EB病毒gp350/220抗原T-B聯(lián)合表位生物信息學預測

彭 菁，李 蓓，吳移謀

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學衡陽醫(yī)學院病原生物學研究所， 湖南 衡陽 421001)

19世紀50年代,在非洲瘧疾流行區(qū)域,Burkitt發(fā)現(xiàn)少數(shù)兒童患有B細胞淋巴瘤;在1964年,Epstein、Achong和Barr在培養(yǎng)的Burkitt淋巴瘤細胞中觀察到一種皰疹病毒。EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)定殖于人的鼻咽部并且在上皮細胞內增殖，進一步感染B淋巴細胞，而B淋巴細胞通過血液循環(huán)到各個組織和器官，從而引起全身感染，而這些感染EBV的淋巴細胞潛伏于人體內，當自身免疫力低下時會引起一系列的臨床癥狀[1]。在不同的感染時期表達的抗原不同，如潛伏期感染主要是表達潛伏膜蛋白和核抗原，而增殖期感染主要表達EBV膜抗原和EBV衣殼蛋白等。EBV感染具有地方特點，在我國南方廣州及東南亞為鼻咽癌高發(fā)地區(qū)，而在其它一些地方如兒童初次感染EBV會引起急性淋巴組織增生性疾病也就是傳染性單核細胞增多癥，其主要的臨床表現(xiàn)為外周血中單核細胞和異型淋巴細胞大量增多[2-5]。疫苗是預防EBV感染最有效的方法，但我國研制的基因重組疫苗正在觀察中。目前對EBV感染尚缺乏肯定療效的抗病毒藥物。阿昔洛韋用藥期間，能減少EBV從咽部排毒，但不能改善傳染性單核細胞增多癥的癥狀，對免疫缺陷患者中的EBV淋巴瘤治療也無效。

防治EBV最具前景的途徑是EBV疫苗[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)EBV膜蛋白gp350/220抗原作為靶抗原既能刺激機體產生中和性抗體，也能起到體液免疫保護作用，同時通過研究發(fā)現(xiàn)gp350/220抗原能和細胞毒性T細胞發(fā)生強烈的反應[7]，說明該抗原具有T細胞表位，既能產生體液免疫又能產生細胞免疫，這樣對EBV的控制起重要作用，這進一步說明此抗原靶抗原在誘導特異性體液免疫保護的同時，還能通過細胞免疫途徑控制EBV在體內的反復增殖。目前,EBV的預防性疫苗主要是針對gp350/220的，代表性的葛蘭素史克公司研發(fā)的gp350/AS04疫苗已完成Ⅱ期臨床試驗,結果顯示，該疫苗對預防由EBV引起的傳染性單核細胞增多癥的發(fā)生有顯著的抑制作用，但仍未取得預期的理想效果。因而對EBV gp350/220氨基酸序列中的優(yōu)勢表位進行預測和篩選，將有助于研發(fā)針對EBV的高效價優(yōu)勢表位疫苗。本研究擬以EBV gp350/220氨基酸序列為基礎，利用蛋白序列分析軟件，分析gp350/220的信號肽、二級結構、B細胞表位和T細胞表位,尋找T-B聯(lián)合表位,為進一步研制高價優(yōu)勢表位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 EBV gp350/220氨基酸序列

EBV gp350/220氨基酸序列檢索來自Gen Bank，來源于B95.8細胞株，共由291個氨基酸殘基組成，蛋白質序列編號為ADN85210.1。

1.2 gp350/220氨基酸序列跨膜序列的分析

運用TMHMM Sever2.0軟件對gp350/220氨基酸序列的跨膜結構進行分析。

1.3 gp350/220抗原二級結構預測

運用SOPMA Sever軟件預測gp350/220的蛋白二級結構。

1.4 gp350/220抗原B細胞和T細胞表位預測

運用在線預測網站IEDB等參數(shù)對EBV gp350/220抗原的B細胞表位進行預測，運用SYFPEITHI在線預測對EBV gp350/220抗原的T細胞表位進行預測。

1.5 EBV gp350/220抗原T-B聯(lián)合表位的篩選

運用DNA man軟件比對篩選出EBV gp350/220抗原T-B聯(lián)合表位。

2 結 果

2.1 查找Gen bank EBV gp350/220抗原的氨基酸序列

gp350/220抗原共有291個氨基酸殘基編碼,序列為：getspqanttnhtlggtsstpvvtsppknatsavttgqhnitssst

ssmslrpssisetlspstsdnstshmplltsahptggenitqvtpaststhhvsts

spaprpgttsqasgpgnsststkpgevnvtkgtppknatspqapsgqktavp

tvtstggkansttggkhttghgartstepttdyggdsttprtrynattylppstsse

lrprwtftsppvttaqatvpvpptsqprfsnlsmlvlqwaslavltlllllvmadc

afrrnlstshtyttppyddaetyv。

2.2 運用TMHMM Sever2.0對gp350/220的跨膜序列進行分析

gp350/220的跨膜區(qū)在247-269位區(qū)域，其中1-246位區(qū)域顯示為膜外區(qū)，270-291為膜內區(qū)(圖1)。

圖1 TMHMM分析gp350/220的跨膜結構

2.3 gp350/220抗原蛋白質二級結構預測

利用SOPMA Sever對gp350/220抗原進行預測，發(fā)現(xiàn)該抗原柔性結構占氨基酸總數(shù)的87.63%(圖2)。通過對gp350/220抗原的291個氨基酸各參數(shù)預測的結果，最終確定gp350/220的潛在B細胞抗原表位區(qū)域，如表1和圖3。

圖2 SOPMA分析的gp350/220二級結構

表1 運用不同方法預測EBVgp350/220蛋白B細胞表位的肽段位置

圖3 IEDB分析的gp350/220的B細胞抗原表位A:Kolaskar & Tongaonkar Antigenicity Prediction Kolaskar & Tongaonkar的抗原性指數(shù)預測；B:Emini Surface Accessibility Prediction Emini表面可及性指數(shù)預測；C:Bepipred Linear Epitope Bepipred線性表位預測；D:Parker Hydrophilicity Prediction Parker親水性指數(shù)預測；E:Karplus & Schulz Flexibility Prediction Karplus & Schulz 柔韌性區(qū)域預測

2.4 T細胞表位預測結果

運用SYFPEITHI預測gp350/220抗原T細胞表位，在進行T細胞表位的預測后，選取了分值高的12個T細胞抗原表位，預測的結果見表2。

表2 SYFPEITHI預測的MHCⅠ類HLAA 0201限制性T細胞表位

2.5 運用DNAman軟件中的多重序列對比T、B細胞表位

T-B聯(lián)合表位為52-59 92-98 110-115，見表3。

表3 B細胞與T細胞的聯(lián)合表位

3 討 論

EBV為DNA病毒，主要感染淋巴細胞，人是該病毒的宿主，主要通過唾沫傳播，以兒童感染多見，感染之后基本都能產生抗體。EBV包膜上的gp350抗原可以與B淋巴細胞表面的細胞因子結合而感染B淋巴細胞[8]，這些細胞大量進入血液循環(huán)而造成全身性感染，并可長期潛伏在人體淋巴組織中。

目前預防EBV感染行之有效的的方法還是使用疫苗預防為主，一種制備疫苗的新型策略，即基于已知核苷酸或氨基酸序列，利用計算機軟件輔助分析，或利用噬菌體展示技術，確定和篩選可能的優(yōu)勢表位，然后人工合成或借助基因工程技術而制備含優(yōu)勢表位的多肽疫苗。

目前EBV疫苗的研究主要集中于包膜糖蛋白gp350，研究發(fā)現(xiàn)gp350于CD21結合而感染細胞且此蛋白是EBV和被感染細胞上最多的糖蛋白，同時能通過體液免疫產生抗體來預防EBV感染。李文姝等[9-12]制備了gp350重組疫苗應于臨床研究，實驗發(fā)現(xiàn)該疫苗有效保護率能夠達到78%左右，同時能夠產生EBV抗體且抗體在體內發(fā)揮保護作用時間可以長達18個月左右，說明此疫苗具有良好的抗原性和免疫原性。

近幾年來新興起來的一種重要的疫苗即重組表位疫苗[13]。本研究通過以gp350抗原的優(yōu)勢表位構建表位疫苗，其中包括B細胞表位和T細胞表位，B細胞表位(決定簇)，是由抗原表面的親水性氨基酸組成，易于接近B細胞受體(BCR)和抗體分子并被識別，一般由3～5個在空間上相鄰的、連續(xù)的或者不連續(xù)的氨基酸殘基組成。前者稱線性表位或連續(xù)表位，后者為肽鏈折疊后形成，稱為構象表位或者不連續(xù)表位。T細胞表位指被T細胞受體(T-cell receptor/TCR)識別的抗原表位，表位成分為蛋白質降解后的多肽，多存在于抗原分子內部，需要經過抗原遞呈細胞(antigen presenting cells/APC)加工后與MHC分子結合成為復合物才能被TCR識別。機體的免疫應答分為細胞免疫和體液免疫應答，在免疫應答中抗原分子表面的B細胞表位和T細胞表位分別被B、T細胞表面的BCR和TCR識別，從而誘導出高度特異性的體液免疫和細胞免疫，產生特異性的免疫效應[14-15]。

本研究通過對gp350蛋白氨基酸序列等參數(shù)的預測發(fā)現(xiàn)膜外區(qū)域和柔性區(qū)域占該蛋白的絕大部分區(qū)域，而抗原表位的形成基本在轉角及無規(guī)卷曲結構較松散,易扭曲、盤旋并展示在蛋白表面和該蛋白的膜外區(qū)域，從而有利于抗體結合，為B細胞表位提供依據。同時對gp350蛋白的T細胞表位進行預測，20分以上的T細胞表位有12個，T細胞表位，尤其是CTL表位在清除腫瘤和細胞內感染病原體的特異性免疫反應中起主要作用，而針對腫瘤抗原或感染靶細胞特定靶點的B細胞介導的體液免疫反應，則發(fā)揮如中和、調理和ADCC作用等。因此，理想的疫苗在設計上要同時考慮T細胞表位和B細胞表位。

本研究發(fā)現(xiàn)gp350蛋白的B細胞表位和T細胞表位的3個重疊區(qū)域為52-59、92-98、110-115。本研究目的是為開發(fā)具有較強的免疫原性的高效疫苗，作為理想的免疫原，抗原分子中應包含目的抗原的B細胞表位和自身或外源T細胞表位,可誘導出高度特異性的體液免疫和細胞免疫反應，同時從體液免疫和細胞免疫水平起到預防或治療作用，為進一步研制高效多價疫苗奠定理論基礎。