水團內(nèi)Y1 (35°59′56.4″N, 123°0′2.4″E)和Y2 (35°59′48.6″N, 123°59′58.8″E)兩個站位進行樣品采集。

海水樣品, 利用溫鹽深剖面探測系統(tǒng)(SBE911)的Rosette采水器采集: 6個分層: 表層、10m、20m、30m、50m和底層(Y1: 69m和Y2: 72m), 每個分層各采集1L海水(Liu, 2017)。根據(jù)溫度和鹽度數(shù)據(jù), 兩個站位40m以深水層處于黃海冷水團(溫度<10°C; 鹽度>32) (Xin, 2015)。海水首先經(jīng)孔徑為200μm的篩絹預(yù)過濾, 去除大型浮游生物和雜質(zhì)等。然后采用Masterflex蠕動泵(美國)過濾海水至直徑為47mm, 孔徑為0.22μm的混合纖維素酯膜上(Millipore, USA), 富集生物。過濾時, 控制蠕動泵的轉(zhuǎn)速和壓力, 保證細胞完整性。1L海水, 包括極少數(shù)泥沙含量較高的底層水體, 可在10分鐘內(nèi)完成過濾。濾膜置于無RNA酶的凍存管中, 于-20°C冰箱中冷凍保存, 回到實驗室轉(zhuǎn)移至-80oC超低溫冰箱中保存。

沉積物, 利用0.1m2改進型Gray-Ohara箱式采泥器采集。每個站位采集3箱未受擾動的沉積物樣品: 每箱刮取0—2cm表層沉積物約20g放入封口袋中, 混勻, 快速置于-20°C冰箱中冷凍保存, 回到實驗室轉(zhuǎn)移至-80°C超低溫冰箱中保存。

1.2 DNA和RNA提取及PCR擴增

濾膜DNA和RNA提取采用All Prep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Germany), 該試劑盒可同時提取濾膜上的DNA和RNA。

沉積物RNA提取采用RNA PowerSoil Total RNA Isolation kit (Qiagen, Germany), 每個站位3個樣品(三箱泥, 每箱1個), 各取2g用于RNA提取; RNA洗脫完成后的吸附柱, 繼續(xù)采用RNA PowerSoil DNA Elution Accessory Kit (Qiagen, Germany)洗脫DNA, 獲得沉積物的洗脫DNA。

沉積物DNA提取, 還采用了PowerSoil DNA Isolation kit (Qiagen, Germany), 每個站位3個樣品, 各取3份0.3g, 分別進行DNA提取, 獲得沉積物的提取DNA。

總RNA采用PrimerScript Ⅱ1st strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。每個海水樣品各一份DNA以及cDNA, 每個沉積物樣品各一份洗脫DNA、cDNA以及三份提取DNA通過巢式PCR對纖毛蟲18S rRNA基因V4區(qū)進行特異性擴增(Stock, 2013)。首先, 采用纖毛蟲特異性引物(CilF和CilRI-III) 針對纖毛蟲的18S rRNA基因進行擴增, 擴增長度約600bp (Lara, 2007), 每個樣品的DNA/cDNA進行三次重復(fù)PCR。采用Q5高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)進行PCR擴增, 第一輪PCR反應(yīng)體系為: 正反向引物各0.5μL, 模板1.5μL, Q5聚合酶0.25μL, 10mmol/L dNTPs 0.5μL, Q5 Reaction Buffer和High GC Enhancer各5μL, 最后加雙蒸水補齊25μL。反應(yīng)流程: 98°C預(yù)變性30s; 然后98°C變性45s, 58°C退火1min, 72°C延伸1min, 共循環(huán)35次; 最后72°C延伸10min終止于4°C (Lara, 2007)。然后, 以第一輪PCR產(chǎn)物為模板, 采用真核特異性引物(EukF和EukR) 對V4高變區(qū)進行特異性擴增, 擴增長度約400bp (Stoeck, 2010)。第二輪PCR反應(yīng)體系為: 正反向引物各1μL, 模板1.5μL, Q5聚合酶0.5μL, 10mmol/L dNTPs 1μL, Q5 Reaction Buffer和High GC Enhancer各10μL, 最后加雙蒸水補齊50μL。反應(yīng)流程: 98°C預(yù)變性30s; 然后98°C變性30s, 57°C退火45s, 72°C延伸1min, 共循環(huán)10次; 98°C變性30s, 49°C退火45s, 72°C延伸1min, 共循環(huán)25次; 最后72°C延伸5min終止于4°C (Stoeck, 2010)。

1.3 測序及序列數(shù)據(jù)分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量, 若符合要求, 則將來自同一樣品的3個重復(fù)的DNA/cDNA 的PCR產(chǎn)物分別進行合并, 每個水層的DNA/cDNA的PCR產(chǎn)物各一組(如: Y1站位5m層DY1.5和RY1.5), 每個站位沉積物提取DNA、洗脫DNA和cDNA的PCR產(chǎn)物各三組(如Y1站位提取DNA: SDY1_1T, SDY1_2T, SDY1_3T; Y1站位洗脫DNA: SDY1_1, SDY1_2, SDY1_3; Y1站位cDNA: SRY1_1, SRY1_2和SRY1_3)。最終共24個水體樣品(12個DNA和12個cDNA)和18個沉積物樣品 (6個提取DNA、6個洗脫DNA和6個cDNA), 進行Illumina Hiseq測序。

測序過程如下: 使用NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit (New England Biolabs, USA)試劑盒構(gòu)建文庫, 檢測文庫, 合格后上機測序。測得的原始序列采用FLASH V1.2.7對雙端測序序列進行合并, 得到原始Tags (Raw Tags) (Mago?, 2011)。采用QIIME對Raw Tags進行質(zhì)量控制和過濾: (1) 質(zhì)量控制: 將Raw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(≤19)堿基數(shù)達到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個低質(zhì)量堿基位點截斷; (2) 長度過濾: 經(jīng)截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集, 進一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度低于Tags長度75%的Tags (Caporaso, 2010)。進一步采用UCHIME去除嵌合體序列, 最終獲得有效序列(Edgar, 2011; Haas, 2011)。采用USEARCH對有效序列進一步處理。流程如下: 去冗余; 去噪; 以97%水平進行OTU聚類。對獲得的OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫(v. 123)進行BLAST比對, 獲得相應(yīng)序列的分類信息。其中纖毛蟲的相對豐度以每個類群的序列數(shù)占總序列數(shù)的比例(序列數(shù)百分比)表示; 豐富度以每個類群的OTUs數(shù)表示; 相對豐富度以每個類群的OTUs數(shù)占總OTUs數(shù)的比例(OTUs數(shù)百分比)表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

稀釋性曲線用于評估測序樣本的飽和程度。為確保樣品間的可比性, 根據(jù)單個樣本纖毛蟲最低序列數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化(=6683, DY2.30)。稀釋性曲線的繪制, 采用R語言(R3.4.3)中的“fossil”和“vegan”包。序列數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理, 采用USEARCH v10。使用Venny2.1繪制韋恩圖。使用PRIMER v6軟件包中的CLUSTER分析不同水層環(huán)境因子(溫度和鹽度), 沉積物和水體樣品中纖毛蟲的群落結(jié)構(gòu), 分析之前原始數(shù)據(jù)進行l(wèi)og(+1)轉(zhuǎn)化; 環(huán)境因子的CLUSTER分析基于歐式距離(Euclidean Distance)矩陣, 生物樣本的CLUSTER分析基于Bray-Curtis矩陣。SIMPROF (<0.05)和ANOSIM用于分析群落結(jié)構(gòu)差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子

海水溫度和鹽度的垂直變化趨勢相反, 隨著水層加深, 溫度降低, 而鹽度增加。在40m以淺水域, 溫度為16.9—27.7°C, 鹽度為30.5—32.0; 在40m以深水域, 溫度為7.4—8.8°C, 鹽度均約為32.5。以每個分層溫度和鹽度進行聚類, 結(jié)果顯示: 12個樣本聚為兩大支, 40m以深和以淺樣本分別聚為一支, ANOSIM分析兩組之間環(huán)境因子差異顯著(=0.85,=0.002), 但各組內(nèi)部差異不顯著(SIMPROF:>0.05) (圖1)。

2.2 基本測序數(shù)據(jù)

42個測序樣本共獲取1160205條纖毛蟲的序列, 每個樣本平均序列數(shù)為27624。其中, DY2.30序列數(shù)最低, 為6683條; SRY2_1序列數(shù)最高, 為77604條。稀釋性曲線顯示: 除SRY1_3樣本外, 其他所有樣本測序深度趨于飽和; 較之海水樣本, 沉積物樣本飽和性較低(圖2)。為確保樣品間的可比性, 以下分析均基于標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)(=6683), 標(biāo)準(zhǔn)化之后, 以97%的相似性進行聚類, 所有樣本共檢獲651個纖毛蟲的OTUs。DY2.72的OTUs數(shù)最低, 為41個; SDY1_3的OTUs數(shù)最高, 為302個。

圖1 每個水層環(huán)境因子聚類分析(紅色顯示差異不顯著: P>0.05)

注: Y1.5—Y1.69: Y1站位5m層至Y1站位69m層; Y2.2—Y2.72: Y2站位2m層至Y2站位72m層

圖2 水體和沉積物中纖毛蟲DNA和cDNA測序樣本稀釋性曲線

2.3 基于DNA和cDNA測序的水體中纖毛蟲多樣性和群落結(jié)構(gòu)

在水體中, 兩種方法檢獲的纖毛蟲OTUs數(shù)相似。DNA和cDNA測序分別獲得201和218個OTUs, 182個OTUs同時通過兩種方法檢獲, 共有OTUs序列數(shù)分別占總序列數(shù)的99.9%和99.4%(圖3a)。兩種方法均顯示, 較之40m以深水層, 40m以淺水層中纖毛蟲OTUs數(shù)較高(圖3b, 3c)。DNA測序在40m以淺和以深水層中分別獲得165和82個OTUs, 其中46個OTUs可以同時在40m以淺和以深水層中檢獲(圖3b)。cDNA測序在40m以淺和以深水層中分別獲得196和85個OTUs, 其中63個OTUs可以同時在40m以淺和以深水層中檢獲(圖3c)。

與基于環(huán)境因子的聚類分析結(jié)果一致, 基于24個水體纖毛蟲測序樣本的聚類分析結(jié)果顯示, 24個樣本亦分為兩大組, 40m以淺和以深水層分別聚為一組(ANOSIM:=0.994,=0.001)。SIMPROF分析結(jié)果顯示, 除Y2站位2m層和10m層以外, 同一站位的相同分層采用DNA和cDNA測序方法所獲得的樣本差異不顯著(圖4)。即整體上, 各個水層間的纖毛蟲群落的差異大于方法學(xué)造成的群落差異。

DNA和cDNA測序所檢獲的纖毛蟲均隸屬于7個綱(圖5a)。兩種方法均顯示旋唇綱相對豐度和OTUs數(shù)最高, 且主要由舞毛亞綱和寡毛亞綱構(gòu)成。比較分析40m以淺和40m以深樣本, DNA和cDNA測序所揭示的不同綱/亞綱相對豐度和豐富度的變化規(guī)律一致: 從40m以淺到40m以深, 舞毛亞綱、寡毛亞綱和葉咽綱相對豐度降低; 腎形綱、裂口綱、寡膜綱和前口綱相對豐度增加(圖5b)。就相對豐富度而言, 舞毛亞綱、寡毛亞綱和前口綱相對豐富度降低; 腎形綱、裂口綱、寡膜綱和葉咽綱相對豐富度增加(圖5c)。

圖3 共有和特有OTUs數(shù)(括號內(nèi)數(shù)字顯示舞毛亞綱和寡毛亞綱纖毛蟲OTUs數(shù))

圖4 42個測序樣本聚類分析和SIMPROF分析(紅色虛線顯示差異不顯著, P>0.05)

注: 每個水層的DNA和cDNA測序樣本(如D/RY1.5: 基于DNA/cDNA測序Y1站位水體5m層)。每個站位沉積物提取DNA(SDY1_1T-3T)、洗脫DNA(SDY1_1-3)和cDNA(SRY1_1-3)測序各三個重復(fù)測序樣本

2.4 基于直接提取DNA、洗脫DNA和cDNA測序的沉積物中纖毛蟲多樣性和群落結(jié)構(gòu)

在沉積物中, 提取DNA、洗脫DNA和cDNA測序分別獲得312、451和324個OTUs, 211個OTUs同時通過三種方法檢獲, 共有OTUs序列數(shù)分別占總序列數(shù)的93.5%、79.2%和82.1% (圖3d)。164個OTUs僅通過洗脫DNA法檢獲, 其中146個OTUs相對豐度低于0.1%。聚類分析結(jié)果顯示, 基于洗脫DNA測序的6個樣本聚集在一起, 且與基于提取DNA和cDNA測序的樣本分開, ANOSIM分析顯示兩大支群落結(jié)構(gòu)差異顯著(=0.569,=0.001) (圖4)。

圖5 基于DNA和cDNA測序的綱/亞綱水平纖毛蟲OTUs數(shù)(a)、序列百分比(b)和OTUs百分比(c)

提取DNA和洗脫DNA測序檢獲的纖毛蟲均隸屬于11個綱, 包括水體檢獲的7個綱, 以及瓶纖綱(Armophorea)、核殘跡綱(Karyorelictea)、籃口綱(Nassophorea)和斜毛綱(Plagiopylea) (圖5a)。cDNA測序檢獲的纖毛蟲隸屬于10個綱, 其中瓶纖綱未獲得。三種方法均顯示旋唇綱相對豐度最高, 其中提取DNA測序檢獲的舞毛類和寡毛類相對豐度高達46.0%, OTUs數(shù)為58個, 占比為18.6%; 洗脫DNA測序次之, 該兩類相對豐度為11.8%, OTUs數(shù)為49個, 占比為10.9%; cDNA測序所得的該兩類浮游生纖毛蟲相對豐度最低為10.1%, 但OTUs數(shù)為53個, 占比為16.4% (圖5b, 5c)。提取DNA和洗脫DNA測序顯示前口綱相對豐度較高, 而cDNA測序顯示異毛綱相對豐度較高(圖5b)。

2.5 水體和沉積物中共有纖毛蟲

鑒于水體DNA和cDNA測序所得OTUs構(gòu)成極其相似, 因此整合DNA和cDNA數(shù)據(jù), 共獲得237個纖毛蟲的OTUs, 代表水體中纖毛蟲群落, 40m以淺和以深水層分別獲得211和99個OTUs。

在沉積物中, 提取DNA測序獲得的312個OTUs中, 98個可以同時在水體中檢獲, 其中, 40m以淺水層中檢獲89個, 包括41個舞毛類和寡毛類OTUs; 40m以深水層中檢獲37個, 包括11個舞毛類和寡毛類OTUs, 且該11個OTUs均可在淺水層中檢獲(圖3e)。

沉積物洗脫DNA測序獲得的451個OTUs中, 80個可以同時在水體中檢獲, 其中, 40m以淺水層中檢獲67個, 包括21個舞毛類和寡毛類OTUs; 40m以深水層中檢獲42個, 包括14個舞毛類和寡毛類OTUs, 該14個OTUs中12個可以在淺水層中檢獲(圖3f)。

沉積物cDNA測序獲得的324個OTUs中, 80個可以同時在水體中檢獲, 其中, 40m以淺水層中檢獲71個, 包括31個舞毛類和寡毛類OTUs; 40m以深水層中檢獲35個, 包括10個舞毛類和寡毛類OTUs, 該10個OTUs均可在淺水層中檢獲(圖3g)。

在多樣性構(gòu)成上, 三種沉積物纖毛蟲多樣性評估方法顯示, 水體和沉積物中共有的OTUs主要隸屬于浮游纖毛蟲舞毛亞綱和寡毛亞綱(圖6)。沉積物、水體40m以淺和40m以深水層共有的舞毛和寡毛類OTUs, 在水體中的相對豐度較高, 序列占總序列數(shù)的18.7%—32.7%。沉積物和40m以淺水層共有, 而未在40m以深水層中獲得的舞毛和寡毛類OTUs, 在水體中的相對豐度較低, 占總序列數(shù)的0.2%—2.9%。如OTU169高斯類鈴蟲(), 其通過三種方法均可在沉積物中檢獲, 同時僅存在于40m以淺水層中, 在水體中的相對豐度為0.04%。

水體和沉積物共有舞毛類和寡毛類OTUs, 在沉積物中總的相對豐度為3.8% (cDNA測序), 8.7% (洗脫DNA測序), 39.2% (提取DNA測序) (圖7)。水體和沉積物共有的舞毛類和寡毛類OTUs中大部分(63.4%—67.7%)在水體中的相對豐度高于在沉積物中的相對豐度, 但是OTU14擬急游蟲()在沉積物中的序列數(shù)為371(cDNA測序)—7019(提取DNA測序), 而在水體中僅獲得5條序列。

此外, 沉積物和水體共有OTUs還包括腹毛亞綱、前口綱和異毛綱等優(yōu)勢類群(圖6)。沉積物洗脫DNA中, 與水體共有序列主要隸屬于前口綱, 相對豐度為11.7% (圖7b), 其中, OTU40隱核蟲屬(sp.)貢獻最大, 而其在水體中僅一條序列。沉積物cDNA中, 與水體共有序列主要隸屬于腹毛亞綱和異毛綱, 其相對豐度分別為46.1%和16.1% (圖7c)。在腹毛亞綱中, OTU2縮頸半腹柱蟲()貢獻最大, 其在水體中僅一條序列。異毛綱中, OTU7突口蟲屬(sp.)貢獻最大, 其在水體中亦只有一條序列。

圖6 基于提取DNA (a)、洗脫DNA (b)和cDNA (c)測序的沉積物和水體中共有的纖毛蟲OTUs構(gòu)成

圖7 基于提取DNA (a)、洗脫DNA (b)和cDNA (c)測序的沉積物和水體中共有的纖毛蟲OTUs相對豐度

3 討論

3.1 不同水層中水體纖毛蟲對沉積物中纖毛蟲分子多樣性評估的影響

本研究采用三種不同沉積物中的纖毛蟲分子多樣性研究方法, 結(jié)果顯示沉積物中18% (洗脫DNA)到31% (提取DNA)的OTUs可以在水體中檢獲。這與前人報道的近海沉積物中25%—30%的真核微生物OTUs可以在上層水體中檢獲的結(jié)果相近(Forster, 2016; Chen, 2017)。但是, 過去的研究側(cè)重探討浮游和底棲原生生物地理分布模式的差異, 并未研究海水和沉積物中共有物種的構(gòu)成, 且缺少不同水層水體對沉積物微生物生物多樣性評估影響的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)淺層水中纖毛蟲對沉積物纖毛蟲分子多樣性評價的影響大于深層水, 沉積物與水體共有的纖毛蟲OTUs絕大部分僅在40m以淺水層中檢獲, 而未在40m以深水層中檢獲(圖3e, 3f, 3g)。通常, 淺層水、深層水和沉積物共有的寡毛類和舞毛類OTUs中, 80%以上在水體中的相對豐度高于在沉積物中的相對豐度, 且一半以上的OTUs在水體中的相對豐度大于1%。優(yōu)勢浮游類群的擴散能力較強, 因此可以同時在淺層水和深層水中檢獲(Tucker, 2017), 且優(yōu)勢浮游類群的DNA和RNA可沉降到沉積物中并得以保存, 因此亦可在沉積物中檢獲。還有部分共有OTUs在沉積物中的相對豐度較高, 如擬急游蟲()在沉積物中檢獲千余條序列, 而在水體中僅檢獲5條。推測此類纖毛蟲可能主要以包囊的形式存在于沉積物中。少數(shù)舞毛類和寡毛類纖毛蟲可以包囊的形式存在于沉積物中(Doherty, 2010), 在環(huán)境適宜時脫包囊, 重新進行浮游生活(Massana, 2015)。

僅在沉積物和淺層水同時檢獲的寡毛類和舞毛類OTUs, 在水體中總的相對豐度較低(0.2%—2.9%)。此類稀有浮游OTUs可能主要分布于淺層水中, 溫度可能是控制其分布的重要因子, 因為40m以淺水層溫度為17—28°C, 而底層水溫僅約8.0°C。水深也可能是限制此部分纖毛蟲分布的重要因素, 如高斯類鈴蟲()僅在淺層水中發(fā)現(xiàn), 而未見于深層水中(梁晨, 2019)。

海水和沉積物共有的OTUs除了以上浮游生舞毛類和寡毛類纖毛蟲, 還包括在沉積物中占優(yōu)勢的腹毛亞綱等, 該類群亦偶爾在水體中檢獲。如縮頸半腹柱蟲()通常在底質(zhì)表面爬行, 屬周叢生纖毛蟲, 該物種普遍檢獲于沉積物, 且具有相對較高的豐度, 而在水體中僅檢獲了1條序列。

3.2 不同方法對陸架海區(qū)水體和沉積物中纖毛蟲多樣性評估的影響

DNA和cDNA測序方法檢獲群落的相似性, 因研究對象和研究海域的不同而有所差異(Massana, 2015; Xu, 2017; Zhao, 2017)。本研究首次同時提取了不同水層和沉積物中的DNA和RNA, 其中, 沉積物DNA提取采用直接提取和洗脫兩種不同方法, 測序獲得纖毛蟲的分子多樣性信息, 探討不同方法對近海水體或沉積物中纖毛蟲多樣性評估的影響。

水體樣品中, DNA和cDNA測序方法所檢獲的纖毛蟲在多樣性構(gòu)成上較為一致, 共有序列占總序列數(shù)的99%以上, 且兩種方法獲得的特有OTUs均為稀有類群, 可能由于PCR擴增偏好性和反轉(zhuǎn)錄過程導(dǎo)致(Gonzalez, 2012)。同一站位相同分層采用不同測序方法所獲得的纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)差異不顯著, 但不同分層間的差異極顯著。然而, DNA測序中葉咽綱纖毛蟲序列比例明顯低于cDNA測序。Zhao等(2017)在西太平洋表層水體到2000m以深水體中亦發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象, 可能由于葉咽綱纖毛蟲具有較低rRNA基因拷貝數(shù), 且相對較高的代謝活性所致(Gong, 2013)。

沉積物中的纖毛蟲群落明顯不同于水體, 而方法學(xué)導(dǎo)致的纖毛蟲群落差異大于樣品間的群落差異。洗脫DNA測序方法所獲得的OTUs數(shù)明顯高于提取DNA和cDNA測序方法。本研究中洗脫DNA和cDNA測序方法所用的樣品量相同, 且來源于相同樣品, 因此洗脫DNA方法所獲得的高多樣性的原因在于cDNA測序主要檢獲活性生物多樣性, 而DNA測序還可檢獲胞外DNA和包囊多樣性(Xu, 2017)。樣品量則是影響洗脫DNA和直接提取DNA多樣性評估的重要因素(Penton, 2016), 本研究中洗脫DNA測序樣品量為提取DNA測序樣品量的2.2倍, 因此所檢獲的OTUs數(shù)亦較高, 為提取DNA測序檢獲的OTUs數(shù)的1.4倍。

此外, 樣品量不僅影響多樣性, 對群落構(gòu)成也具有顯著影響, 不同樣品量所獲得的優(yōu)勢OTUs顯著不同(Penton, 2016)。提取DNA測序所得的浮游生寡毛類和舞毛類纖毛蟲最占優(yōu)勢, 相對豐度高達46.0%, 而其在洗脫DNA中的相對豐度僅為11.8%, 獲得的OTUs多樣性明顯增加。推測增大樣品量, 提高了稀有類群的檢出效率, 從而相對削弱了沉降下來的水體纖毛蟲的DNA的影響。Ranjard等(2003)研究指出盡管微型生物分布存在異質(zhì)性, 當(dāng)樣品量大于1g時, 可較好地反應(yīng)該生境的群落構(gòu)成。

綜上, 洗脫DNA和cDNA測序可顯著降低水體纖毛蟲對沉積物中的纖毛蟲多樣性評估的影響。且洗脫DNA較之cDNA測序在實際操作中具有諸多優(yōu)勢, 尤其適用于沉積物中纖毛蟲的分子多樣性研究。首先, 相同條件下RNA降解較快, 因此較之RNA, DNA易保存(Novitsky, 1986)。其次, 洗脫的DNA可直接進行擴增測序, 技術(shù)上簡單易行, 而RNA需反轉(zhuǎn)錄成cDNA后才可擴增測序, 且反轉(zhuǎn)錄過程由于擴增偏好性, 可能會進一步降低稀有類群的檢出效率(Gonzalez, 2012)。

4 結(jié)論

DNA和cDNA測序?qū)λw中纖毛蟲分子多樣性研究的影響不顯著, 而對沉積物中纖毛蟲分子多樣性影響極顯著。沉積物中纖毛蟲多樣性高于水體, 淺層水中纖毛蟲多樣性高于深層水。淺層水中纖毛蟲對沉積物中纖毛蟲多樣性評價的影響大于深層水。洗脫DNA測序與cDNA測序結(jié)果類似, 可降低水體eDNA對沉積物中的纖毛蟲多樣性評估的影響, 且洗脫DNA法較之cDNA法操作更簡便, 避免了反轉(zhuǎn)錄過程導(dǎo)致的偏差, 適用于沉積物中的纖毛蟲等真核微生物的分子多樣性研究。

致謝 本課題組徐雨博士生采集樣品, 在此謹(jǐn)致謝忱。

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EFFECTS OF SEDIMENTATION OF DNA FROM OVERLYING WATERS ON THE EVALUATION OF CILIATE MOLECULAR DIVERSITY IN OFFSHORE SEDIMENTS

HUANG Ping-Ping1, 2, ZHAO Feng1, XU Kui-Dong1, 2

(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

A high proportion of Choreotrichia and Oligotrichia, which are typically planktonic ciliates, has been frequently detected from marine sediments by DNA high-throughput sequencing. However, few of them could be observed with the morphological method. The influence of these environmental DNA (eDNA) in waters on assessing the ciliate diversity in sediments and the extent to which ciliates linking the sediments and overlying waters are far from being known. Based on the sediment and overlying water samples collected from two stations in the Yellow Sea Cold Water Mass, the ciliate molecular diversity in sediments in relation to that in the upper water layers was evaluated by using DNA and cDNA (complementary DNA) sequencing. The DNA in sediments was extracted by directly extraction and elution methods. Results show that the highest ciliate diversity in sediments was obtained by the treatment of DNA elution, which yielded 451 OTUs. By contrast, the direction extraction of DNA and the cDNA method detected only 312 and 324 OTUs, respectively. Among them, 211 OTUs were simultaneously detected by the three methods. The DNA elution method was more effective in the detection of rare taxa. Among the 164 OTUs exclusively detected by the DNA elution method, about 89% of them were rare taxa in relative abundance lower than 0.1%. DNA sequencing with the direct extraction of DNA from the sediments yielded a high proportion of Choreotrichia and Oligotrichia, which contributed about 46% of the total sequences, while DNA sequencing with the eluted DNA and cDNA sequencing yielded only about 12% and 10% of the total sequences, respectively. About 43%—71% of the total OTUs of Choreotrichia and Oligotrichia detected from the sediments were shared with those in the upper water layers (<40m), while only 19%—29% of these OTUs were shared with those in the lower water layers (>40m). Generally, these OTUs shared in the lower water layers and sediments could be obtained in the upper water layers. The planktonic eDNA that influenced the evaluation of the molecular diversity of ciliates in sediments was mainly originated from the upper water layers. For the assessment of the sediment ciliate diversity, both cDNA sequencing and DNA sequencing with the DNA elution could highly reduce the influence of the planktonic eDNA. Therefore, DNA sequencing with the DNA elution is more appropriate for the study of molecular diversity of ciliates and other microeukaryotes in sediments. Compared with cDNA sequencing, the DNA elution method is much easier to operate and can avoid some biases resulted from reverse transcription.

ciliate; sea water; marine sediment; molecular diversity; DNA high-throughput sequencing; cDNA high-throughput sequencing

* 國家自然科學(xué)基金項目, 41876171號, 41476144號。黃平平, 博士研究生, E-mail: hpp1443461935@163.com

徐奎棟, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: kxu@qdio.ac.cn

2019-11-29,

2020-01-14

Q958

10.11693/hyhz20191100235