活血通絡(luò)湯對SANFH 兔造模過程中Notch1、HERP1 及bFGF表達(dá)的影響

蔡萬翔，王敏，李濤，江蓉星

（1.成都體育學(xué)院附屬體育醫(yī)院,四川 成都；2.重慶市中醫(yī)院,重慶；3.都江堰市醫(yī)療中心，四川 都江堰；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都）

0 引言

股骨頭壞死（ONFH）系多因素?fù)p傷或中斷了股骨頭的血供，從而導(dǎo)致股骨頭骨髓成分與骨細(xì)胞死亡，最終股骨頭結(jié)構(gòu)發(fā)生改變甚至塌陷，并出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀的難治性關(guān)節(jié)疾病[2]。長期或短期大劑量使用糖皮質(zhì)激素已成為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首要發(fā)病因素[3]。股骨頭血供的受損或中斷導(dǎo)致骨髓成分及骨細(xì)胞的死亡或凋亡是骨壞死必經(jīng)的環(huán)節(jié)[4]。減少激素對股骨頭周圍血供的損傷，促進(jìn)股骨頭周圍血管的穩(wěn)定獲修復(fù)，抑制骨髓及骨細(xì)胞的死亡或凋亡進(jìn)而促進(jìn)骨組織及骨細(xì)胞的修復(fù)有利于降低或改善SANFH 的發(fā)生率。本次實(shí)驗(yàn)基于中醫(yī)“未病先防”的特色指導(dǎo)思想結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)成果，動(dòng)態(tài)監(jiān)測Notch1、HERP1 及bFGF 的含量，并探討分析可能的相關(guān)作用機(jī)制，以期為防治SANFH 奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

全雄性健康日本大耳兔，總共192 只，3 月齡，體質(zhì)量2.0-2.5Kg，由四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心所提供，檢疫合格（動(dòng)物許可證號SCXK（川）2009-09）。單籠單兔飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)條形飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。符合動(dòng)物倫理要求。

1.2 藥物

醋 酸 潑 尼 松 龍 注 射 液（規(guī) 格：5mL:125mg，批 號：131102，浙江仙琚制藥）；注射用青霉素鈉（規(guī)格：0.48:80 萬U，批號：A1311002，哈藥集團(tuán)制藥總廠）；硫酸慶大霉素注射液（規(guī)格：2mL：8 萬U，批號：20131112，四川長征藥業(yè)股份有限公司）。“活血通絡(luò)湯”方組成：黃芪、丹參、川芎、當(dāng)歸g、懷牛膝、巴戟天、地龍、雞內(nèi)金等（均按原方比例于成都市北京同仁堂購買，并加工成粉末；后制成中藥條形飼料，中藥所占20%比值）。

1.3 儀器與試劑

低溫離心機(jī)（型號：C2500 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠）；實(shí)時(shí)熒光定量儀、熱循環(huán)儀（美國ThermoFisher 儀器有限公司）；旋渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；Rabbit NOTCH2 ELISA kit，Abcam 公司。電泳儀、電泳槽、化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)（常州中威電子儀器）；槍頭、EP 管（美國Axygen 公司）；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（徠卡-2016，德國）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡，BA400Digital（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；圖像分析軟件（美國Media Cybernetics 公司）。

多聚甲醛（EM 級）、無水乙醇（AR 級）、二甲苯（AR 級）、蘇木素(AR 級）、硫酸鋁鉀（AR 級）、碘酸鈉（AR 級）、丙三醇（AR 級）、伊紅（AR 級）、氯仿（RNA 專用），實(shí)時(shí)熒光定量法（RT-PCR）檢測試劑-總RNA 抽提試劑（美國Invitrogen 公司）、免疫組化（S-P法）試劑（北京中衫金橋生物有限公司）、酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）試劑（bcam 公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組

將實(shí)驗(yàn)大耳兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，準(zhǔn)確稱重，然后隨機(jī)分成為四組：預(yù)防+治療組（A）、治療組（B）、模型對照組(C）與空白對照組（D），每組各48 只。

給藥方式：A 組從第2 周開始喂服中藥飼料（50g/kg.d）其余各組喂服普通飼料（50g/kg.d），每日1 次，連續(xù)1 周。從第3 周開始，A、B 兩組喂服中藥飼料（50g/kg.d），C、D 組連續(xù)喂服普通飼料（50g/kg.d），每日1 次，連續(xù)6 周。

1.4.3 造模

第3 周起，A、B、C 三組兔參照賀氏造模法開始造模[1]，在每只家兔臀部采取肌肉注射醋酸潑尼松龍注射液（8mg/kg），D 組家兔臀部注射同等劑量的生理鹽水，一周2 次，連續(xù)注射6 周。4 組家兔全部預(yù)防性注射使用青霉素（8 萬U/kg），慶大霉素（4 萬U/只），一周2 次，預(yù)防家兔感染。

1.4.4 標(biāo)本采集

分別于第2、5、8 周末隨機(jī)從各組抽取8 只兔子，抽取兔耳緣靜脈血，抗凝，離心機(jī)分離，取白細(xì)胞和血清標(biāo)本，低溫保存。處死兔子，截取股骨頭標(biāo)本，放入10%甲醛中固定。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 一般情況

精神、運(yùn)動(dòng)、皮毛、體重、糞便等；

1.5.2 鏡檢

光鏡鏡檢：脫水、修整、包埋、切片、HE 染色、封片，鏡檢；

電鏡鏡檢：吸取固定液、洗滌、脫水、干燥、噴鍍等，鏡檢；

1.5.3 空骨陷窩率

在股骨頭軟骨區(qū)隨機(jī)選取10 個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中所有骨陷窩數(shù)與空骨陷窩數(shù)（計(jì)算公式：空骨陷窩數(shù)/全部骨陷窩數(shù)×100%）；

1.5.4 Notch1、HERP1 基因表達(dá)值

采 用RT-PCR 檢 測；血 清 中bFGF：Elisa 檢 測，骨 組 織 中bFGF：S-P 法檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0 for windows 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用%表示，檢測水準(zhǔn)a=0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況

2.2 骨組織光鏡下觀察

表2 骨組織光鏡下觀察

表3 骨組織電鏡下觀察

2.3 骨組織電鏡下觀察

2.4 兔股骨頭空骨陷窩率結(jié)果（%）

表4 兔股骨頭空骨陷窩率結(jié)果（%）

由表4 分析空骨陷窩率：A、B、C 組均明顯高于D 組（P＜0.01）；A、B 組 明 顯 低 于C 組（P＜0.01）；在 第8 周 末 時(shí)：B 組 高 于A組（P＜0.05）；隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，C 組呈上升趨勢； B 組增長趨勢弱于C 組；A 組在實(shí)驗(yàn)后期呈下降趨勢。

2.5 Notch1 的基因表達(dá)檢測結(jié)果

表5 藥物對實(shí)驗(yàn)家兔血清Notch1 蛋白基因表達(dá)值的影響

表5 藥物對實(shí)驗(yàn)家兔血清Notch1 蛋白基因表達(dá)值的影響

注：其它組與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；C 組，D 組與B 組比較#P＜0.05，##P＜0.01；D 組與C 組比較^P＜0.05，^^P＜0.01。

組別 （第造2模周前末） （第造5模周中末） （第造8模周后末）預(yù)防+治療組（A 組） 1.17±0.14 1.19±0.33 1.28±0.27治療組（B 組） 1.30±0.20 1.18±0.13 1.29±0.18模型對照組（C 組） 1.22±0.22 1.16±0.10 1.72±0.37##**空白對照組（D 組）0.62±0.33^^##** 1.21±0.23 1.51±0.17

由上分析Notch1 表達(dá)值：第2 周末時(shí)，A、B、C 組明顯高于D組（P＜0.01）；第5 周時(shí)，A、B、C、D 組各組間比較P ＞0.05；第8 周時(shí)，A、B 組均比C 組低（P＜0.01）。A 組第8 周比第2 周稍高，B 組第8周比第2 周略低，C 組、D 組Notch1 表達(dá)值升高的幅度比A 組大。

2.6 HERP1 的基因表達(dá)檢測結(jié)果

表6 藥物對實(shí)驗(yàn)家兔血清中HERP1 濃度的影響（單位：ug/L）

表6 藥物對實(shí)驗(yàn)家兔血清中HERP1 濃度的影響（單位：ug/L）

注：其它組與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；C 組，D 組與B 組比較#P＜0.05，##P＜0.01；D 組與C 組比較^P＜0.05，^^P＜0.01。

組別 （第造2模周前末） （第造5模周中末） （第造8模周后末）預(yù)防+治療組（A 組） 1.29±0.16 1.51±0.30 1.61±0.16治療組（B 組） 1.51±0.24 1.60±0.16 1.78±0.26模型對照組（C 組） 1.48±0.48 1.80±0.22* 1.64±0.43空白對照組（D 組） 0.85±0.43 1.29±0.16##^^ 1.94±0.21

由上分析HERP1 表達(dá)值：第2 周時(shí)，各組間比較（P ＞0.05）；第5 周時(shí)，A 組低于C 組（P＜0.05），B 組高于D 組（P＜0.01），C組高于D 組（P＜0.01）；第8 周時(shí)，各組間比較（P＞0.05）。A 組、B 組2、5、8 周呈遞增的趨勢，C 組2、5 周呈增高的趨勢（第8 周略微下降），D 組增高趨勢大于A、B 組。

2.7 血清中bFGF 的檢測結(jié)果

表7 藥物對實(shí)驗(yàn)家兔血清中bFGF 濃度的影響（單位：ng/l）

表7 藥物對實(shí)驗(yàn)家兔血清中bFGF 濃度的影響（單位：ng/l）

注：其它組與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；C 組，D 組與B 組比較#P＜0.05，##P＜0.01；D 組與C 組比較^P＜0.05，^^P＜0.01。

組別 （第造2模周前末） （第造5模周中末） （第造8模周后末）預(yù)防+治療組（A 組） 9.80±0.37 9.65±0.34 8.97±0.64治療組（B 組） 9.51±0.23* 9.64±0.28 8.74±0.83模型對照組（C 組） 9.45±0.19* 9.83±0.13 8.57±0.76空白對照組（D 組） 9.75±0.26 10.18±0.84 9.70±1.02^^#

由上分析bFGF 濃度：第2 周末時(shí)，A 組高于B、C 組（P＜0.05）；第5 周末時(shí)，各組間比較（P＞0.05）；第8 周末時(shí)，C 組明顯低于D組（P＜0.01）；B 組低于D 組（P＜0.05）；A、D 組間比較（P＞0.05）。

2.8 兔骨組織中bFGF 平均光密度

表8 藥物對兔骨組織bFGF 平均光密度的影響

表8 藥物對兔骨組織bFGF 平均光密度的影響

注：模型組與空白對照組（D 組）相比，**P＜0.01；其余3 組與模型對照組（C 組）對比，△P＜0.05 ，△△P＜0.01。

組別 N（只） OD預(yù)防+治療組（A 組） 24 0.2610±0.0118 △△治療組（B 組） 24 0.2528±0.0112 △模型對照組（C 組） 28 0.2453±0.0101 **空白對照組（D 組） 24 0.2709±0.0097

由上可知：C 組兔骨組織bFGF 明顯低于D 組(P＜0.01)；A 組兔骨組織bFGF 明顯高于C 組（P＜0.01）；B 組兔骨組織bFGF 升高（P＜0.05）。

3 討論

家兔的一般情況的變化情況，表明A、B 兩組的施加條件可抑制激素對家兔精神、毛色、體重、活動(dòng)量的損害，且A 組略優(yōu)于B組。從病理形態(tài)學(xué)及鏡檢結(jié)果表明A、B 兩組家兔的施加條件能降低空骨陷窩率，且A 組略優(yōu)于B 組。研究發(fā)現(xiàn)長期或者短期大劑量使用激素能引起股骨頭軟骨下空骨陷窩率升高，即為早期股骨頭壞死[5]。所以實(shí)驗(yàn)表明A、B 組的施加條件能抑制激素對家兔骨組織的損傷，且A 組抑制作用略強(qiáng)于B 組，即活血通絡(luò)湯能抑制家兔骨組織的損傷，且有一定的預(yù)防作用。

研究表明Notch 的高表達(dá)能抑制破骨細(xì)胞的表達(dá)，或者具有成骨作用[6]，也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：Notch 信號對細(xì)胞成骨分化可能有抑制作用[7],李林等研究顯示Notch 信號參與了骨形成和成骨細(xì)胞的分化，并可能對骨形成和成骨細(xì)胞有抑制作用[8]。還有研究表明Notch 信號通路能作用于細(xì)胞的成熟過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值與分化[9]。由表5 可知活血通絡(luò)湯能抑制Notch1 的表達(dá)。所以單路分析可能是：活血通絡(luò)湯通過抑制Notch1 的表達(dá)：①從抑制破骨細(xì)胞的增殖或（和）促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化，②通過促進(jìn)破骨細(xì)胞的死亡或凋亡或（和）抑制成骨細(xì)胞的死亡或凋亡；從而調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡來達(dá)到治療SANFH 的作用。

HERP 是Notch 的下游靶基因，李斌元等認(rèn)為HERP 參與了細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)過程[10]，陳風(fēng)雷等研究表明抑制HERP 表達(dá)能夠增強(qiáng)細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞死亡[11]。由表6 可知活血通絡(luò)湯可能是降低HERP1 的表達(dá)從而增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的自噬而抑制了成骨細(xì)胞的死亡來達(dá)到治療SANFH 的作用，而A 組HERP1 的表達(dá)值低于B 組，說明A 組該項(xiàng)抑制作用強(qiáng)于B 組，表示活血通絡(luò)湯預(yù)防SANFH 的作用得到體現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)后期HERP1 對成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的作用，可能即存在抑制成骨細(xì)胞細(xì)胞死亡的作用，也存在抑制破骨細(xì)胞死亡的作用，且后者有增強(qiáng)趨勢。

作為細(xì)胞因子的bFGF 具有多種生物學(xué)活性，從表7、8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，活血通絡(luò)湯具有上調(diào)家兔中bFGF 的作用，且造模前給藥的上調(diào)作用強(qiáng)于造模開始后給藥的作用。bFGF 是具有促進(jìn)血管生成作用的血管生成因子。CHRISTIANW 等研究表明:細(xì)胞因子bFGF 具有促進(jìn)微血管形成、改善微循環(huán)的作用，并且參與新生血管形成的全過程[12]。由此可以推論活血通絡(luò)湯可能是通過上調(diào)兔血中bFGF 的含量，從而促進(jìn)微血管形成，最終恢復(fù)股骨頭血運(yùn)來達(dá)到預(yù)防與治療SANFH 的作用。細(xì)胞層面，有研究表明bFGF能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增值，而抑制破骨細(xì)胞的形成，從而促進(jìn)骨的形成[13]。李鵬飛等研究發(fā)現(xiàn)，bFGF 對骨細(xì)胞的前期增殖起到有效的刺激作用，它合成并儲存在成骨細(xì)胞中，并且對軟骨細(xì)胞具有抗凋亡作用[14]。由此可以推測：活血通絡(luò)湯通過上調(diào)bFGF 的含量：①促進(jìn)成骨細(xì)胞的合成、抑制破骨細(xì)胞的形成；②對軟骨細(xì)胞的抗凋亡作用；從而實(shí)現(xiàn)的治療或者預(yù)防SANFH 作用。李曉輝等通過研究發(fā)現(xiàn)bFGF 是多種細(xì)胞的絲裂原，可促進(jìn)成骨細(xì)胞基因的表達(dá)和血管的生成[15]。bFGF 在治療股骨頭壞死方面具備一定的潛能和優(yōu)勢。

在實(shí)驗(yàn)中Notch1、HERP1 與bFGF 可能單獨(dú)的支路起作用，也可能是其中兩者或者三者之間在不同時(shí)間段Notch 信號通路的某一通路被激活，如Notch1- HERP1、Notch1-bFGF 或Notch1-HERP1-bFGF 等通路，從而增加Notch 受體胞內(nèi)活性片段（Notch intracellular domain,NICD)的表達(dá)，促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而參與對細(xì)胞、血管增殖分化以及細(xì)胞的凋亡/死亡的調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化或降低破骨分化，最終達(dá)到治療SANFH。但其中的關(guān)聯(lián)作用還需進(jìn)一步的設(shè)立對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來研究，以期為臨床主動(dòng)防治SANFH 奠定進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。