超聲處理對黑豆蛋白與可溶性多糖復合物功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響

朱 穎 吳隆坤 賈有青 李 哲 肖志剛

（1 沈陽師范大學糧食學院 沈陽110034 2 東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 哈爾濱150030）

黑豆，又名黑大豆、料豆，呈卵圓形或球形，豆皮呈黑色，在豆類中蛋白質(zhì)的含量最高。黑豆不僅蛋白質(zhì)含量高于黃豆，異黃酮、維生素E 等營養(yǎng)物質(zhì)的含量也很高，素有“植物蛋白之王”的美譽[1]。研究表明黑豆蛋白的溶解分散性和乳化性以及乳化穩(wěn)定性優(yōu)越于大豆蛋白，而起泡性及起泡穩(wěn)定性較差[2]。對黑豆蛋白的研究大多數(shù)是對其提取方法進行研究，如采用超聲、微波等方法輔助提取黑豆蛋白[3-4]。黑豆蛋白提取率提高，可節(jié)約時間與能源。還有通過物理、化學和酶法等改變黑豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)和分子特性，從而改變蛋白的功能性質(zhì)；通過研究大豆蛋白與可溶性多糖的相互作用機制，研究其影響大豆蛋白的乳化性、起泡性等功能特性。

研究表明，蛋白質(zhì)可以通過靜電吸引與糖類形成靜電復合物，改變蛋白的表面電性，進而影響蛋白的乳化性能。樊雪靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白與寡糖形成的可溶性復合物的溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性均得到提高。

超聲波技術在各行業(yè)都有應用。超聲波可分為兩種：一種是功率超聲波（低頻率、高能量），另一種是檢測超聲波（高頻率、低能量）。功率超聲主要是進行超聲治療、超聲霧化等。檢測超聲中的超聲波主要作為信號使用。在食品行業(yè)中經(jīng)常使用超聲技術，如提取和分離、殺菌、干燥、乳化、檢測等方面[6]。超聲波技術為一種物理處理方法，被視為食品行業(yè)中“綠色加工”的發(fā)展需要，是當代食品行業(yè)研究中的新熱點[7]。

通過研究黑豆蛋白與可溶性多糖的協(xié)同作用，研究二者的復合物在不同超聲功率作用下的結(jié)合情況以及對黑豆蛋白功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響，為黑豆蛋白的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆，東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所；可溶性多糖，鄭州荔諾生物有限公司；金龍魚大豆油，市售。氫氧化鈉，天津市光復精細化工研究所；鹽酸，北京新光化工試劑廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；其它試劑的最低純度為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設備

LS-55 熒光分光光度計，美國PE 公司；UV-240IPC 紫外-可見分光光度計，日本島津公司；JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；LGR20-W 臺式高速冷凍離心機，北京京立離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆蛋白的制備 黑豆蛋白的制備參考Wolf[8]的方法。將新鮮黑豆用磨粉機研磨成磨粉并過60 目篩，將得到的豆粉以1∶3 的比例與正己烷混合，置水浴鍋中于40 ℃攪拌2 h，靜置一段時間后倒掉上清液，即1 次脫脂，重復脫脂過程3 次。將豆粉與蒸餾水以1∶10 的比例混合，用NaOH 溶液將混合液的pH 值調(diào)至8.5，放在水浴鍋中保持在45 ℃并用攪拌器攪拌2 h（在攪拌期間保持溶液的pH 8.5）。取出懸浮液在4 ℃、9 000×g 的條件下離心20 min，取其上清液用HCl 將溶液的pH值調(diào)節(jié)至4.5。放置一段時間后在4 ℃、6 000×g 條件下離心20 min，得到蛋白沉淀用蒸餾水洗2 次，最后用NaOH 將溶液的pH 值調(diào)節(jié)至7.0。將此溶液冷凍干燥后研磨即為黑豆蛋白。

1.3.2 黑豆蛋白與可溶性多糖復合物溶解性的測定 將所制備的蛋白與多糖按1∶1，1∶2，1∶3 的比例混合，溶解于蒸餾水中并調(diào)節(jié)溶液的pH 值為3.0。將溶液磁力攪拌3 h，加入0.02%的疊氮化鈉。用Lowry 法測定可溶性蛋白含量。

1.3.3 黑豆蛋白與可溶性多糖復合物乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定 復合物的乳化性釆用Li 等[9]的方法測定。分別取9 mL 復合物溶液加入3 mL 的菜籽油，在室溫（25 ℃）下用10 000 r/min 高速勻漿機均質(zhì)1 min，快速取出50 μL 樣品，用質(zhì)量分數(shù)0.1%的SDS 溶液稀釋250 倍，漩渦震蕩混勻后用紫外分光光度計在波長500 nm 處測定吸光值A0。靜置30 min 后用同樣方法測定吸光值A30。乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）計算公式如下：

式中：A0——最初的乳化液在500 nm 處的吸光值；C——乳化液形成之前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（g/mL）；Φ——菜籽油占乳化液的體積分數(shù)（φ=0.25）；A30——乳化液靜置30 min 后的吸光值。

1.3.4 黑豆蛋白與可溶性多糖復合物起泡性及氣泡穩(wěn)定性的測定 稱取0.605g tris 溶于50 mL 蒸餾水中，用2 mol/mL HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值為8.5，分別取復合物溶液2 mL 于試管中，各加入8 mL tris-HCl 緩沖液，用高速分散機均質(zhì)1 min。將均質(zhì)后的溶液快速轉(zhuǎn)移到25 mL 量筒中，每隔一段時間記錄泡沫的體積，通過觀察泡沫體積和靜置穩(wěn)定后的泡沫體積來評定樣品的起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）。計算公式為：

式中：V0——起泡0 h 時的泡沫體積/mL；Vt——起泡t h 后的泡沫體積/mL；Vi——起泡前最初液體的體積/mL。

1.3.5 超聲處理對復合物理化性質(zhì)的影響 黑豆蛋白與可溶性多糖以1∶2 的比例混合，溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液的pH 值為3.0，磁力攪拌溶液3 h 后，將復合物放在冰水浴中，將超聲探頭浸入液面以下2 cm 的位置，選用工作時間5 s，間隔時間5 s 的操作方法在特定超聲功率400 W[10]下分別超聲處理8，16，24 min，在波長500 nm 處測定超聲后3 種樣品的乳化性質(zhì)及起泡性質(zhì)。

1.3.6 熒光光譜測定 采用熒光光度計測定超聲處理后的蛋白-多糖復合液，將3 種樣品稀釋10倍后放入試管中。熒光光譜的激發(fā)波長為290 nm，掃描發(fā)射光譜范圍250～400 nm，掃描的速度60 nm/min，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm。

1.3.7 圓二光譜測定 在遠紫外區(qū)域進行圓二光譜測定，探究超聲對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。稱取一定量超聲處理后的樣品，溶于pH 7.0 的磷酸鹽緩沖溶液中，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL。圓二光譜在200～300 nm 之間掃描，試驗溫度20 ℃，樣品池的光學長度1 mm，敏感度100 med g/cm，掃描速度100 nm/min，分辨率0.1 nm。

1.3.8 統(tǒng)計分析 每個試驗重復3 次，通過SPSS2.0 軟件分析數(shù)據(jù)，采用SigmaPlot 12.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例黑豆蛋白-可溶性多糖復合物理化性質(zhì)比較

2.1.1 對溶解性的影響 將各標準溶液和待測液分別用紫外分光光度計測定其吸光度，繪制標準曲線，列出方程。該標準曲線的方程為y=0.448x-0.0083，回歸系數(shù)R2= 0.9908，線性良好，可以通過標準曲線計算復合物中蛋白質(zhì)的濃度。

將所測吸光度值帶入方程，得到3 種待測的蛋白濃度分別為0.36，0.29，0.49 mol/L。由此得知將大豆分離蛋白與可溶性多糖以1∶3 的比例混合時得到的復合物的蛋白溶解性最好。

2.1.2 乳化性質(zhì)比較 將樣品溶液加入菜籽油后均質(zhì)1 min，取樣加入SDS 溶液稀釋，在波長500 nm 處測定它的吸光值。分析圖1發(fā)現(xiàn)，1∶1 復合物的乳化性最差，1∶2 的復合物的乳化性最好。這是因為多糖的存在使蛋白的乳化性增加，多糖可與溶液中的蛋白質(zhì)發(fā)生反應，其中接枝的多糖所具有的空間位阻作用抑制了乳液液滴間的凝集，使乳液的穩(wěn)定性提高[11]。

將測定乳化性后的溶液靜置30 min，在波長500 nm 處測定其吸光值。分析圖1發(fā)現(xiàn)，1∶1 復合物在16.5 min 內(nèi)的乳化穩(wěn)定性較好，而1∶2 復合物在27.8 min 內(nèi)乳化穩(wěn)定性最好。這是因為黑豆蛋白中的蛋白質(zhì)與多糖形成的共價接枝物所具有的物理化學性質(zhì)，尤其是疏水和親水特性，使它們能夠穩(wěn)定泡沫體系[12]。

2.2 不同超聲處理時間對復合物的影響

2.2.1 乳化性質(zhì)的變化 經(jīng)分析，以1∶2 的比例混合時，蛋白與多糖復合程度較好。選用1∶2 的復合物進行相應試驗處理。選用工作時間4 s，間隔時間4 s 的操作方式，在一定的超聲功率下分別處理8，16，24 min。在波長500 nm 處測定它的吸光值。對圖2進行分析，發(fā)現(xiàn)超聲處理均不同程度地提高溶液的乳化性。不同的超聲處理使溶液發(fā)生物理振蕩，破壞分子結(jié)構(gòu)，分離蛋白發(fā)生部分展開并在油-水界面聚集，降低了溶液的表面張力，從而使乳化性有一定的提高[13]。超聲處理16 min 時，乳化值達到最大值。可能是因為超生處理時產(chǎn)生的空化和機械作用，使可溶蛋白成分中的4 級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，短時間內(nèi)釋放出小分子多肽分散到溶液中，增加復合物的溶解性，乳化性隨之增加。而隨著超聲時間的延長，產(chǎn)生的能量不能使這些小分子分散，分子間出現(xiàn)聚集，乳化能力下降。

將測定乳化性后的溶液靜置30 min，在波長500 nm 處測定其吸光度。根據(jù)圖2，超聲處理時間對復合物的乳化穩(wěn)定性影響較大，可能是由于超聲處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，有利于吸附在水-油界面。超聲處理使復合物的乳化穩(wěn)定性有一定提高。

圖1 不同比例黑豆分離蛋白-可溶性多糖復合物的EAI 和ESIFig.1 EAI and ESI of different black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

圖2 不同超聲處理時間的黑豆蛋白-可溶性多糖復合物的EAI 和ESIFig.2 EAI and ESI of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

2.2.2 起泡性質(zhì)的變化 復合物經(jīng)高速攪拌后，大量的氣體進入溶液中形成水-空氣界面，溶液表面張力降低后形成泡沫的能力即此復合體系的起泡性[14]。起泡性的變化與其溶液中蛋白結(jié)構(gòu)和物理化學性質(zhì)的變化有關。超聲處理有助于將蛋白質(zhì)分子解聚成小分子亞基，同時暴露了蛋白質(zhì)的疏水基團，增加了氣-水界面蛋白分子數(shù)目和與磷脂疏水結(jié)合的程度，從而不同程度地提高了起泡能力[15]。分析圖3，隨著超聲處理時間的增加，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)打開更完全，分子間重新聚集形成更大的聚集體，表現(xiàn)為溶液表面膜的穩(wěn)定性下降，從而起泡能力下降[16]。

分別取不同處理時間的混合溶液2 mL，加入8 mL pH 8.05 的0.05 mol/L Tris-HCL 緩沖液。室溫下用高速分散機均質(zhì)1 min，快速將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL 量筒中，每隔30 min 記錄泡沫的體積。計算復合液的起泡性。分析圖4，隨處理時間的延長，泡沫穩(wěn)定性均有所下降。

圖3 不同超聲處理時間的黑豆蛋白-可溶性多糖復合物的FCFig.3 FC of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

圖4 不同超聲處理時間的黑豆蛋白-可溶性多糖復合物的FSFig.4 FS of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

2.3 復合物的熒光分析

熒光光譜是一種可以反映蛋白質(zhì)3 級結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的靈敏且有效的方法。λmax大于280 nm。蛋白質(zhì)在多糖和超聲的雙重作用下構(gòu)象發(fā)生改變。高強度超聲波處理后蛋白質(zhì)分子發(fā)生一定的聚集，形成不溶性的蛋白質(zhì)，并且隨著超聲時間的延長，蛋白質(zhì)分子解聚成新的大分子物質(zhì)[17]，與可溶性多糖間的作用減弱。與此同時，多肽鏈及氨基酸殘基變化幅度較小，說明超聲對黑豆蛋白-可溶性多糖復合物之間的作用影響較小，而發(fā)色基團暴露在蛋白質(zhì)聚集體外側(cè)使其熒光性又有一定程度的升高。

圖5 不同超聲處理時間的大豆分離蛋白-可溶性多糖復合物的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectrum of different ultrasonication-treated time of soybean protein isolate and soluble polysaccharide complexes

2.4 圓二光譜分析

圓二光譜顯示超聲處理對黑豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。利用CD Pro 擬合軟件對圖譜進行分析計算，得到黑豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化情況，見表1。當超聲功率為400 W 時，隨著超聲時間的延長，黑豆蛋白中的α-螺旋含量上升，β-折疊下降，24 min 時變化較為明顯，這可能是功能性質(zhì)差異的原因。二級結(jié)構(gòu)的變化與Chandrapala 等[18]的研究結(jié)果相同。由于蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由氨基酸序列及其相互作用決定，上述結(jié)果可能表明超聲處理破壞分子間相互作用，導致蛋白質(zhì)柔性結(jié)構(gòu)的變化。與此同時Hu 等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)不僅超聲時間對蛋白結(jié)構(gòu)的影響較大，在不同超聲功率下蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化也存在差異。

表1 超聲處理后黑豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)的變化Table1 Secondary structural content of native and ultrasonication-treated black soybean protein estimated from circular dichroism spectra in the far-UV region

3 結(jié)論

采用超聲波處理的方法探究一定的超聲功率下不同超聲時間對黑豆蛋白與多糖復合物的功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)論如下：1）將黑豆蛋白與可溶性多糖以1∶3 的比例復合時，復合物中蛋白的溶解性最好；2）當?shù)鞍着c多糖以1∶2 的比例復合時，復合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性最好；3）超聲處理復合物時，處理時間為16 min 的混合液的乳化性最好，處理時間為8 min 的復合物的乳化穩(wěn)定性最好，而處理時間為24 min 的復合物的乳化穩(wěn)定性最差；4）隨著超聲時間的延長，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量上升，β-折疊下降，導致柔性區(qū)間變化，說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)密切相關。