超聲輔助提取款冬總黃酮工藝及抗氧化活性研究

陳蘇丹，汪亞祺，李秀珍，李學(xué)強(qiáng)

(河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南 洛陽 471023)

0 引言

款冬(TussilagofarfaraL.)為菊科千里光族款冬屬的多年生藥用草本植物，別名冬花、看燈花、九九花等，是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥材[1]?？疃曰ɡ偃胨?，其性溫味辛，具有潤(rùn)肺下氣、化痰止咳[2]的功效。臨床用于治療咳嗽痰多、新久咳嗽、支氣管炎、肺結(jié)核和咳吐膿血等癥[3]，藥用價(jià)值突出。

近年的研究表明：款冬的主要化學(xué)成分有萜類、黃酮類、多糖、有機(jī)酸、揮發(fā)油和生物堿類等[4]。其中，款冬中的黃酮類化合物含量較高且種類豐富[5]，主要以苷類形式存在，具有抗菌消炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、清熱解毒、降壓、利尿、強(qiáng)心鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[6]，是款冬發(fā)揮藥效的一種重要生物活性成分[7]。目前，對(duì)款冬總黃酮的研究多集中于分離純化[8-9]、含量測(cè)定[10]、微波法輔助提取[11]、提取優(yōu)化及降脂作用[12]等方面，而利用超聲輔助法提取款冬總黃酮的報(bào)道很少。由于超聲波具有特殊的生物效應(yīng)，選擇合適的超聲參數(shù)能使植物的細(xì)胞壁間形成較多的小孔[13]，從而增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性及選擇性[14]，現(xiàn)已廣泛用于提取植物中的生物活性成分[15]。本文采用超聲輔助法提取款冬總黃酮，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究，以期為款冬的充分開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為款冬花蕾，于2019年1月在河南省三門峽市盧氏縣采集，將花蕾去除花梗和泥沙，陰干。粉碎后過60目篩，干粉備用。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·)、維生素C、無水乙醇、濃鹽酸、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取2.5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容至25 mL，得0.1 mg·mL-1的蘆丁溶液。分別移取蘆丁溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL置于10 mL試管中，加入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))亞硝酸鈉溶液0.5 mL后靜置6 min；加入10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鋁溶液0.5 mL后靜置6 min；加入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液4 mL，用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液定容后靜置15 min。以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白對(duì)照。在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定樣品的各吸光值[16]，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=18.711X-0.000 3，r2=0.999 1，表明蘆丁在0.008 3～0.047 9 mg·mL-1線性關(guān)系良好，可用于款冬總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定。

1.2 款冬總黃酮提取率的測(cè)定

精密稱取0.5 g款冬花蕾粉末置于50 mL的三角瓶中，在所設(shè)定的條件下進(jìn)行超聲(超聲功率500 W)輔助提取，提取完成后趁熱過濾，濾渣沖洗3次，濾液置于100 mL容量瓶中，用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇定容，得供試液，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光值。按以下公式計(jì)算款冬總黃酮提取率：

(1)

其中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的款冬總黃酮質(zhì)量濃度，mg·mL-1；N為稀釋倍數(shù)；V為定容體積，mL；M為款冬花蕾干粉的的質(zhì)量，g。

1.3 款冬總黃酮提取工藝的單因素試驗(yàn)

在超聲時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min的條件下比較提取效果，超聲溫度為50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比(體積比，下同)為1∶35。確定超聲時(shí)間為40 min的提取效果較好后，在超聲溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的條件下比較提取效果，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶35。確定超聲溫度為50 ℃的提取效果較好后，在料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40的條件下比較提取效果，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲時(shí)間為40 min。確定料液比為1∶35的提取效果較好后，選擇在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%和90%的條件下比較提取效果，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為50 ℃，從而確定各因素的最佳水平。

1.4 款冬總黃酮提取工藝的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)和超聲時(shí)間(D)為考察因素，以款冬總黃酮的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)L9(34)選取最優(yōu)提取工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.5 方法重現(xiàn)性試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證經(jīng)過數(shù)據(jù)方差分析所得的最優(yōu)工藝條件的穩(wěn)定性和可靠性，在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行款冬總黃酮提取率測(cè)定試驗(yàn)，同時(shí)做5個(gè)平行樣品，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 款冬總黃酮的抗氧化活性研究

分別配制質(zhì)量濃度為0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1和0.06 mg·mL-1的款冬總黃酮提取液，參照文獻(xiàn)[17-19]，測(cè)定其對(duì)DPPH·、羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS20軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)款冬總黃酮提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)款冬總黃酮提取率的影響見圖1。由圖1可知：超聲時(shí)間為10～40 min時(shí)，款冬總黃酮提取率的增加較為明顯。當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，款冬總黃酮的提取率最高，為6.59%。當(dāng)超聲時(shí)間為50 min時(shí)，款冬總黃酮提取率下降至5.48%?？赡茉蚴牵撼晻r(shí)間較短時(shí)，款冬總黃酮提取不充分；延長(zhǎng)超聲時(shí)間，款冬總黃酮?jiǎng)t不斷地溶出并進(jìn)入溶液，從而提高了提取率。但經(jīng)過一定的提取時(shí)間后，款冬總黃酮已基本溶出，若超聲時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使款冬中大量非黃酮類物質(zhì)溶出，導(dǎo)致總黃酮的提取率降低，耗能增加。

2.1.2 超聲溫度對(duì)款冬總黃酮提取率的影響

超聲溫度對(duì)款冬總黃酮提取率的影響見圖2。由圖2可以看出：在超聲溫度為30～50 ℃時(shí)，隨著超聲溫度的提高，款冬總黃酮的提取率逐漸增加，從4.41%升高至6.06%。而超聲溫度進(jìn)一步升高到60 ℃和70 ℃時(shí)，款冬總黃酮提取率則呈下降趨勢(shì)。分析其原因，可能是總黃酮在乙醇溶液中的溶解度隨著超聲溫度的升高而增加，當(dāng)溫度升高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)會(huì)加快，擴(kuò)散速率增加，使得總黃酮的提取率增加。但超聲溫度過高時(shí)，會(huì)破壞總黃酮的結(jié)構(gòu)，使總黃酮的活性受到影響，同時(shí)增加了非黃酮類物質(zhì)的溶出量，因此，造成款冬總黃酮的提取率下降。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)款冬總黃酮提取率的影響

圖2 超聲溫度對(duì)款冬總黃酮提取率的影響

2.1.3 料液比對(duì)款冬總黃酮提取率的影響

料液比對(duì)款冬總黃酮提取率的影響見圖3。由圖3可知：在料液比為1∶20～1∶35時(shí)，隨著料液比的減小，款冬總黃酮的提取率呈增加趨勢(shì)，說明溶劑用量的增多有利于款冬黃酮類物質(zhì)的溶出。當(dāng)料液比為1∶35時(shí)，款冬總黃酮提取率最大，為6.68%。之后，隨著溶劑用量進(jìn)一步增加，料液比為1∶40時(shí)，款冬總黃酮提取率下降為6.23%。分析其原因，可能是由于款冬中的醇溶性與脂溶性雜質(zhì)溶出量隨溶劑用量的增加而增多，影響黃酮類物質(zhì)的溶出，從而降低款冬總黃酮的提取率。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)款冬總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)款冬總黃酮提取率的影響見圖4。由圖4可知：款冬總黃酮的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而明顯增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，款冬總黃酮的提取率達(dá)到最高，為6.46%。而隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提高，款冬總黃酮的提取率則不斷下降。這表明，在乙醇體積分?jǐn)?shù)較低的情況下，醇溶性物質(zhì)的溶出量會(huì)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，款冬總黃酮提取率也隨之增大。但若乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，款冬中的一些醇溶性和脂溶性雜質(zhì)溶出量增加，溶液的黏度增大，款冬總黃酮向溶劑中的擴(kuò)散阻力增大，擴(kuò)散減慢，提取率下降。

圖3 料液比對(duì)款冬總黃酮提取率的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)款冬總黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

經(jīng)超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)等單因素試驗(yàn)，確定款冬總黃酮提取的最優(yōu)條件，采用L9(34)正交試驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析如表2所示。正交試驗(yàn)的極差(R)表現(xiàn)為A>C>B>D，表明各因素對(duì)款冬總黃酮提取率的影響順序由大到小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲溫度>料液比>超聲時(shí)間。款冬總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件組合為A3B3C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶40，超聲溫度為50 ℃，超聲時(shí)間為50 min。由于正交試驗(yàn)中沒有出現(xiàn)此最優(yōu)組合，因此要對(duì)所得的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。重復(fù)5次款冬總黃酮提取率測(cè)定試驗(yàn)，測(cè)得款冬總黃酮提取率為8.02%，高于表2中最高的總黃酮提取率(7.50%)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.79%，證明該工藝條件穩(wěn)定可行，適用于款冬總黃酮的提取。

根據(jù)方差分析的結(jié)果可知：A(乙醇體積分?jǐn)?shù))和C(超聲溫度)對(duì)款冬總黃酮的提取率有顯著影響(P<0.05)，而B(料液比)和D(超聲時(shí)間)對(duì)款冬總黃酮提取率影響不顯著。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.3 款冬總黃酮抗氧化活性分析

圖5 款冬總黃酮和維生素C對(duì)DPPH·的清除作用

款冬總黃酮和維生素C對(duì)DPPH·的清除作用見圖5。圖5表明：當(dāng)款冬總黃酮的質(zhì)量濃度為0.02～0.06 mg·mL-1時(shí)，隨著款冬總黃酮質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)DPPH·的清除率逐漸升高，清除率與款冬總黃酮質(zhì)量濃度之間存在一定的量效關(guān)系。當(dāng)款冬總黃酮的質(zhì)量濃度為0.06 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到最高，為81.03%。雖然款冬總黃酮清除DPPH·的能力稍弱于維生素C清除DPPH·的能力，但款冬總黃酮依舊表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH·的能力，說明所提取的款冬總黃酮具有較好的抗氧化能力。款冬總黃酮和維生素C對(duì)·OH的清除作用見圖6。由圖6可以看出：款冬總黃酮對(duì)·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。當(dāng)款冬總黃酮的質(zhì)量濃度為0.06 mg·mL-1時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到最高，為44.59%。盡管款冬總黃酮清除·OH的能力弱于維生素C，但款冬總黃酮也表現(xiàn)出一定的清除·OH的能力。O2-·在活性氧的形成中起重要作用，為防止其造成的氧化損傷，需要加入抗氧化劑對(duì)其進(jìn)行清除。因此，可通過測(cè)定抗氧化劑對(duì)O2-·的清除能力來判斷抗氧化劑的抗氧化能力?？疃傸S酮和維生素C對(duì)O2-·的清除作用見圖7。由圖7可知：款冬總黃酮的質(zhì)量濃度越大，對(duì)O2-·的清除率越高，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)款冬總黃酮質(zhì)量濃度為0.06 mg·mL-1時(shí)，對(duì)O2-·的清除率達(dá)到最高，為83.34%。與相同質(zhì)量濃度的維生素C相比，款冬總黃酮清除O2-·的能力雖然稍弱于維生素C，但款冬總黃酮仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除O2-·的能力。

圖6 款冬總黃酮和維生素C對(duì)·OH的清除作用

圖7 款冬總黃酮和維生素C對(duì)O2-·的清除作用

綜合分析，當(dāng)款冬總黃酮質(zhì)量濃度為0.06 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·、·OH和O2-·的清除率均達(dá)到最高，款冬總黃酮對(duì)DPPH·和O2-·具有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)·OH具有一定的清除能力，說明款冬總黃酮具有良好的抗氧化活性。

3 討論與結(jié)論

款冬總黃酮最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶40、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間50 min。在此工藝條件下，款冬總黃酮提取率為8.02%。文獻(xiàn)[12]以產(chǎn)自吉林省臨江市的款冬為材料，得到在乙醇體積分?jǐn)?shù)為 80%、料液比 1∶41、超聲溫度58 ℃、提取時(shí)間30 min的條件下，款冬總黃酮提取率最大，為 7.18%，本文的提取率高于該結(jié)果。文獻(xiàn)[10]研究表明：來自河北、山東、內(nèi)蒙古、貴州、廣西等不同產(chǎn)地的款冬總黃酮提取率為4.2%～8.0%，本文研究結(jié)果與此接近。提取率略有不同主要是由于試驗(yàn)所用的款冬來自不同的產(chǎn)地，其總黃酮含量存在差異，這與不同地區(qū)的土壤、海拔、生態(tài)環(huán)境和氣候條件等相關(guān)。文獻(xiàn)[11]采用微波法提取款冬總黃酮，提取率為9.70%，稍高于本文結(jié)果，原因可能是除試驗(yàn)材料的來源地不同外，也與提取工藝有關(guān)。從整體來看，超聲輔助提取具有穩(wěn)定可靠、快速、便捷、提取率高等特點(diǎn)，適用于款冬總黃酮的提取。

抗氧化試驗(yàn)表明：款冬總黃酮對(duì)O2-·和DPPH·具有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)·OH具有一定的清除能力。當(dāng)款冬總黃酮質(zhì)量濃度為0.02～0.06 mg·mL-1時(shí)，對(duì)3種自由基的清除能力均隨款冬總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)款冬總黃酮質(zhì)量濃度為0.06 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·、·OH和O2-·的清除率均達(dá)到峰值，分別為81.03%、44.59%和83.34%。文獻(xiàn)[20]研究表明：刺槐花總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性，當(dāng)刺槐花總黃酮質(zhì)量濃度為0.47 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·、·OH和O2-·的清除率分別達(dá)到88.04%、34.41%和59.07%。文獻(xiàn)[21]報(bào)道：無花果葉片總黃酮提取液對(duì)DPPH·和·OH的清除率分別達(dá)到66.67%和30.49%，證明無花果葉片具有較好的體外抗氧化能力。與這些植物的抗氧化能力相比，款冬總黃酮具有很強(qiáng)的體外抗氧化活性，可作為良好的天然抗氧化物質(zhì)資源進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)利用。本研究為款冬的綜合開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。