miRNA-638對巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流的影響及其發(fā)生機(jī)制研究

韓婕，高登峰，王曉娜，曹瑞華，鄧捷，葉平

生活方式、飲食結(jié)構(gòu)等外部因素的改變與遺傳因素相互作用導(dǎo)致人體脂代謝紊亂，表現(xiàn)為總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及三酰甘油（TG）升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低，并可進(jìn)一步導(dǎo)致脂代謝紊亂的相關(guān)性疾病的發(fā)生，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ˋSCVD）等，加重醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。因此血脂管理是防治ASCVD的重要措施。脂質(zhì)斑塊形成的中心環(huán)節(jié)是富含大量脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞沉積于血管內(nèi)皮下［2］，其可通過攝取及外流膽固醇保持內(nèi)外膽固醇穩(wěn)態(tài)。研究表明，肝臟既分泌了能夠負(fù)荷膽固醇的脂蛋白向外周運(yùn)送膽固醇，也可通過高密度脂蛋白（HDL）轉(zhuǎn)運(yùn)外周多余的膽固醇至肝臟進(jìn)行代謝［3-4］。研究也證實(shí)了microRNA（miRNA）能夠參與調(diào)節(jié)膽固醇代謝的不同階段［5-9］。筆者前期從普通人群血漿中miRNA的差異性表達(dá)入手，通過芯片技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)miRNA-638與HDL-C水平相關(guān)［10］。目前關(guān)于miRNA-638的研究多集中在腫瘤方面［11-12］，其與膽固醇代謝的關(guān)系鮮有報道。本研究旨在探討miRNA-638對巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流的影響及其發(fā)生機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人髓系白血病單核細(xì)胞（THP-1）購自美國ATCC，編號TIB202；佛波酯（PMA）、NBD-膽固醇、3K15高速冷凍離心機(jī)購自美國Sigma公司；miRNA-638模擬物及其陰性對照物及HiPerFect Transfection Reagent購自德國Qiagen公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR試劑盒、引物、蛋白抽提試劑、Bradford蛋白定量試劑盒及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自SinoGene公司；抗三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）/三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ABCG1）抗體購自美國Boster公司；抗極低密度脂蛋白受體（VLDLR）抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）及HDL購自北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司；清道夫受體BI（SR-BI）抑制劑BLT-1購自美國Millipore公司；載脂蛋白AI（ApoAI）購自北京義翹神州科技有限公司；潔凈工作臺〔蘇凈安泰生產(chǎn)，型號：SW-CJ-2F（D）〕；倒置式生物顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司生產(chǎn)，型號：XD-101）；低速臺式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)，型號：TDL-40B）；二氧化碳（CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo，型號：MCO-15AC）；JY-SPFT電泳槽、JY300C電泳儀、JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；生物分光光度計（Eppendorf，Biophotometer）；熒光實(shí)時定量PCR儀（ABI，StepOnePLUS），熒光酶標(biāo)儀（BioTek，Synergy2）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗完成于2016年9月—2017年9月。將THP-1以3×105cells/cm2的密度接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用DMEM+10%胎牛血清（FBS）完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入PMA 100 ng/ml，置于37 ℃、5%CO2、95%相對濕度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)THP-1貼壁并分化為巨噬細(xì)胞。

1.3 轉(zhuǎn)染 miRNA-638模擬物為化學(xué)合成的雙鏈RNAs，在轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后可模擬內(nèi)源成熟miRNA-638，該實(shí)驗中miRNA-638模擬物為細(xì)胞培養(yǎng)級純度（＞90%純度）。miRNA-638模擬物陰性對照物為化學(xué)合成的經(jīng)修飾的單鏈RNA，與任何已知的哺乳動物基因無同源性。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照HiPerFect Transfection Reagent試劑盒說明書進(jìn)行操作，具體方法如下：將干粉狀miRNA-638模擬物及其陰性對照物離心后，經(jīng)高壓滅菌的雙蒸水配制成濃度為20 μmol/L的miRNA-638模擬物及其陰性對照物儲存液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗結(jié)果，在DMEM培養(yǎng)基中按比例配制濃度為20 nmol/L的miRNA-638模擬物及其陰性對照物-HiPerFect Transfection Reagent復(fù)合物，輕輕震蕩混勻并于室溫下孵育10 min，后吸走24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染12 h后，更換DMEM+10% FBS完全培養(yǎng)液，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)并收集細(xì)胞。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 NBD-膽固醇外流率 轉(zhuǎn)染后在無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞8 h，更換100 μg/ml ox-LDL的DMEM+10% FBS完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入100 μmol/L BLT-1 2 h，在5 μmol/L的NBD-膽固醇孵育液孵育細(xì)胞4 h后，分別采用25 μg/ml ApoAI、50 μg/ml HDL和標(biāo)準(zhǔn)血清誘導(dǎo)外流液處理4 h，結(jié)束后收集誘導(dǎo)外流液及細(xì)胞裂解液。使用熒光酶標(biāo)儀檢測誘導(dǎo)外流液和細(xì)胞裂解液的熒光強(qiáng)度，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為469 nm和537 nm，計算NBD-膽固醇外流率即膽固醇外流率，NBD-膽固醇外流率=FI誘導(dǎo)外流液/（FI誘導(dǎo)外流液+FI細(xì)胞裂解液）×100%。

1.4.2 ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達(dá)量 轉(zhuǎn)染后吸去舊培養(yǎng)液，加入經(jīng)高壓滅菌的磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2～3次后吸干。加入適量TRIzol，用吸管反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶壁，使巨噬細(xì)胞徹底脫離培養(yǎng)瓶壁后，將培養(yǎng)瓶內(nèi)液體全部移入1.5 ml無RNA酶離心管中，劇烈震蕩，室溫靜置2～3 min，加入200 μl氯仿，劇烈渦旋30 s，室溫靜置5 min，4 ℃ 13 000×g離心15 min，留取無色上清液置于新的1.5 ml無RNA酶離心管中，加入等體積異丙醇混勻，冰上靜置10 min，4 ℃ 13 000×g離心10 min，棄上清液，加入1 ml 70%乙醇漂洗沉淀，4 ℃ 13 000×g離心5 min，棄70%乙醇，空氣晾干RNA沉淀，加60 μl 焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA沉淀?？俁NA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，采用實(shí)時熒光定量PCR法，經(jīng)SYBR Green qPCR試劑盒分別檢測ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達(dá)量，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值，根據(jù)公式2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因相對表達(dá)量。各引物序列如下：β-actin上游引物：5'-ACTGCTCTGGCTCCTAGCAC-3'，下游引物：5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'；ABCA1上游引物：5'-AATTCTCAAGTGCAAACACTTCTGG-3'，下游引物：5'-GAGGCATATGCTTGCGGTACA-3'；ABCG1上游引物：5'-CTTGCAGTAGGGGCTTTCAG-3'，下游引物：5'-GCAAGGCTAGAGGTGTGGAG-3'；VLDLR上 游 引物：5'-TTCCAGTGCACAAATGGTCG-3'，下游引物：5'-GGAACACACTGGCCATTGTT-3'。

1.4.3 ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達(dá)量 采用Western blotting 檢 測 ABCA1、ABCG1、VLDLR 相 對表達(dá)量，具體如下：轉(zhuǎn)染后加入含蛋白酶抑制劑的蛋白抽提試劑提取細(xì)胞蛋白，采用Bradford蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入Loading buffer后煮沸蛋白并于-20 ℃保存。電泳分離蛋白：將封閉過的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜加入一抗，于4 ℃搖床孵育過夜，使抗原抗體充分結(jié)合；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，采用化學(xué)發(fā)光法檢測ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參，將顯影結(jié)果進(jìn)行灰度數(shù)據(jù)結(jié)果分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0及Prizm 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。計量資料以（± s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NBD-膽固醇外流率 轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞經(jīng)ApoAI外流液介導(dǎo)的NBD-膽固醇外流率低于轉(zhuǎn)染陰性對照物巨噬細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.524，P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞與轉(zhuǎn)染陰性對照物巨噬細(xì)胞經(jīng)HDL、標(biāo)準(zhǔn)血清外流液介導(dǎo)的NBD-膽固醇外流率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為0.108、1.520，P值均＞0.05，見圖1）。

2.2 ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達(dá)量 轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞的ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達(dá)量低于轉(zhuǎn)染陰性對照物巨噬細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為2.491、2.011、2.210，P值均＜0.05，見圖2）。

2.3 ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達(dá)量轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1相對表達(dá)量低于轉(zhuǎn)染陰性對照物巨噬細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為2.663、2.145，P值均＜0.05）；轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞與轉(zhuǎn)染陰性對照物巨噬細(xì)胞中VLDLR相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計意義（t=1.005，P＞0.05，見圖3）。轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達(dá)量電泳圖見圖4。

3 討論

圖1 轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物及其陰性對照物巨噬細(xì)胞經(jīng)ApoAI、HDL及標(biāo)準(zhǔn)血清外流液介導(dǎo)的NBD-膽固醇外流率Figure 1 NBD-cholesterol efflux rate by ApoAI，HDL and standard serum in macrophage transfected with miRNA-638 mimics and its negative control

圖2 轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物及其陰性對照物巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相對表達(dá)量Figure 2 Relative expression levels of ABCA1，ABCG1 and VLDLR mRNA in macrophages transfected with miRNA-638 mimics and its negative control

圖3 轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物及其陰性對照物巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達(dá)量Figure 3 Relative expression levels of ABCA1，ABCG1 and VLDLR proteins in macrophages transfected with miRNA-638 mimic and its negative control

圖4 轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞ABCA1、ABCG1、VLDLR相對表達(dá)量的電泳圖Figure 4 Electrophoretogram of relative expressions of ABCA1，ABCG1 and VLDLR proteins in macrophages transfected with miRNA-638 mimic

膽固醇在構(gòu)成細(xì)胞膜、合成膽汁酸及激素、參與機(jī)體內(nèi)多種物質(zhì)代謝等生理過程中發(fā)揮著重要作用［13］。目前研究認(rèn)為，動脈粥樣硬化斑塊形成的核心是吞噬了大量膽固醇的泡沫細(xì)胞在血管內(nèi)皮下沉積，而哺乳動物體內(nèi)細(xì)胞大多不具備膽固醇的分解代謝能力［14］。因此，細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流能夠有效防止膽固醇在外周組織器官中的蓄積。HDL能夠介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多余的膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)，經(jīng)肝臟分解代謝后形成膽汁外排，從而維持機(jī)體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)，這一過程又被稱為膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）。RCT過程較復(fù)雜，目前研究認(rèn)為，其主要依靠ABCA1/ABCG1、ApoAI、SR-BI等介導(dǎo)［15］。細(xì)胞內(nèi)膽固醇通過細(xì)胞膜上ABCA1流出至循環(huán)中ApoAI，形成新生HDL顆粒，而新生HDL顆?？衫^續(xù)接受由ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流，直至形成成熟HDL顆粒，后被肝臟SR-BI選擇性攝取，最終將膽固醇分解代謝［16-20］，因此機(jī)體內(nèi)RCT被認(rèn)為是重要的抗動脈粥樣硬化斑塊形成的過程。前瞻性流行病學(xué)研究證實(shí)，HDL-C每升高1 mg/dl，ASCVD發(fā)病風(fēng)險可降低2%～3%，并獨(dú)立于其他傳統(tǒng)心血管疾病的危險因素［21］。RCT中每一個步驟的效率均會影響整體過程［22-23］，而關(guān)鍵限速步驟為細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流［24］，其并不是依賴濃度梯度的簡單擴(kuò)散，而是受到嚴(yán)格調(diào)控的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的主動耗能過程［25］。

雖然RCT的過程容易理解，但過程中每一個步驟的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探索?，F(xiàn)有的治療策略可能會導(dǎo)致較多不良反應(yīng)［26-27］。目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA展現(xiàn)出了精確調(diào)節(jié)脂代謝的潛力，可能會成為減少不良反應(yīng)的治療靶點(diǎn)［28］。筆者前期對普通人群循環(huán)miRNA篩查的結(jié)果提示，低HDL-C水平人群血漿中miRNA-638表達(dá)量高于正常HDL-C水平人群［10］。miRNA-638在人類及靈長類動物細(xì)胞中均有表達(dá)，而目前關(guān)于miRNA-638的研究多集中在腫瘤方面，提示其可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移［11-12］。但miRNA-638與RCT的關(guān)系尚不明確。筆者前期發(fā)現(xiàn)為深入探討其在膽固醇代謝過程中可能發(fā)揮的作用提供了依據(jù)。

通過檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流率可以明確miRNA-638對RCT過程有無影響。目前同位素氚標(biāo)記的膽固醇（3H-膽固醇）是檢測膽固醇外流率的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因輻射污染問題無法廣泛應(yīng)用。本研究采用NBD-膽固醇是將熒光基團(tuán)標(biāo)記于膽固醇烷基基團(tuán)，而激發(fā)后的熒光強(qiáng)度與膽固醇水平呈正比［29］。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞經(jīng)ApoAI外流液介導(dǎo)的NBD-膽固醇外流率低于轉(zhuǎn)染陰性對照物巨噬細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞與轉(zhuǎn)染陰性對照物巨噬細(xì)胞經(jīng)HDL、標(biāo)準(zhǔn)血清外流液介導(dǎo)的NBD-膽固醇外流率間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是miRNA-638能夠影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，且其調(diào)控具有選擇性，主要抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出至ApoAI形成新生HDL顆粒過程。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1相對表達(dá)量低于轉(zhuǎn)染陰性對照物的巨噬細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miRNA-638模擬物巨噬細(xì)胞與轉(zhuǎn)染陰性對照物巨噬細(xì)胞中VLDLR相對表達(dá)量間差異無統(tǒng)計意義，提示miRNA-638能夠降低巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1 相對表達(dá)量，但對主要參與膽固醇攝取的VLDLR相對表達(dá)量無明顯影響。而生物信息學(xué)分析未能證實(shí)ABCA1及ABCG1基因調(diào)控序列中存在miRNA-638結(jié)合靶點(diǎn)［10］，筆者推測miRNA-638可能通過間接影響ABCA1、ABCG1的表達(dá)量從而發(fā)揮對RCT過程的調(diào)控作用。雖然ABCG1和ABCA1能夠協(xié)同介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，但既往研究表明，高脂飲食喂養(yǎng)的外周巨噬細(xì)胞ABCG1特異性敲除LDL受體基因小鼠的動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生率僅從33%提高至36%，且斑塊大小與時間、ABCG1基因型密切相關(guān)，而外周巨噬細(xì)胞ABCA1特異性敲除LDL受體基因小鼠的動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生率可增長2倍，故ABCA1對動脈粥樣硬化斑塊的影響更為明顯［30］。

目前血脂管理指南將HDL-C視為評估ASCVD發(fā)生風(fēng)險的重要指標(biāo)，但因缺乏相關(guān)臨床證據(jù)支持，尚未將其作為主要的藥物干預(yù)靶點(diǎn)［21］。而關(guān)注HDL本身的功能及其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，尤其是HDL介導(dǎo)的RCT過程，或許比單純提高HDL-C更有意義。

綜上所述，miRNA-638可減少體外實(shí)驗中ApoAI介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，其可能是通過調(diào)控ABCA1/ABCG1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，而miRNA-638調(diào)控ABCA1/ABCG1表達(dá)的具體機(jī)制以及對體內(nèi)RCT的影響仍需進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：葉平進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；韓婕、高登峰、鄧捷進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；韓婕進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，撰寫論文；韓婕、王曉娜進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；王曉娜進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理；韓婕、曹瑞華進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；高登峰、鄧捷、葉平進(jìn)行論文的修訂；高登峰、葉平負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。