葡萄籽原花青素對順鉑誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4細(xì)胞凋亡的影響

杜月梅，韓何丹，郭卓雨，高麗萍,*

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023;2.生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實驗室，北京 100191）

順鉑（cisdichlorodiamineplatinum (II)，cDDP）是最有效的抗腫瘤藥物之一[1-3]，廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療[4]，如睪丸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌等[5-8]，但由于對人體眾多器官具有毒副作用[9-11]，因此，限制了它在醫(yī)療方面的應(yīng)用。研究表明，cDDP的不良反應(yīng)主要為對睪丸損傷及腎毒性[12-13]，更有甚者，許多男性使用者出現(xiàn)了不育的癥狀，cDDP誘發(fā)睪丸細(xì)胞凋亡參與cDDP對睪丸的損傷作用[14]。

葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）是從葡萄籽中分離提取出的一種天然的具有生物類黃酮活性的多酚化合物[15]，具有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗輻射、抗衰老等廣泛的作用[16-17]。其中，由于其結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，更使得它能有效清除氧化物和自由基，表現(xiàn)出極好的抗氧化作用。除此之外，GSPE在抗腫瘤方面也備受社會關(guān)注[16]，研究表明，GSPE可以誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡[18-20]。

本課題組前期研究結(jié)果表明，GSPE對cDDP所導(dǎo)致的生殖毒性及腎毒性具有較好的保護(hù)作用，GSPE可顯著抑制cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞氧化損傷作用[21-23]，而對TM4細(xì)胞凋亡的研究鮮見報道，因此本研究運(yùn)用cDDP造模，通過測定GSPE對cDDP所致TM4細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)量的影響，探究GSPE對cDDP所致TM4細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。以期為GSPE應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)，為男性癌癥患者提供有效的化療輔助品及減少cDDP應(yīng)用于臨床化療的局限性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TM4正常小鼠睪丸支持細(xì)胞，由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供。

葡萄籽原花青素提取物 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司;新生牛血清及DMEM/F12培養(yǎng)液 美國Gibco公司;胰蛋白酶、噻唑藍(lán) 美國Sigma公司;兔抗Bcl-2（N19）多克隆抗體、兔抗Bax（P-19）多克隆抗體、兔抗Caspase-3（H-277）多克隆抗體 中杉金橋生物技術(shù)公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G（H+L） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 南京碧云天生物研究所;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒北京寶賽生物技術(shù)有限公司;高效化學(xué)發(fā)光（efficient chemiluminescence，ECL）試劑盒 美國Genview公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FACS Calibar流式細(xì)胞儀 美國BD公司;電泳儀美國Bio-Rad公司;ImageQuant RT ECL凝膠成像系統(tǒng)美國通用電氣公司。

1.3 方法

1.3.1 TM4細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞孵育在DMEM/F12（含10%新生牛血清、1%青霉素-鏈霉素）的混合培養(yǎng)基中，并置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時，用胰酶消化，按照1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2 cDDP對TM4細(xì)胞生長的影響

將細(xì)胞（1×105個/mL）接種于96 孔板，每孔200 μL。待細(xì)胞生長到融合狀態(tài)，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入200 μL含不同終質(zhì)量濃度cDDP（0（空白對照組）、0.000 75、0.001 5、0.003、0.006、0.012、0.048、0.096、0.192 mg/mL）的無血清培養(yǎng)基。每組設(shè)置6 個平行，培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液，各孔加入200 μL終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL噻唑藍(lán)，繼續(xù)孵育4 h后，棄廢液并加入二甲基亞砜（150 μL/孔），充分混勻10 min，用酶標(biāo)儀檢測其吸光度（測定波長570 nm、參比波長630 nm）。以不加cDDP為空白對照，按式（1）計算細(xì)胞抑制率。依據(jù)抑制率計算cDDP對TM4細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），并作為后續(xù)實驗參照依據(jù)。

式中：A1為實驗組上清液的吸光度;A0為空白對照組上清液的吸光度。

1.3.3 GSPE對TM4細(xì)胞生長的影響

同1.3.2節(jié)的方法，將cDDP換成不同質(zhì)量濃度的GSPE（0（空白對照）、0.001、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000、1.500、2.000 mg/mL），計算細(xì)胞存活率。

1.3.4 GSPE對cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

將200 μL（1×105個/mL）TM4細(xì)胞接種至96 孔板，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，設(shè)定空白對照組（加入同等體積無血清培養(yǎng)液）;cDDP模型組（0.014 mg/mL）;GSPE+cDDP實驗組（加cDDP前2 h加入不同終質(zhì)量濃度GSPE，使GSPE終質(zhì)量濃度分別為：0.001、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.250 mg/mL;cDDP終質(zhì)量濃度為0.014 mg/mL），于37 ℃、含5% CO2孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用噻唑藍(lán)法測定吸光度，計算GSPE對CDDP所致TM4細(xì)胞存活率變化量，每組6 個復(fù)孔。

1.3.5 TM4細(xì)胞凋亡率的檢測

按照1.3.4節(jié)結(jié)果將細(xì)胞分成4 個組：TM4空白對照組（即僅使用不含牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞）;cDDP模型組（0.014 mg/mL）;GSPE+cDDP實驗組（0.005 mg/mL+0.014 mg/mL）;GSPE對照組（0.005 mg/mL）。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集各實驗組細(xì)胞，按照試劑盒的說明，經(jīng)Annexin V-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后，用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.3.6 TM4細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的測定

根據(jù)1.3.1節(jié)和1.3.5節(jié)所述的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、實驗分組和對細(xì)胞進(jìn)行藥物處理后，將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長至80%左右時將細(xì)胞進(jìn)行固定，應(yīng)用Hoechst染色，用顯微成像系統(tǒng)拍攝和保存圖像，比較各組細(xì)胞生長形態(tài)的差異。

1.3.7 Western blot蛋白印跡法對TM4細(xì)胞凋亡基因的測定

提取并收集各實驗組細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。取總蛋白50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和轉(zhuǎn)膜。按100 V恒濃縮膠電壓，120 V恒分離膠電壓進(jìn)行電泳。用100 V恒壓、冰浴轉(zhuǎn)膜1.5 h，PBST清洗后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再用PBST洗3 次，加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，PBST洗3 次后加入二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，再用PBST洗3 次，ECL應(yīng)用液顯影，拍照，以β-actin（1∶500）為內(nèi)參，用凝膠圖像分析軟件掃描，測定蛋白條帶的灰度。按式（2）計算蛋白相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，分別測定cDDP、GSPE對TM4細(xì)胞的IC50，并應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較（檢驗水平α=0.01），兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，劑量依賴效應(yīng)分析采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDDP對TM4細(xì)胞生長的抑制作用

圖 1 cDDP對TM4細(xì)胞的毒性作用Fig. 1 Cytotoxic effect of cDDP on TM4 cells

用不同質(zhì)量濃度的cDDP處理TM4細(xì)胞24 h，如圖1所示，隨著cDDP終質(zhì)量濃度的增大，對TM4細(xì)胞的抑制率逐漸升高，各質(zhì)量濃度cDDP對TM4細(xì)胞抑制率與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。cDDP對TM4細(xì)胞IC50為（0.014 0±0.000 3）mg/mL，因此選擇0.014 mg/mL質(zhì)量濃度的cDDP用于后續(xù)實驗。

2.2 GSPE對TM4細(xì)胞生長的影響

圖 2 GSPE對TM4細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of GSPE on survival rate of TM4 cells

如圖2所示，隨GSPE終質(zhì)量濃度的升高，TM4細(xì)胞存活率逐漸增高，在GSPE終質(zhì)量濃度為0.010 mg/mL時，TM4細(xì)胞存活率達(dá)到最高，此后隨GSPE終質(zhì)量濃度增加，TM4細(xì)胞存活率逐漸降低。當(dāng)GSPE終質(zhì)量濃度高于0.500 mg/mL時，TM4細(xì)胞存活率顯著低于空白對照組，即高質(zhì)量濃度GSPE對TM4細(xì)胞生長具抑制作用。不同終質(zhì)量濃度GSPE對TM4細(xì)胞存活率與空白對照組（GSPE終質(zhì)量濃度為0 mg/mL）相比，存在極顯著差異（P＜0.01）。由此數(shù)據(jù)計算得到GSPE單獨(dú)作用24 h對TM4細(xì)胞的IC50為（0.956 0±0.001 2）mg/mL。

2.3 GSPE對cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

用終質(zhì)量濃度為0.014 mg/mL的cDDP建立TM4細(xì)胞損傷模型，用不同終質(zhì)量濃度的GSPE提前24 h處理TM4細(xì)胞。結(jié)果如圖3所示，與cDDP模型組對比，cDDP+GSPE組細(xì)胞存活率極顯著提高（P＜0.01），但隨著GSPE質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞存活率先升高后降低。這表明cDDP對TM4細(xì)胞有明顯的抑制作用，而在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，GSPE對cDDP所致細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，0.005 mg/mL的GSPE保護(hù)效果最佳。

圖 3 GSPE對cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞毒性的保護(hù)作用Fig. 3 Protective effect of GSPE against cDDP-induced cytotoxicity on TM4 cells

2.4 各組TM4細(xì)胞凋亡率變化

圖 4 各組TM4細(xì)胞凋亡率的變化Fig. 4 Changes in TM4 cell apoptosis rate in each group

組別 早期凋亡率/% 中晚期凋亡率/% 死亡率/%

表 1 GSPE對cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡率的影響Table 1 Effect of GSPE on cisplatin-induced apoptosis of TM4 cells

由圖4和表1可知，cDDP可造成TM4細(xì)胞各時期凋亡率及死亡率升高，與空白對照組相比較具有極顯著性差異;若細(xì)胞先經(jīng)GSPE提前作用2 h，再由cDDP誘導(dǎo)作用24 h，則此時TM4細(xì)胞凋亡率增高的程度明顯降低，表明終質(zhì)量濃度為0.005 mg/mL的GSPE對0.014 mg/mL的cDDP所誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡具有很好的拮抗作用，對TM4細(xì)胞起到保護(hù)作用，提示GSPE可能參與調(diào)控cDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞的凋亡途徑。

2.5 各組TM4細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

圖 5 GSPE對cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡Hoechst染色形態(tài)變化（×100）Fig. 5 Effect of GSPE on cDDP-induced morphological changes of TM4 cells evaluated by Hoechst staining (× 100)

由圖5可知，空白對照組細(xì)胞呈疏散狀，發(fā)出均勻熒光，熒光亮度較淺，呈淺藍(lán)色;cDDP模型組多數(shù)細(xì)胞變圓、與臨近細(xì)胞相分離，大量細(xì)胞已脫壁，貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染的顆粒狀高亮熒光物，熒光強(qiáng)度與正常細(xì)胞相比較明顯增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞明顯增多;GSPE對照組細(xì)胞貼壁緊密，細(xì)胞呈均勻淺藍(lán)色熒光，其染色形態(tài)與空白對照組相似，無明顯變化;GSPE+cDDP實驗組細(xì)胞脫壁現(xiàn)象較cDDP模型組明顯減少，細(xì)胞多數(shù)貼壁生長，胞體變圓現(xiàn)象遠(yuǎn)少于cDDP模型組，與cDDP模型組相比較細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染的顆粒狀熒光明顯減少。結(jié)果表明，終質(zhì)量濃度為0.005 mg/mL的GSPE對0.014 mg/mL的cDDP所誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變具有很好的拮抗作用。

2.6 各組TM4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

圖 6 GSPE對cDDP所致TM4細(xì)胞各蛋白表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of GSPE on apoptosis-related protein expression in cDDP-induced TM4 cells

圖 7 GSPE對cDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞內(nèi)Bcl-2相對表達(dá)量的影響Fig. 7 Effect of GSPE on cDDP-induced relative expression of Bcl-2 in TM4 cells

如圖6、7所示，終質(zhì)量濃度為0.014 mg/mL的cDDP作用于TM4細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2相對表達(dá)量（28.91±1.07）%與空白對照組（52.30±3.14）%相比顯著降低（P＜0.01）;若細(xì)胞先經(jīng)GSPE提前作用2 h，再由cDDP誘導(dǎo)作用24 h，則此時細(xì)胞內(nèi)Bcl-2相對表達(dá)量（（38.43±1.12）%）與cDDP模型組相比極顯著升高（P＜0.01）;0.005 mg/mL的GSPE單獨(dú)作用于TM4細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)Bcl-2相對表達(dá)量（54.92±2.81）%與正常TM4細(xì)胞內(nèi)Bcl-2相對表達(dá)量不存在顯著性差異。

如圖6、8所示，終質(zhì)量濃度為0.014 mg/mL的cDDP作用于TM4細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)Bax相對表達(dá)量（73.82±4.53）%與空白對照組（10.73±0.26）%相比極顯著增高（P＜0.01）;若細(xì)胞先經(jīng)GSPE提前作用2 h，再由cDDP誘導(dǎo)作用24 h，則此時細(xì)胞內(nèi)Bax相對表達(dá)量（36.44±3.13）%與cDDP模型組相比極顯著降低（P＜0.01）;0.005 mg/mL的GSPE單獨(dú)作用于TM4細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)Bax相對表達(dá)量（（9.75±1.42）%）與正常TM4細(xì)胞內(nèi)Bax相對表達(dá)量不存在顯著性差異。

圖 8 GSPE對cDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞內(nèi)Bax相對表達(dá)量的影響Fig. 8 Effect of GSPE on cDDP-induced relative expression of Bax in TM4 cells

圖 9 GSPE對cDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞內(nèi)Pro-caspase 3相對表達(dá)量的影響Fig. 9 Effect of GSPE on cDDP-induced relative expression of pro-caspase 3 in TM4 cells

如圖6、9所示，終質(zhì)量濃度為0.014 mg/mL的cDDP作用于TM4細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)Pro-caspase 3相對表達(dá)量（31.13±0.94）%與空白對照組（70.21±2.82）%相比極顯著降低（P＜0.01）;若細(xì)胞先經(jīng)GSPE提前作用2 h，再由cDDP誘導(dǎo)作用24 h，則此時細(xì)胞內(nèi)Pro-caspase 3相對表達(dá)量（40.36±2.43）%與cDDP模型組相比極顯著升高（P＜0.01）;0.005 mg/mL的GSPE單獨(dú)作用于TM4細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)Pro-caspase 3相對表達(dá)量（（74.93±3.25）%）與正常TM4細(xì)胞內(nèi)Bax相對表達(dá)量不存在顯著性差異。

如圖6、10所示，終質(zhì)量濃度為0.014 mg/mL的cDDP作用于TM4細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3相對表達(dá)量（27.35±1.54）%與空白對照組（13.76±0.71）%相比極顯著增高（P＜0.01）;若細(xì)胞先經(jīng)GSPE提前作用2 h，再由cDDP誘導(dǎo)作用24 h，則此時細(xì)胞內(nèi)Caspase-3相對表達(dá)量（15.64±0.86）%與cDDP模型組相比極顯著降低（P＜0.01）;0.005 mg/mL的GSPE單獨(dú)作用于TM4細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)Caspase-3相對表達(dá)量（（14.37±0.33）%）與正常TM4細(xì)胞內(nèi)Caspase-3相對表達(dá)量不存在顯著性差異。

圖 10 GSPE對cDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白相對表達(dá)量的影響Fig. 10 Effect of GSPE on cDDP-induced relative expression of caspase-3 protein in TM4 cells

表 2 GSPE對cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 2 Effects of GSPE on the expression of apoptosis-related proteins in TM4 cells induced by cDDP

表2為GSPE對cDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞各蛋白表達(dá)變化情況，實驗結(jié)果表明，GSPE（0.005 mg/mL）可有效拮抗cDDP（0.014 mg/mL）誘導(dǎo)TM4細(xì)胞細(xì)胞凋亡，顯著增強(qiáng)Bcl-2、Pro-caspase 3表達(dá)，極顯著抑制Bax、Caspase-3表達(dá)（P＜0.01）;0.005 mg/mL GSPE單獨(dú)作用于TM4細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)各基因表達(dá)量與正常TM4細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)量均不存在顯著性差異。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)GSPE終質(zhì)量濃度濃度為0.005 mg/mL時，對cDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞毒性有明顯的抑制作用，而其他研究結(jié)果表明，cDDP可能通過氧化應(yīng)激的形式對睪丸支持細(xì)胞造成損傷[24]。當(dāng)睪丸支持細(xì)胞出現(xiàn)基因缺陷時，精子無法正常生成[25]，從而造成男性不育的癥狀。cDDP所造成的細(xì)胞毒性最終可以引起細(xì)胞凋亡和脹亡[22]。本研究結(jié)果也顯示，cDDP可顯著促進(jìn)TM4細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞凋亡是由多基因調(diào)控和多個分子參與的復(fù)雜有序的過程，細(xì)胞是否發(fā)生凋亡與某些凋亡相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。cDDP可通過引起細(xì)胞氧化損傷，誘發(fā)細(xì)胞毒性，啟動線粒體途徑和死亡受體途徑而引起細(xì)胞凋亡[26]。在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2和Caspase家族發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Bcl-2家族是對Caspases激活進(jìn)行調(diào)控的一類重要蛋白因子，根據(jù)功能分為兩類：一類是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，如Bcl-XL、Bcl-2;另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，如Bax等。Bcl-2屬原癌基因，編碼26×103的線粒體膜蛋白，是最重要的凋亡抑制基因[27]。Bax與Bcl-2蛋白相對表達(dá)量的比值是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[28]，其比值增加將會促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，cDDP是先誘導(dǎo)Bax分子激活，再使線粒體膜通透性增加，線粒體釋放細(xì)胞色素c、激活Caspase 9，從而啟動線粒體介導(dǎo)的凋亡[29]。在誘導(dǎo)凋亡作用下，Bax構(gòu)象發(fā)生改變，疏水部分暴露，使其從胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體，Bax寡聚化在線粒體外膜上形成小孔，使細(xì)胞色素c釋放，后者激活Caspases，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2可通過阻止Bax從胞漿到線粒體轉(zhuǎn)移而拮抗Bax的功能抑制細(xì)胞凋亡[30]。有研究顯示，Bcl-2表達(dá)量增多時可顯著抑制cDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，是p38MAPK實現(xiàn)誘導(dǎo)凋亡的重要細(xì)胞因子[31]，其中活化型Caspase-3是caspase家族參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Caspase級鏈反應(yīng)最終效應(yīng)子，是各種凋亡刺激因子激活Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶[32]。cDDP誘發(fā)細(xì)胞凋亡致使Caspase-3活性增強(qiáng)[33]。通常情況下，Caspase-3處于抑制狀態(tài)，即以沒有活性的酶原形式Pro-caspase 3存在于胞漿中，而當(dāng)細(xì)胞遭受損傷時，Caspase-3則會被激活而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，此時酶原狀態(tài)Pro-caspase 3的量則減少。

GSPE是具有生物類黃酮活性的一大類多酚化合物，是國際公認(rèn)的最能有效清除體內(nèi)自由基的天然多酚類物質(zhì)，由不同數(shù)量的黃烷-3-醇單元（即由（表）兒茶素、表棓兒茶素或表兒茶素沒食子酸酯）縮合而成。微核實驗（實驗小鼠每日攝入2 000 mg/（kgmb·d）GSPE）和Ames實驗（實驗菌株中GSPE含量為500 μg/平板）結(jié)果顯示，GSPE無致畸和致突變性[34-35]。除此之外，GSPE對多種癌細(xì)胞都有不同程度的抑制作用，例如，GSPE不僅可以抑肺癌、乳腺癌、前列腺癌、口腔上皮癌和慢性骨髓白血病等多種類型腫瘤細(xì)胞生長，還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。而且，GSPE還具有抗正常細(xì)胞凋亡的作用，主要應(yīng)用于細(xì)胞過度凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞減少性疾病，如心肌缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病等。本實驗室前期已研究證明GSPE可通過調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)拮抗cDDP對TM4細(xì)胞的氧化損傷作用，本研究則從細(xì)胞凋亡角度進(jìn)一步探究GSPE對cDDP所致TM4細(xì)胞毒性作用的影響，研究結(jié)果顯示GSPE可明顯抑制cDDP誘發(fā)的小鼠睪丸支持細(xì)胞凋亡，同時cDDP單獨(dú)用藥后，TM4細(xì)胞內(nèi)Bcl-2相對表達(dá)量以及處于酶原狀態(tài)Pro-caspase 3的相對表達(dá)量顯著降低，而Bax和處于激活狀態(tài)的Caspase-3相對表達(dá)量明顯增加，提示Bcl-2、Bax、Caspase-3等基因參與cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡在cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞毒性過程中起重要作用。GSPE拮抗因cDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡其確切的分子機(jī)制目前仍不明確，其中一個可能的解釋即為GSPE對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。本研究結(jié)果顯示GSPE可明顯降低Bax以及Caspase-3的蛋白表達(dá)量，增加Bcl-2和Pro-caspase 3的蛋白表達(dá)量，阻抑cDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，GSPE提前作用TM4細(xì)胞后，對cDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax及Caspase-3的蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用而實現(xiàn)的。