免疫熒光染色切片改染HE 的方法探討

高洪彬，梁十，郭揚(yáng)清，吳玉娥，賈歡歡，劉嬋，李云峰，李航，王希龍，陳梅麗

（省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所；廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州）

0 引言

免疫熒光檢測(cè)技術(shù)具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)用性好等優(yōu)點(diǎn)[1]，目前得到大量應(yīng)用。但有時(shí)由于某些原因，免疫熒光切片未有相應(yīng)的HE 染色切片可比較分析，即使有HE 切片但由于不為同一組織片、需要觀察的位置已經(jīng)或多或少的發(fā)生了改變，不利于與免疫熒光切片進(jìn)行精準(zhǔn)的比較研究。本研究通過(guò)實(shí)踐，探討了免疫熒光染色后進(jìn)行HE 染色的方法，并對(duì)方法進(jìn)行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

[普通級(jí)]食物蟹猴3 只，由廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司提供[SCXK（粵）2014-0027]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)方案均得到了動(dòng)物關(guān)懷與使用倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)所嚴(yán)格按國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估及認(rèn)證管理委員會(huì)規(guī)定和要求對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行日常飼養(yǎng)、關(guān)懷和管理。

1.2 儀器與試劑

主 要 儀 器：Leica DM3000 正 置 熒 光 顯 微 鏡，Leica ST5020+SV5030 全自動(dòng)染色封片一體機(jī)，Leica RM2255 全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，Leica EG1150H+C 石蠟包埋機(jī)，Leica TP1020 全自動(dòng)脫水機(jī)。

主要試劑：胰島素抗原（Gene Tex 公司）、熒光二抗（Invitrogen Life Technologies 公司）PBS 緩沖液（博士德生物工程有限公司）、免疫染色封閉液（碧云天生物技術(shù)有限公司）、無(wú)水乙醇（廣州中南化學(xué)有限公司）、95%乙醇（廣州凱秀貿(mào)易有限公司）、胰蛋白酶（南京建成生物工程研究所）、1%醇溶性伊紅（廣州凱秀貿(mào)易有限公司）、Harris 蘇木素（廣州凱秀貿(mào)易有限公司）、二甲苯（天津市百世化工有限公司）、TO 透明劑（廣州市中南化工儀器有限公司）、丙三醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 組別

選取3 只血糖正常的食蟹猴胰腺蠟塊標(biāo)本，連續(xù)切片后多聚賴氨酸防脫玻片撈片，分3 組，每組3 個(gè)蠟塊，即：空白切片染HE組（A 組），高壓修復(fù)免疫熒光切片染HE 組（B 組），胰蛋白酶修復(fù)染HE 組（C 組）。A 組直接進(jìn)行HE 染色；B 組使用高壓加熱修復(fù)抗原的方法進(jìn)行免疫熒光染色，已完成熒光染色的切片進(jìn)行HE染色。C 組使用胰蛋白酶修復(fù)抗原的方法進(jìn)行免疫熒光染色，已完成熒光染色的切片進(jìn)行HE 染色。

1.3.2 免疫熒光染色方法

空白切片烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后PBS 沖洗3 次、每次5min，高壓加熱修（高壓鍋噴氣后5min 停止加熱，待自然冷卻至室溫）或1.25%胰蛋白酶修復(fù)（37℃，30min），PBS 沖洗(3 次、每次5min)，熒光封閉液封閉60min，一抗孵育（4℃冰箱過(guò)夜），復(fù)溫（37℃，60min），PBS 沖洗(3 次、每次5min)，二抗孵育（37℃，60min），PBS 沖洗(3 次、每次5min)，晾干，封片。

1.3.3 HE 染色方法

空白切片在二甲苯I 及二甲苯II 中分別浸泡20min 脫蠟梯度酒精脫水至純水，每個(gè)步驟7min。接著進(jìn)行Harris 蘇木素染色10min，再放入水中浸泡1min，1%鹽酸乙醇分化5s，流水返藍(lán)15min。轉(zhuǎn)移至90%乙醇浸泡7min，1%醇溶性伊紅染色30s，轉(zhuǎn)移至95%乙醇I、95%乙醇II 以及95%乙醇III 各浸泡10s，然后至無(wú)水乙醇I、無(wú)水乙醇II 脫水各5min，最后在TO 透明劑 I、TO透明劑II 各浸泡7min，封片。

已完成熒光染色的切使用PBS 泡洗（3 次，5min），脫去蓋玻片及封片劑后流水沖洗30min。后續(xù)進(jìn)行Harris 蘇木素染色等與空白切片相同的程序和步驟。

1.3.4 病理組織學(xué)觀察

使用顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察。B、C 組在染HE 前在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，不同組不同動(dòng)物的熒光染色和HE 染色切片使用同一光線亮度及照片采集軟件參數(shù)下進(jìn)行閱片和拍照。

2 結(jié)果

胰腺由外分泌部和內(nèi)分泌部組成。外分泌部由胰腺腺泡組成，內(nèi)分泌部由胰島組成。

A 組3 例組織切片均平整，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，色彩深淺適度，紅藍(lán)對(duì)比鮮明，著色層次清晰，色調(diào)柔和悅目，綜合評(píng)估染色效果佳。B 組有1 例切片部分組織破損脫落，2 例平整，3 例各指標(biāo)染色效果與A 組相當(dāng)，綜合評(píng)估染色效果佳與A 組相當(dāng)。C 組3 例組織切片均平整，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，紅染偏淡，紅藍(lán)對(duì)比較鮮明，著色層次較清晰，色調(diào)柔和較悅目，綜合評(píng)估染色效果尚可、但較A、B 組稍差。染色效果見(jiàn)下圖①-⑤。

3 討論

免疫熒光是組織病理學(xué)研究的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)[2]，石蠟切片在進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)進(jìn)行的處理包括有機(jī)溶劑脫蠟、梯度酒精水化、PBS 泡洗、抗原修復(fù)、熒光封閉液封閉、一抗孵育、二抗孵育及封片等操作[3，4]。組織細(xì)胞內(nèi)嗜酸性成分結(jié)合伊紅顯示紅色、嗜堿性物質(zhì)結(jié)合蘇木素顯示藍(lán)色[5]，由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程未接觸強(qiáng)酸強(qiáng)堿性等可改變組織成分酸堿度的溶劑，而PBS 溶液的使用能夠?qū)赡艿慕M織細(xì)胞成分酸堿度的改變起到緩沖調(diào)節(jié)作用，因而理論上進(jìn)行了免疫熒光染色的切片可以進(jìn)行HE 染色且顯色正常。免疫熒光切片的封片劑常使用有抗熒光淬滅作用的丙三醇PBS 溶液[6]，由于丙三醇溶于水[6]，故使用PBS 溶液浸泡除去蓋玻片、流水沖洗去除組織上殘留的封片劑。

本實(shí)驗(yàn)觀察到免疫熒光切片，按常規(guī)HE 染色的方法和程序進(jìn)行染色即可得到較理想效果。B 組有的切片可見(jiàn)組織破碎、脫落，該切片在進(jìn)行HE 染色之前已經(jīng)是有相應(yīng)的區(qū)域破碎、脫落，組織塊的破損主要是發(fā)生在進(jìn)行免疫熒光染色抗原的高壓熱修復(fù)過(guò)程[7]。進(jìn)行HE 染色前組織平整的切片，進(jìn)行HE 染色后未發(fā)現(xiàn)脫落現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高壓修復(fù)免疫熒光切片續(xù)染HE 組的染色效果理想，染色效果和空白組織切片直接進(jìn)行HE 染色的效果相當(dāng)。C 組HE 染色效果尚可，可以進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，但染色效果較差，主要表現(xiàn)為伊紅染色效果較差，這可能是在進(jìn)行免疫熒光時(shí)使用胰酶對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)的同時(shí)組織細(xì)胞的其它蛋白質(zhì)成分也被或多或少的消化[8]，由于蛋白質(zhì)嗜伊紅，所以HE 染色效果體現(xiàn)出伊紅染色的不足。

圖1