基于宏基因組分析桑葚酵素的微生物多樣性

邸鵬月 彭 宇 李 晨，2 盧海強(qiáng)，2 谷新晰，2 田洪濤，2，3*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心 河北保定071001 3 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定071001）

桑葚被稱為“21 世紀(jì)最佳保健果品”，富含多種營養(yǎng)成分和豐富的黃酮類及多酚物質(zhì)，具有提高人體免疫力，清除體內(nèi)有害自由基及促進(jìn)糖類脂肪蛋白代謝等重要作用[1-2]。2017年中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布的《食用植物酵素》標(biāo)準(zhǔn)中定義：食用植物酵素（Edible plant Source Jiaosu）以植物為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分（多糖類、寡糖類、蛋白質(zhì)及多肽、氨基酸類、維生素類等）、可食用的酵素產(chǎn)品[3]。研究表明該類產(chǎn)品具有延緩衰老，抑菌消炎，清潔血液，提高機(jī)體免疫能力及解毒抗癌多種功效[4]。研制開發(fā)桑葚酵素具有廣闊前景。

我國現(xiàn)有的食用酵素大多延續(xù)傳統(tǒng)發(fā)酵方法——自然發(fā)酵工藝制成，此類制作方法不僅受限于發(fā)酵季節(jié)，而且發(fā)酵周期冗長，發(fā)酵菌種更是繁多混雜，造成發(fā)酵環(huán)境的不穩(wěn)定性，同時發(fā)酵產(chǎn)品的安全質(zhì)量也難以控制。實現(xiàn)食用酵素生產(chǎn)由自然發(fā)酵到接種發(fā)酵的技術(shù)飛躍，勢在必行。探究自然發(fā)酵食用酵素微生物多樣性與菌群變化規(guī)律，是篩選食用酵素，接種發(fā)酵優(yōu)良優(yōu)勢微生物菌種的基礎(chǔ)課題與首要任務(wù)。目前，對自然發(fā)酵食用酵素微生物多樣性與菌群變化規(guī)律的研究，大多采用分離純化法、PCR-DGGE 法等。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，宏基因組學(xué)被用于分析自然發(fā)酵過程中微生物群落動態(tài)變化規(guī)律。宏基因組學(xué)是專門研究直接從樣品中提取基因組DNA 后進(jìn)行測序分析，能夠準(zhǔn)確揭示微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性及環(huán)境之間的相互協(xié)作關(guān)系，極大地促進(jìn)和擴(kuò)展了微生物學(xué)的研究范圍。例如，王海英[5]采用高通量測序分析技術(shù)對自然發(fā)酵方式制備的番木瓜酵素微生物的群落組成及多樣性進(jìn)行測序分析，為有效調(diào)控發(fā)酵過程中微生物菌群提供了方向。然而，利用宏基因組學(xué)研究桑椹酵素自然發(fā)酵微生物多樣性及菌群變化規(guī)律，鮮有報道。

本研究以不同時期自然發(fā)酵的桑葚酵素為樣本，采用宏基因組學(xué)技術(shù)探究樣品中微生物的多樣性及群落動態(tài)變化，對進(jìn)一步篩選桑葚酵素自然發(fā)酵優(yōu)勢微生物菌種，研制高效發(fā)酵劑，實現(xiàn)人工控制發(fā)酵桑葚酵素系列新產(chǎn)品，提高桑葚酵素產(chǎn)品生產(chǎn)效率與質(zhì)量安全水平提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料 新鮮成熟桑葚，河北省石家莊市靈壽縣海燕農(nóng)牧公司提供；白砂糖、娃哈哈純凈水、玻璃罐，購自百樂超市。

1.1.2 培養(yǎng)基 乳酸菌選擇培養(yǎng)基[6]、醋酸菌選擇培養(yǎng)基[7]、酵母菌選擇培養(yǎng)基[8]。

1.1.3 主要試劑及設(shè)備 試劑：牛肉浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、吐溫、瓊脂等，溶菌酶、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、DNA mark，萬科公司；PCR引物，華大基因合成。所有試劑均為分析純級。

設(shè)備：FLC-3 超凈臺，哈爾濱市東聯(lián)公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；XSZ-G 型顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；TGL16M 型離心機(jī)，長沙市易達(dá)科貿(mào)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 摘除桑葚中的枝葉和雜物，用無菌水沖洗桑葚表面，在超凈工作臺中晾干，按桑葚∶白砂糖質(zhì)量比1∶1 混勻，放入滅菌的發(fā)酵玻璃罐中，置于暗處，室溫發(fā)酵66 d[9]。

1.2.2 樣品采集 在超凈工作臺中取桑葚酵素發(fā)酵前期（18 d）、中期（42 d）、后期（60 d）的樣品45 mL 于已滅菌的離心管中，用于宏基因組研究。

1.2.3 樣品測序流程 基因組DNA 抽提→PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化→熒光定量→Illumina PE 文庫制備→Illumina 高通量測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 本試驗數(shù)據(jù)通過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司多樣性測序及分析平臺完成。利用Trimmomatic 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，用flash軟件拼接完成。將通過OTU 聚類得到的代表序列采用Usearch 選出相似性在97%以上的序列，制得OTU 表格。

運用貝葉斯算法將97%相似水平的OTU 代表物種進(jìn)行物種組成統(tǒng)計分析。通過繪制稀釋性曲線、Shannon-Wiener 曲線及各微生物動態(tài)變化指數(shù)分析各樣品細(xì)菌和真菌多樣性及群落豐度變化[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚酵素樣品的高通量測序數(shù)據(jù)

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選得出優(yōu)化序列，以保證分析結(jié)果的質(zhì)量。在去除嵌合體序列后進(jìn)行OTU聚類分析，對OTU 的代表序列作分類學(xué)分析。桑葚酵素不同時期樣品的高通量測序結(jié)果見圖1、圖2、表1。

桑葚酵素樣品在97%的相似水平下經(jīng)序列優(yōu)化統(tǒng)計，表1、圖1可見獲得細(xì)菌的序列數(shù)在30 000～43 000 范圍，序列長度大部分分布在441～460 bp，OUT 數(shù)在40～80 范圍。表1、圖2可見獲得真菌的序列數(shù)在37 000～42 000 范圍，序列長度主要分布在381～400 bp 和401～420 bp 范圍，OUT 數(shù)在10～20 范圍。以上表明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌的序列數(shù)和OUT 數(shù)逐漸增加，真菌序列數(shù)和OUT 數(shù)則減少；細(xì)菌的多樣性隨發(fā)酵的進(jìn)行而增加，真菌的多樣性則逐漸降低，整個發(fā)酵過程中細(xì)菌的多樣性明顯優(yōu)于真菌。

圖1 優(yōu)化后的細(xì)菌序列長度分布圖Fig.1 The length distribution of the optimized bacterial sequence

圖2 優(yōu)化后的真菌序列長度分布圖Fig.2 The length distribution chart of the optimized fungi sequence

表1 3 個樣品的高通量測序數(shù)據(jù)Table1 High-throughput sequencing data of 3 samples

2.2 稀釋性曲線

稀釋性曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個體，統(tǒng)計這些個體所代表的物種數(shù)目，并以個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線[11]。稀釋曲線不僅可以反映不同樣本中物種豐富度，也可以說明測序數(shù)據(jù)的合理性。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。通過作稀釋性曲線可得出樣品的測序深度情況。桑葚酵素不同時期樣品的稀釋曲線見圖3、圖4。

圖3 3 個樣品中細(xì)菌的稀釋曲線Fig.3 The dilution curve of bacteria in 3 samples

圖4 3 個樣品中真菌的稀釋曲線Fig.4 The dilution curve of fungi in 3 samples

在使用97%相似度的OUT 水平上，隨著3 個樣品測序深度的增加，圖3和圖4顯示細(xì)菌和真菌OUT 的數(shù)量增加并呈現(xiàn)倒“J”型曲線，斜率先快速增加后逐漸減小，最終趨于平緩，即細(xì)菌和真菌含有的OTU 組數(shù)先迅速增加，然后趨于平緩，最終保持穩(wěn)定，表明在此測序深度能較準(zhǔn)確反映桑葚酵素前、中、后3 個時期樣品中微生物的豐富度和多樣性。

2.3 Shannon-Wiener 曲線

反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣本的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性[12]。曲線越平緩，說明測序數(shù)量越多，越能有效反映樣本中大多數(shù)微生物信息。桑葚酵素不同時期樣品的Shannon-Wiener 試驗結(jié)果見圖5、圖6。

Shannon 指數(shù)計算公式：

式中，Sobs——實際測量出的OUT 數(shù)目；ni——含有i 條序列的OUT 數(shù)目；N——所有的序列數(shù)。

由圖5、圖6可看出，在97%相似度水平上，起初曲線直線上升是由于3 個樣品對細(xì)菌和真菌的測序條數(shù)遠(yuǎn)不足覆蓋樣品所致。隨著3 個樣品測序量的增加，數(shù)值增大，直至平緩，表明測序接近飽和，增加序列無法發(fā)現(xiàn)更多OUT，可以分別反映桑葚酵素前、中、后期樣本中絕大部分的微生物信息。

圖5 3 個樣品中細(xì)菌的Shannon-Wiener 曲線Fig.5 The Shannon-wiener curve of bacteria in 3 samples

圖6 3 個樣品中真菌的Shannon-Wiener 曲線Fig.6 The Shannon-wiener curve of fungi in 3 samples

2.4 桑葚酵素發(fā)酵不同時期樣品的微生物多樣性分析

在OTU 聚類結(jié)果中，對單樣品進(jìn)行Alpha 多樣性分析，可估算環(huán)境群落物種的豐度和多樣性。分別用chao，ace 和simpson，shannon 表示菌群豐度指數(shù)和菌群多樣性指數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果見表2和表3。shannon 和simpson 可估計微生物多樣性，shannon 值越大，群落多樣性越高，而simpson 值越大，群落多樣性越低[13]。

表2 細(xì)菌多樣性指數(shù)Table2 Bacterial diversity indices

表3 真菌多樣性指數(shù)Table3 Fungi diversity index

Coverage 表示各樣本文庫的覆蓋率，Coverage值越高，樣本中序列被測出的可能性越大。由表2看出，桑葚酵素前、中、后期樣品中，細(xì)菌豐度指數(shù)Chao 值和Ace 值逐漸增加，樣品中OTU 數(shù)目也隨之增加，表明隨者發(fā)酵的進(jìn)行，桑葚酵素中細(xì)菌的物種總數(shù)增加，整個發(fā)酵環(huán)境適合細(xì)菌的生長于繁殖。Shannon 值先降低后增加，Simpon 值先上升后降低，表明隨著桑葚酵素發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌多樣性在發(fā)酵前期最高，之后降低再升高，呈波動狀態(tài)，推測受發(fā)酵環(huán)境pH 值的影響，發(fā)酵前期乳酸菌快速繁殖，產(chǎn)酸量增加，pH 值減小，抑制一些細(xì)菌的生長，導(dǎo)致細(xì)菌多樣性降低。隨后，發(fā)酵過程中微生物利用氨基酸或水解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致pH 值小幅上升并趨于平穩(wěn)。

由表3真菌多樣性指數(shù)可看出桑葚酵素不同時期樣品中，Chao 值逐漸降低，表明真菌物種總數(shù)在發(fā)酵過程中逐漸減少。Ace 值表明，OTU 數(shù)目先降低后有小幅增加，可能是受pH 值波動的影響。Shannon 值不斷減少，而Simpson 值不斷增加，表明真菌多樣性隨著桑葚酵素發(fā)酵的進(jìn)行逐漸降低。綜合來看，細(xì)菌豐度指數(shù)Chao 值、Ace 值和多樣性指數(shù)Shannon 值均比真菌高，Simpon 值比真菌低，也說明桑葚酵素發(fā)酵各時期細(xì)菌多樣性比真菌多樣性復(fù)雜。

2.5 桑葚酵素發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化

采用統(tǒng)計學(xué)方法分析單個樣品及多個樣品在不同分類水平上的群落變化情況。本試驗在屬的水平上分析桑葚酵素不同時期樣品微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化，結(jié)果見圖7、圖8。

由圖7可知，在屬水平上，桑葚酵素發(fā)酵過程中細(xì)菌主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等。桑葚酵素前、中、后期3 個樣品中乳桿菌屬所占比例最大，趨勢為先降低后升高，占比分別為80.19%，90.02%，85.72%，由此可判斷乳桿菌屬在發(fā)酵過程中為優(yōu)勢菌。其次，魏斯氏菌（前、中、后期占比分別為6.37%，2.01%，2.45%）和明串珠菌（前、中、后期占比分別為2.69%，0.81%，1.79%）所占比例先減少后有小幅度增加，而片球菌屬所占比例逐漸減少（前、中、后期占比分別為3.81%，1.47%，0.84%）。以上數(shù)據(jù)表明魏斯氏菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬主要作用于發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，環(huán)境pH 逐漸降低抑制其生長，其含量大幅減少，后期有小幅上升，可能是因pH 值波動所致。此外，呈現(xiàn)增長趨勢的菌屬有乳球菌屬（前、中、后期占比分別為0.44%，0.62%，1.33%）和葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）（前、中、后期占比分別為0.19%，0.18%，0.52%），醋酸桿菌屬（Acetobacter）（分別為0.46%，0.33%，0.36%）在整個發(fā)酵時期稍有降低，較穩(wěn)定存在。此外，還有一些致病菌以及一些尚未分類明確的細(xì)菌，它們所占的比例小，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，生長環(huán)境處于劣勢，其中致病菌大部分呈逐漸消亡的趨勢。在發(fā)酵前期乳桿菌屬最多，明串珠菌屬經(jīng)異型乳酸發(fā)酵，代謝產(chǎn)物除乳酸外還有乙醇、乙酸、甘露醇等，這些物質(zhì)與有機(jī)酸結(jié)合，對形成酵素特有風(fēng)味起決定性作用[14]。發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH 值下降使得對酸敏感的明串珠菌屬繁殖受到阻礙甚至凋亡，而片球菌屬、魏斯氏菌屬細(xì)菌耐酸性強(qiáng)，逐漸取代明串珠菌屬成為優(yōu)勢菌屬。在乳桿菌屬細(xì)菌發(fā)酵作用下，發(fā)酵環(huán)境酸度增加，產(chǎn)生的細(xì)菌素等可有利于一些雜菌的生存。乳桿菌通過同型發(fā)酵對酸性環(huán)境有較強(qiáng)的耐受力，存在于整個發(fā)酵過程。至于其它的菌，如醋酸桿菌穩(wěn)定存在；葡萄糖酸桿菌自發(fā)富集，在發(fā)酵后期增加到0.52%；醋酸菌大量繁殖，可利用由酵母菌代謝生成的乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，作為一種基礎(chǔ)分為物質(zhì)，對產(chǎn)品風(fēng)味形成有一定的作用。鑒于醋酸菌在醋酸發(fā)酵階段具有重要的功能，推測桑葚酵素發(fā)酵過程中很可能存在醋酸發(fā)酵階段。

由圖8可知，在屬水平上，桑葚酵素發(fā)酵過程中真菌主要為未分類酵母（Saccharomycetales）、漢遜酵母（Hanseniaspora）。漢遜酵母（前、中、后期占比分別為41.4%，0.53%，0.08%）在發(fā)酵前期最多，中、后期急劇下降，表明漢遜酵母在桑葚酵素發(fā)酵前期是優(yōu)勢真菌并發(fā)揮重要作用。除此之外，還有少量覆膜酵母（Galactomyces）（前、中、后期分別為0.14%，0，0）、分子孢子菌屬（Cladosporium）（前、中、后期分別為3.55%，0.08%，0.01%）和旋孢腔菌屬（Cochliobolus）（前、中、后期分別為1.31%，0.33%，0.01%）等病原菌，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，它們逐漸減少或死亡。同樣，在發(fā)酵前期有酵母菌目和酵母科中尚未明確的種類在發(fā)酵前期占較高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，它們逐漸減少甚至消亡。在發(fā)酵中、后期出現(xiàn)大量未知的真菌且發(fā)酵終止時還有。發(fā)酵過程中，酵母作為兼性厭氧菌可利用的糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳。微生物發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的過程，菌株種類多，許多病原菌可能受環(huán)境中高糖、酸度增加或者乙醇等有機(jī)物的影響而逐漸死亡。本試驗中桑葚酵素在高糖、高滲的環(huán)境，相對于很多微生物來說，本身環(huán)境惡劣，而酵母易分離于高糖環(huán)境中，在發(fā)酵初期酵母屬是真菌的優(yōu)勢菌群，之后隨著環(huán)境的變化或不同微生物間的相互作用，有未知真菌占有很大的比例。本試驗結(jié)果也反映出被人類探索出來的菌株資源有限，仍有豐富的資源及新的物種等待人們的探索和發(fā)現(xiàn)。

由以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：桑葚酵素發(fā)酵過程中微生物很豐富。根據(jù)細(xì)菌和真菌種類及數(shù)量的變化，可以推測桑葚酵素發(fā)酵過程中分為不同的階段。發(fā)酵前期酵母菌啟動發(fā)酵，分解環(huán)境中的可利用的糖產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，產(chǎn)生的乙醇由醋酸菌利用生成醋酸，而乳酸菌發(fā)酵始終貫穿于整個發(fā)酵時期。不同發(fā)酵階段發(fā)生著復(fù)雜的生化反應(yīng)及微生物間的相互作用，也因此賦予桑葚酵素獨特的風(fēng)味和口感。

圖7 3 個樣品在屬的水平上細(xì)菌組成Fig.7 The bacterial composition of 3 samples at the genus level

圖8 3 個樣品在屬的水平上真菌組成Fig.8 The fungi composition of 3 samples at genus level

3 結(jié)論

通過分析生物多樣性指數(shù)獲得桑葚酵素發(fā)酵過程中細(xì)菌較真菌豐富。桑葚酵素發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌是乳桿菌。優(yōu)勢真菌變化較大，在發(fā)酵前期是酵母，同時存在大量未知真菌。

4 討論

宏基因組學(xué)研究的對象是特定環(huán)境中的總DNA，對認(rèn)識和利用95%以上的未培養(yǎng)微生物提供了一條新的途徑。通過高通量測定微生物基因組上的16S rRNA 基因進(jìn)行生物多樣性分析，能夠提供更大的信息量，便于研究環(huán)境中物種的組成多樣性，然而多樣性分析對全面研究環(huán)境中的基因功能還有欠缺[15]。新一代高通量低成本測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用使多樣性的研究更加便利。

基于現(xiàn)今市場對食用植物酵素質(zhì)量安全性的迫切需要和宏基因組學(xué)測序技術(shù)的先進(jìn)性，本文利用宏基因組學(xué)方法對桑葚酵素不同發(fā)酵時期樣品進(jìn)行微生物多樣性分析，得出細(xì)菌生物多樣性大于真菌生物多樣性。在屬水平對微生物的多樣性進(jìn)行分析，主要的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬和酵母屬。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳桿菌屬占比最高并穩(wěn)定存在，魏斯氏菌和明串珠菌先減少后有小幅增加；片球菌逐漸減少；漢遜酵母在發(fā)酵前期最多，之后急劇下降。綜合來看這些菌屬都在發(fā)酵前期發(fā)揮重要作用，其中乳桿菌能夠利用桑葚發(fā)酵液中的糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，說明在桑葚酵素風(fēng)味形成中乳酸菌可能起重要作用。隨著發(fā)酵進(jìn)行，葡萄糖酸桿菌自發(fā)富集，因存在醋酸菌，故將前期酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酒精轉(zhuǎn)化為乙酸，產(chǎn)生基礎(chǔ)風(fēng)味物質(zhì)。桑葚酵素發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段的菌種演替、其它菌株的相互作用機(jī)理及某些菌株在發(fā)酵過程中的作用還有待深入研究。