黑麥多酚提取物對豬肉丸冷藏期間氧化穩(wěn)定性和品質(zhì)的影響

郝教敏，楊文平，靳明凱，趙芳芳，王 凱，楊珍平*，高志強

（1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801;2.華北理工大學生命科學學院，河北 唐山 063000;3.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西 太谷 030801）

食品質(zhì)量與安全是目前人們普遍關注的問題。肉制品中脂肪和蛋白質(zhì)易發(fā)生氧化，嚴重降低了產(chǎn)品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值，通常表現(xiàn)為使產(chǎn)品變色、風味惡化、營養(yǎng)物質(zhì)破壞和可能形成有毒化合物[1-2]。因此，為控制氧化損害，在肉制品加工中，合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、沒食子酸丙酯等被廣泛使用[3-4]。但是長期使用合成抗氧化劑對人體有較大潛在的毒副作用，因此，天然抗氧化劑的開發(fā)應用已成研究熱點。天然抗氧化劑主要為多酚類化合物，廣泛存在于天然植物中，如常見的茶多酚、迷迭香提取物和一些水果多酚[4-8]。其酚羥基中的鄰位酚羥基極易被氧化，且對活性氧等自由基有較強的捕捉能力，所以具有較強的抗氧化性，其替代合成抗氧化劑是必然的趨勢[3-8]。

黑麥不但營養(yǎng)價值很高，而且富含膳食纖維、多酚類化合物和β-葡聚糖等活性物質(zhì)[9-10]。目前已有不少關于黑麥中多酚類活性物質(zhì)的報道，但主要集中于多酚的提取及其體外抗氧化性能的評估，將黑麥多酚與肉制品聯(lián)系起來的研究鮮見報道。研究表明，黑麥富含阿魏酸、植物甾醇類和木酚素等多酚類物質(zhì)，具有較強的清除自由基、抗菌、抗氧化活性，可以保護機體免受過氧化物造成的氧化損傷，防止機體細胞衰老[11-13]。本研究以混合了黑麥多酚提取物的豬肉丸為研究對象，以目前生產(chǎn)中常用的合成抗氧化劑BHT為對照，通過測定豬肉丸中硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、蛋白質(zhì)羰基含量、蛋白巰基含量和品質(zhì)變化，評價黑麥多酚對抑制豬肉丸經(jīng)4 ℃冷藏12 d后的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的效果，為黑麥多酚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑麥（Secale cerealL.）引自加拿大的‘黑引1號’品種，由山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院提供。

新鮮豬肉購自山西省太谷雙匯冷鮮肉店。

無水乙醇、沒食子酸、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯甲烷、乙二胺四乙酸鈉、BHT、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氯仿、過硫酸鉀、2,4-二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）、2-硫代巴比妥酸 國藥集團化學試劑有限公司;福林-酚、2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（2,2-diazobis(3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid)，ABTS）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、5,5-二巰基-2-硝基苯甲酸（5,5-dimercapto-2-nitrobenzoic acid，DTNB） 上海Solarbio生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;Ratavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司;PL3000真空冷凍干燥機 北京水方儀濤貿(mào)易有限公司;WFJ2100可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司;TCP2型全自動測色色差計 北京鑫奧依克光電技術有限公司;TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC公司。

1.3 方法

1.3.1 黑麥多酚提取物的制備

將黑麥全粒谷物粉碎，除殼外的所有部位全部收集，得黑麥全粉，混合均勻。稱取一定量樣品，按料液比1∶11.8溶于體積分數(shù)50%乙醇溶液中，封口，置于54 ℃恒溫水浴鍋，浸提48 min，過濾，得黑麥多酚粗提液。經(jīng)高速冷凍離心的上清液，以1 mL/min的流速通過AB-8型吸附樹脂，用體積分數(shù)70%的乙醇溶液以1 mL/min的速率洗脫。收集的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再經(jīng)冷凍干燥成粉得到黑麥多酚提取物（rye polyphenol extract，RPE）（參考文獻[14]檢測得到其總酚含量為54.6 mg/g，以每克干提取物的沒食子酸質(zhì)量計），保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 豬肉丸的制作

原料準備：豬瘦肉10 kg、豬背膘3 kg、食鹽150 g、白砂糖100 g、白胡椒粉37 g、三聚磷酸鈉30 g、亞硝酸鈉0.8 g、淀粉500 g、味精100 g。將豬瘦肉和背膘經(jīng)4 mm孔板的絞肉機絞碎，加入配料和2.7 kg水，充分攪拌均勻，制成直徑為3 cm的肉丸，80 ℃煮制20 min，放入聚丙烯托盤中用聚氯乙烯薄膜包裹，置于4 ℃冰箱冷藏。

1.3.3 實驗設計

對于4 個實驗組，在基礎配方中按豬肉質(zhì)量分別添加0.04% RPE、0.08% RPE、0.12% RPE和0.02% BHT，以基礎配方（不添加抗氧化劑）作為對照。指標測定從冷藏當天（0 d）開始，每隔3 d測定一次，每次測定重復3 次。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 抗氧化能力測定

按照文獻[15]測定抗氧化能力，并進行少量修改。將38.41 mg ABTS與5 mL 0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）混合制備ABTS溶液，將5 mL PBS與6.615 mg過硫酸鉀混合制備過硫酸鉀溶液，再將上述兩種溶液混合反應16 h共制得10 mL ABTS原液（含7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀）。用PBS稀釋所得的ABTS原液，獲得734 nm波長處吸光度為0.70±0.04的工作液。將2 g肉糜與10 mL 0.1 mol/L PBS混合，勻漿2 min，4 ℃下3 000 r/min離心5 min。取10 mL勻漿，加入90 mL稀釋的ABTS工作液，室溫靜置6 min，734 nm波長處測定吸光度。結(jié)果由Trolox的標準曲線計算得到，抗氧化能力以每克樣品的Trolox當量表示，單位為mg/g。

1.3.4.2 TBARS值的測定

參照GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》[16]中的方法測定TBARS值。

1.3.4.3 蛋白質(zhì)氧化程度的測定

羰基含量的測定采用DNPH法，參照Lampila等[17]的方法并略加修改。將2 g肉樣在10 mL 0.1 mol/L PBS（pH 7.4）中均質(zhì)，并取兩份2 mL的該溶液，分別與2 mL質(zhì)量分數(shù)20% TCA混合，11 000×g離心3 min。第一份沉淀物用于蛋白質(zhì)量濃度的測定，第二份沉淀物加入濃度為10 mmol/L的DNPH 2 mL，4 ℃靜置1 h，然后11 000×g離心3 min，棄上清液，沉淀風干后，再添加3 mL 6 mol/L鹽酸胍，50 ℃保溫45 min，在370 nm波長處測吸光度。羰基含量（以蛋白質(zhì)量計）由公式（1）計算得到。

式中：2.2×104為摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））;106為mmol/mg到nmol/mg的單位轉(zhuǎn)換系數(shù);ρ表示用鹽酸胍作空白在280 nm波長處測得的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

巰基含量的測定采用DTNB法，具體參考Eymard等[18]的方法。巰基含量由公式（2）計算得到，結(jié)果以每毫克蛋白質(zhì)中所含的游離硫醇物質(zhì)的量表示，單位為nmol/mg。

式中：1.36×104表示摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））;106為mmol/mg到nmol/mg的單位轉(zhuǎn)換系數(shù);ρ表示采用考馬斯亮藍法[19]在595 nm波長處所測得的肉樣蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4.4 色澤的測定

將不同冷藏期的豬肉丸樣品絞碎，碎肉填充于比色皿內(nèi)，壓實、抹平，保證測定表面無氣泡，用色差計測定樣品的L*、a*、b*值。

1.3.4.5 質(zhì)構(gòu)特性的測定

將豬肉丸切成2 cm的正方體樣品，采用質(zhì)構(gòu)儀在TPA模式下測定樣品的硬度、彈性、回復性及咀嚼性，每個樣品做3 次平行測定。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)：探頭型號：P/50;測定前探頭速率：5.00 mm/s;測定時探頭速率：2.00 mm/s;測定后探頭速率：5.00 mm/s;壓縮比：50%;觸發(fā)類型：自動;觸發(fā)力：5.0 g;兩次測定間隔時間：5.00 s。

1.3.4.6 感官評價

各處理組不同冷藏期的豬肉丸都在100 ℃水中煮制10 min，冷卻后切成2 cm的正方體樣品，然后由8 名專業(yè)人員對其感官特性進行評價。所有樣本是隨機編碼的盲樣本，并按照隨機順序提供給每個評價員。每個評價員被要求評價樣品表面的顏色、多汁性和酸敗味。1 分代表極度不喜歡，5 分代表既不喜歡也不討厭，9 分代表極度喜歡。給評價小組成員提供礦泉水，以清洗樣品之間的味覺，最后得分為所有成員所打的平均分。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗均重復3 次，結(jié)果用平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1軟件進行方差分析，采用Tukey HSD多重比較法進行差異顯著性分析（P＜0.05），采用SigmaPlot 14.0繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肉丸冷藏過程中的抗氧化能力變化

圖 1 豬肉丸冷藏過程中的抗氧化能力Fig. 1 Antioxidant capacity of pork meatballs during refrigerated storage

如圖1所示，添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）提高了豬肉丸的抗氧化能力，第0天0.12% RPE組抗氧化能力最高，與RPE（0.04%和0.08%）組和對照組有顯著差異（P＜0.05），但與0.02% BHT組無顯著差異（P＞0.05）。隨冷藏時間延長，各組抗氧化能力均顯著降低，但在所有時間點RPE（0.04%、0.08%、0.12%）組的抗氧化能力仍高于對照組，抗氧化能力由大到小依次為0.12% RPE組＞0.08% RPE組＞0.04% RPE組。第12天0.12% RPE組抗氧化能力最高，與0.04% RPE組和對照組有顯著差異（P＜0.05），但與0.08% RPE組和0.02% BHT組無顯著差異（P＞0.05）。冷藏期間（0～12 d）0.12% RPE組雖然抗氧化能力稍高于0.02% BHT組，但并無顯著差異（P＞0.05），二者抗氧化能力相當。

2.2 豬肉丸冷藏過程中TBARS值變化

圖 2 豬肉丸冷藏過程中的TBARS值Fig. 2 TBARS value of pork meatballs during refrigerated storage

在食品科學研究及食品保鮮或加工生產(chǎn)中，TBARS值已被廣泛用以檢測貯藏過程中食品的脂質(zhì)過氧化程度[20]。如圖2所示，豬肉丸的脂質(zhì)氧化從第0天就已發(fā)生，RPE也在第0天立即表現(xiàn)出對脂質(zhì)氧化的抑制作用，且0.12% RPE作用顯著（P＜0.05）。隨冷藏時間延長，所有處理組的TBARS值呈上升趨勢，12 d后對照組的TBARS值最高。與對照組相比，0.12% RPE在第0天、0.08% RPE在第3天即開始顯著抑制肉丸中TBARS值的增加（P＜0.05），0.04% RPE抑制作用不明顯（P＞0.05）。此外，添加0.12% RPE與0.02% BHT對豬肉丸冷藏12 d內(nèi)的脂質(zhì)氧化具有相同的保護作用。

2.3 豬肉丸冷藏過程中的蛋白質(zhì)氧化程度變化情況

蛋白質(zhì)氧化是影響肉制品品質(zhì)的另一個重要因素。脂質(zhì)氧化產(chǎn)物包括自由基、過氧化氫和次生化合物，易與硫醇、氨基酸等蛋白質(zhì)成分發(fā)生氧化反應，導致蛋白質(zhì)氧化并失去其功能[21]。蛋白質(zhì)氧化主要表現(xiàn)為肽鍵斷裂和氨基酸側(cè)鏈修飾，從而產(chǎn)生羰基化合物及其衍生物，而半胱氨酸殘基中的巰基（—SH）也極易在氧自由基攻擊下形成二硫鍵（—S—S—）[22-23]。羰基化合物的形成是氧化蛋白中最顯著的變化，其含量已被作為蛋白質(zhì)氧化的可靠指標廣泛應用于食品和生物系統(tǒng)中[24-25]。游離硫醇基是半胱氨酸殘基的巰基，其含量也是判斷組織中蛋白質(zhì)氧化程度的重要參數(shù)[26]。

2.3.1 豬肉丸羰基含量的變化

如圖3所示，第0天即存在蛋白質(zhì)氧化，且添加0.12% RPE的肉丸羰基含量顯著低于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，添加0.12% RPE從開始就顯著抑制了豬肉丸的蛋白氧化（P＜0.05），且冷藏12 d內(nèi)抑制作用均顯著（P＜0.05），說明經(jīng)0.12% RPE處理的豬肉丸蛋白氧化得到了有效抑制。隨冷藏時間延長，豬肉丸的羰基含量一直呈增加趨勢。添加0.08% RPE從第3天開始顯著減緩了羰基含量的增加（P＜0.05），而添加0.04% RPE從第9天開始也顯著減緩了羰基含量的增加（P＜0.05）。除第6、9天外，添加0.12% RPE組與0.02% BHT組的羰基含量均無顯著差異（P＞0.05），說明二者對保護豬肉丸蛋白質(zhì)氧化的作用基本相當。

圖 3 豬肉丸冷藏過程中的羰基含量Fig. 3 Protein carbonyl content of pork meatballs during refrigerated storage

2.3.2 豬肉丸中巰基含量的變化

圖 4 豬肉丸冷藏過程中的巰基含量Fig. 4 Sulfydryl contents of pork balls during refrigerated storage

如圖4所示，各處理組的巰基含量一直呈下降趨勢，對照組巰基含量降低速度最快。第0天，RPE（0.04%、0.08%、0.12%）組與對照組巰基含量無顯著差異（P＞0.05）。0.12% RPE處理從第3天開始，0.04%、0.08% RPE處理從第9天開始顯著抑制巰基水平的降低（P＜0.05），說明RPE處理可以很好地保護巰基，降低蛋白質(zhì)氧化程度。冷藏9 d后，RPE（0.04%、0.08%、0.12%）組之間及與0.02% BHT組之間的巰基水平均無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 豬肉丸在冷藏過程中的色澤變化

顏色是消費者判斷肉制品質(zhì)量的直觀依據(jù)。表1結(jié)果表明，與對照組相比，添加RPE（0.08%和0.12%）顯著提高了豬肉丸第0天的L*值（亮度）和a*值（紅度）（P＜0.05），但b*值（黃度）降低不顯著（P＞0.05）。冷藏12 d內(nèi)，添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）均不同程度抑制了豬肉丸L*、a*值的降低和b*值的增加，但只有添加0.12% RPE起到了顯著穩(wěn)定肉色的作用（P＜0.05），且與0.02% BHT作用相當（P＞0.05）。

表 1 豬肉丸冷藏過程中的色澤Table 1 Color values of pork meatballs during refrigerated storage

肉類的顏色與肌肉組織中的肌紅蛋白直接相關，氧合肌紅蛋白的存在是肉類呈鮮紅色的主要原因，當氧合肌紅蛋白中血紅素所含的二價鐵被氧化為三價鐵時，肉就會發(fā)生褐變。因此，二價鐵肌紅蛋白的保持程度直接決定肉類顏色的穩(wěn)定性。顏色變化是由氧化反應引起的，添加具有抗氧化活性的物質(zhì)即可抑制顏色的變化[27]。脂肪氧化會促進肌紅蛋白的氧化，因而多酚提取物還能通過抑制脂肪氧化達到穩(wěn)定肉色的目的[5]。

2.5 豬肉丸冷藏過程中的質(zhì)構(gòu)特性

如表2所示，所有處理組硬度隨冷藏時間延長均呈先升高后降低的趨勢，12 d冷藏期內(nèi)，添加RPE（0.04%和0.08%）的豬肉丸硬度與對照組相比沒有顯著差異，而添加0.12% RPE的肉丸硬度9 d后才顯著高于對照組（P＜0.05），說明RPE對豬肉丸的硬度影響不大。添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）對豬肉丸的彈性沒有顯著影響（P＞0.05）。除第3天外，添加0.12% RPE的豬肉丸回復性均顯著高于對照組（P＜0.05），而添加RPE（0.04%和0.08%）對肉丸回復性沒有顯著影響（P＞0.05）。與對照組相比，添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）的豬肉丸咀嚼性從第6天開始均顯著提高（P＜0.05），添加0.12% RPE的豬肉丸咀嚼性在第0天即顯著提高（P＜0.05）。

肉制品的質(zhì)構(gòu)特性與其本身所含的蛋白質(zhì)、脂肪和水分有著密切聯(lián)系。水分和脂肪的存在有利于維持肉制品質(zhì)構(gòu)的穩(wěn)定，而蛋白質(zhì)構(gòu)成的框架能夠鎖住水分和脂肪，蛋白質(zhì)氧化導致羰基含量增加、蛋白質(zhì)交聯(lián)，脂肪氧化破壞肌纖維膜的完整性，兩者均會造成肉制品水分和脂肪流失，從而影響肉制品的質(zhì)構(gòu)特性[28-29]。研究表明，植物提取物可以通過抑制肉類脂肪和蛋白質(zhì)氧化來改善肉制品的質(zhì)構(gòu)特性[30]。

表 2 豬肉丸冷藏過程中的質(zhì)構(gòu)特性Table 2 Texture characteristics of pork meatballs during refrigerated storage

2.6 豬肉丸感官評價結(jié)果

表 3 豬肉丸冷藏過程中的感官評分Table 3 Sensory scores of pork meatballs during refrigerated storage

如表3所示，第0天所有處理組的表面顏色、多汁性和酸敗味評分均無顯著差異（P＞0.05）。與對照組相比，第9天，添加RPE（0.08%和0.12%）的豬肉丸顏色和酸敗味評分顯著提高（P＜0.05），添加0.12% RPE的豬肉丸多汁性評分顯著提高（P＜0.05）。冷藏12 d內(nèi)，添加0.12% RPE與0.02% BHT的豬肉丸的所有感官品質(zhì)（表面顏色、多汁性和酸敗味）評分均無顯著差異（P＞0.05）。

3 結(jié) 論

本實驗將添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）的豬肉為原料制成肉丸，放入冰箱（4 ℃）冷藏12 d，以目前常用的合成抗氧化劑BHT作陽性對照，以不添加抗氧化劑的產(chǎn)品作空白對照，研究了RPE對豬肉丸冷藏過程中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的抑制作用。結(jié)果表明，添加RPE的豬肉丸具有較高的抗氧化能力;添加RPE（0.08%和0.12%）可顯著降低TBARS值，顯著降低羰基含量和提高巰基含量;0.12% RPE和0.02% BHT在抑制豬肉丸脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化方面作用相當。

此外，探討了RPE對豬肉丸在冷藏過程中品質(zhì)變化的影響。與對照組相比，添加0.12% RPE顯著提高了豬肉丸的L*值和a*值，降低了b*值;經(jīng)RPE（0.04%、0.08%、0.12%）處理的豬肉丸咀嚼性明顯改善，而對硬度和彈性影響不大，添加0.12% RPE明顯改善了豬肉丸的回復性和冷藏后期的感官品質(zhì);冷藏12 d內(nèi)，0.12% RPE與0.02% BHT對豬肉丸品質(zhì)的影響無顯著差異。研究結(jié)果表明，RPE作為一種天然抗氧化劑，具有良好的抗氧化性能和替代合成抗氧化劑（0.02% BHT）的潛力，可在改善或不降低品質(zhì)的前提下延長產(chǎn)品的貨架期，在生產(chǎn)功能改良的健康肉制品方面具有很大的應用潛力。