擠壓和發(fā)酵對(duì)小米多肽ACE抑制活性及抗氧化作用的影響

侯殿志 陳 靜 沈 群

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 植物蛋白與谷物加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083）

高血壓是心血管疾病（如冠心病和外周動(dòng)脈疾病）發(fā)病的重要獨(dú)立因子之一。目前，大約有6種藥物應(yīng)用于高血壓的治療，其中ACE 抑制劑是一種治療高血壓的主要藥物。然而，這些藥物在治療高血壓的同時(shí)，伴有較多的不良副作用，如味覺紊亂、皮疹和咳嗽等[1]。而食物來源的ACE 抑制多肽更加安全和柔和，這些寡肽有望成為人們?nèi)粘ｏ嬍持幸环N新型的抗血壓成分[2]。食源性多肽除降壓作用外，往往伴隨抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫等功能，具有較好的熱、酸穩(wěn)定性、水溶性等優(yōu)點(diǎn)，可作為功能因子添加到食品中，具有廣泛的前景[3]。

許多來源于植物和動(dòng)物的蛋白質(zhì)被證實(shí)存在ACE 抑制多肽，如玉米[4]、油菜籽[5]、沙丁魚[6]和乳球蛋白[7]等。小米和玉米類似，主要貯藏蛋白為醇溶性蛋白，含有較多的疏水性氨基酸，且難溶于水，因此小米蛋白可能產(chǎn)生與玉米蛋白類似的降血壓肽。擠壓和發(fā)酵是食品加工過程中常用的技術(shù)，從原理來說，擠壓是通過壓力、溫度和機(jī)械剪切的組合導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生變化，而發(fā)酵是利用微生物產(chǎn)生的酸和酶等作用。目前，這兩種技術(shù)已用于大豆[8]、豌豆[9]、扁豆[10]和玉米[11]降血壓肽的制備。對(duì)于小米來說，擠壓和發(fā)酵不僅可以改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，還可以降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量[12-13]。

本試驗(yàn)以小米為原料，研究擠壓和發(fā)酵處理對(duì)小米蛋白消化率的影響，同時(shí)對(duì)在胃蛋白酶-胰酶水解條件下得到的小米多肽的ACE 抑制活性和抗氧化能力進(jìn)行分析，旨在為小米降壓肽或相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

東方亮小米，山西東方物化農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司。4 ℃貯藏，備用。

植物乳桿菌，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院功能乳品實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；釀酒酵母，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。胃蛋白酶（≥250 U/mg）、胰酶（8×USP）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH，2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl），Sigma-Aldrich 公 司；α-淀粉酶（1 048 U/mL），丹尼斯克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（AR5120），奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；分析天平（ACCULAB ALC-110.4），德國Sartorius 公司；pH 計(jì)（FE20），瑞士梅特勒-托利多公司；紫外分光光度計(jì)（UV-2102C），尤尼柯（上海）儀器有限公司；凱氏定氮儀（KDY-9820），北京通潤源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；電導(dǎo)率儀（FE30），瑞士梅特勒-托利多公司；雙螺桿擠壓（SLG30-IV），中國濟(jì)南賽百諾科技開發(fā)有限公司；恒溫磁力攪拌器（HWCL-5），中國鄭州長城儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)（JP-300B），浙江省永康市久品工貿(mào)有限公司；水浴恒溫振蕩器（SHA-BA），金壇榮華儀器制造有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-25C），北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司；電磁爐（EC21-21T03），廣東美的生活電器制造有限公司；滅菌鍋（LS-B35L），北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵過程中pH 值和菌落總數(shù)的測(cè)定 將擴(kuò)大培養(yǎng)14 h 的釀酒酵母和植物乳桿菌培養(yǎng)液分別4 ℃、4 000×g 離心5 min，棄上清液，收集菌體，在沉淀中加入適量無菌生理鹽水（0.85% NaCl），洗滌并離心，再棄上清液，重復(fù)兩次，最后在收集的菌體沉淀中加入10 mL 滅菌生理鹽水，振蕩混勻后作為種子菌液。取1 mL 菌懸液接種于100 mL 米漿中（米、水質(zhì)量比1∶10），于30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔4 h 取樣測(cè)定pH和菌落總數(shù)。

1.3.2 擠壓小米粉和植物乳桿菌發(fā)酵小米粉的制備

1）擠壓小米粉 將小米粉水分含量調(diào)節(jié)至16%；擠壓腔中4 個(gè)區(qū)溫度分別為：Ⅰ區(qū)溫度60℃，Ⅱ區(qū)溫度90 ℃，Ⅲ區(qū)溫度120 ℃，Ⅳ區(qū)溫度175 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速280 r/min。

2）植物乳桿菌發(fā)酵小米粉 取1 mL 植物乳桿菌懸液接種于100 mL 米漿中（米、水質(zhì)量比為1∶10），于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將樣品凍干，保存。

1.3.3 脫脂小米及小米粗蛋白的制備

1）脫脂小米的制備 將小米粉碎，按1 ∶5（m/V）加入正己烷，在室溫下脫脂24 h。若未脫除干凈，則可加入未用過的正己烷繼續(xù)脫脂。

2）小米粗蛋白的制備 將脫脂小米粉與去離子水按1∶5（m/V）在攪拌器上混合均勻。沸水浴糊化10 min，冷卻后，加入α-淀粉酶（30 U/g 底物），50 ℃恒溫水浴中保持2 h，然后將樣品取出，沸水浴20 min 滅酶。將樣品液10 000×g 離心15 min，去上清液，沉淀凍干、粉碎、過80 目篩，得到小米粗蛋白樣品。

1.3.4 小米蛋白消化率的測(cè)定 小米蛋白消化率的測(cè)定采用文獻(xiàn)[14]方法，并稍作調(diào)整。

將脫脂小米粉與去離子水按1 ∶5（m/V）在磁力攪拌器上混合均勻，沸水浴糊化10 min，冷卻后加入α-淀粉酶（30 U/g 底物），50 ℃恒溫水浴中保持2 h。然后，將樣品取出，沸水浴20 min 滅酶。當(dāng)樣品冷卻至37 ℃時(shí)，用2 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值為2.0。在水解過程中，用pH 計(jì)監(jiān)控pH 值變化，并隨時(shí)調(diào)節(jié)，然后，恒溫?cái)嚢?，轉(zhuǎn)速為180 r/min。當(dāng)樣品溶液溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，按E/S 4∶100 加入胃蛋白酶溶液（用0.1 mol/L HCl 溶液配制），水解2 h，然后，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值為8.0，按E/S 4∶100 加入胰蛋白酶溶液（用pH7.5 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制），水解2 h。在胃蛋白酶和胰酶消化10，30，60，90 min 和120 min 后，加入三氯乙酸（TCA）滅酶。將樣品液8 000×g 離心20 min，凍干。

體外消化率采用三氯乙酸-氮溶指數(shù)（TCANSI）法測(cè)定和計(jì)算。取5 mL 的不同消化液于5 mL 10% TCA 中，4 000×g 離心20 min，得到TCA不溶組分。TCA 不溶性氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定。消化過程氮釋放量計(jì)算公式：

式中：N0——蛋白樣品中的TCA 不溶性氮含量（mg）；Nt——消化t min 時(shí)的TCA 不溶性氮含量（mg）。

1.3.5 小米蛋白水解肽的制備 稱取適量小米蛋白樣品，按5%加入去離子水，混合均勻，使用胃蛋白酶-胰酶水解小米蛋白。胃蛋白酶-胰酶水解過程中，先利用胃蛋白酶水解2 h 后，再用胰酶水解2 h。水解后，沸水浴10 min 滅酶，將樣品液8 000×g 離心20 min，凍干。

1.3.6 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制活性的測(cè)定[15]采用96 孔酶標(biāo)儀測(cè)定小米多肽的ACE 抑制活性。以FAPGG 作為ACE 的底物，按照表1添加各個(gè)反應(yīng)的組分。將40 μL 樣品和HEPES 緩沖液（80 mmol/L，pH 8.3）加入96 孔板中，然后加入10 μL 0.1 U/mL ACE 溶液混合，最后加入50 μL FAPGG 溶液，在37 ℃條件保溫5 min，在波長340 nm 處測(cè)定吸光值。繼續(xù)保溫反應(yīng)至30 min，再次測(cè)定吸光值。

以單位時(shí)間內(nèi)吸光值變化表示ACE 酶活力，抑制劑對(duì)ACE 酶的抑制程度為ACE 抑制活性I（%）：

式中：ΔAC——空白組吸光值在30 min 內(nèi)的變化；ΔAS——樣品組吸光值在30 min 內(nèi)的變化。

IC50值是抑制50%的ACE 活性時(shí)，抑制劑的濃度。樣品中多肽濃度采用福林-酚法測(cè)定[16]。

1.3.7 抗氧化能力測(cè)定 DPPH 自由基清除能力和鐵離子還原能力分別采用De[17]和Benzie[18]的方法測(cè)定。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2016 和SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3 次。圖中不同字母表示差異在0.05水平顯著。

表1 ACE 抑制活性的測(cè)定方法Table1 Measuring method of the inhibitory activity of ACE

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵過程中pH 值和菌落總數(shù)的變化

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是食品工業(yè)中常用的發(fā)酵菌種。小米粉經(jīng)乳酸桿菌和釀酒酵母發(fā)酵，可有效改善小米中植酸含量、氨基酸組成等[19]。對(duì)植物乳桿菌和釀酒酵母在小米粉發(fā)酵過程中pH 值和菌落總數(shù)的變化情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

圖1 小米發(fā)酵過程中植物乳桿菌和釀酒酵母的（a）pH 和（b）菌落總數(shù)的變化Fig.1 Changes in pH（a）and total number of bacteria（b）of Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae during the fermentation process of foxtail millet

從圖1a 可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，副產(chǎn)物的不斷積累，植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵液的pH 值均呈下降趨勢(shì)。釀酒酵母在發(fā)酵12 h（pH 5.89）后，其pH 值基本穩(wěn)定；而植物乳桿菌發(fā)酵液的pH 值卻一直呈下降趨勢(shì)，其原因是植物乳桿菌屬于乳酸菌屬，發(fā)酵過程中乳酸產(chǎn)生量不斷增加，進(jìn)而pH 值不斷降低，這也說明植物乳桿菌在進(jìn)行新陳代謝。同樣，對(duì)比兩種菌體在小米發(fā)酵中的菌落總數(shù)變化（圖1b），自發(fā)酵開始，24 h 內(nèi)植物乳桿菌在小米基質(zhì)中的菌落總數(shù)始終高于釀酒酵母。12 h 時(shí)釀酒酵母的菌落總數(shù)達(dá)到最大值（5.75×106CFU/mL），之后菌體生長進(jìn)入衰退期，發(fā)酵基本趨于結(jié)束。然而，植物乳桿菌卻沒有因pH 值的持續(xù)下降而出現(xiàn)衰退的現(xiàn)象，在12 h 菌落總數(shù)達(dá)到2.70×107CFU/mL 后，趨于穩(wěn)定。從以上數(shù)據(jù)可以看出，植物乳桿菌在小米基質(zhì)中的生長優(yōu)于釀酒酵母，這說明經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵處理的小米粉的蛋白質(zhì)可能被分解為易于人體吸收的水解多肽。根據(jù)以上結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)選用植物乳桿菌發(fā)酵小米粉。

2.2 小米蛋白消化率

蛋白消化率是評(píng)價(jià)谷物營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，通常采用建立胃蛋白酶-胰酶體外模擬消化法對(duì)谷物在胃和小腸中的消化情況進(jìn)行評(píng)價(jià)[20]。高消化率的蛋白質(zhì)能夠提供更多的游離氨基酸和小肽給人體吸收。小米中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子[12]、蛋白質(zhì)的二硫鍵以及強(qiáng)烈的疏水特性[21]，使得其具有較低的蛋白質(zhì)消化率。合理的加工方式可改善對(duì)小米蛋白的消化率。圖2顯示原粉經(jīng)擠壓和發(fā)酵處理，其蛋白消化率變化情況。

由圖2可知，從整體上看，在240 min 的蛋白消化過程中，經(jīng)擠壓和發(fā)酵處理的小米蛋白的消化率上升趨勢(shì)基本高于原粉，說明擠壓和發(fā)酵均能不同程度地提高小米蛋白的消化率。相比發(fā)酵，擠壓對(duì)小米蛋白消化率的影響較大。經(jīng)120 min胃蛋白酶模擬消化后，原粉、植物乳桿菌發(fā)酵粉和擠壓粉的蛋白消化率分別達(dá)到17.60%，21.85%和46.00%，再經(jīng)120 min 的胰酶模擬消化后，其消化率分別上升至30.03%，35.78%和53.11%。對(duì)比240 min 時(shí)的原粉消化率，擠壓和發(fā)酵對(duì)小米蛋白消化率的提升率分別達(dá)到16.07%和76.86%。

擠壓和發(fā)酵對(duì)小米蛋白消化率的作用效果有差異，可能是由于擠壓的高溫短時(shí)剪切和摩擦作用處理，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，蛋白酶作用位點(diǎn)暴露，提高蛋白質(zhì)消化率[22]。趙學(xué)偉等[23]通過對(duì)擠壓條件的優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)小米-豆粕復(fù)合擠壓后蛋白體外消化率不同程度地提高。而對(duì)于植物乳桿菌，在對(duì)谷物發(fā)酵過程中，基質(zhì)pH 值的下降可激活谷物內(nèi)源性蛋白酶，使大分子蛋白質(zhì)解聚，同時(shí)產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)蛋白進(jìn)行部分水解，從而提高蛋白的消化率[24]。另外，劉思思等[21]對(duì)小米粉進(jìn)行純種發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵可以降低小米中影響蛋白消化率的抗?fàn)I養(yǎng)因子——植酸的含量。然而，發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，且微生物代謝產(chǎn)物等也會(huì)抑制植物乳桿菌的生長，造成菌活下降，隨之蛋白水解及產(chǎn)酸能力下降，對(duì)蛋白質(zhì)的作用能力有限。綜上，擠壓對(duì)小米蛋白消化率的提高能力更明顯。

2.3 ACE 抑制活性分析

經(jīng)胃蛋白酶-胰酶水解得到的小米原粉，擠壓粉和植物乳桿菌發(fā)酵粉多肽都具有一定的ACE抑制活性（圖3）。

圖2 小米原粉、擠壓粉和植物乳桿菌發(fā)酵粉的蛋白體外消化率變化Fig.2 Changes in vitro protein digestibility of raw，Lactobacillus plantarum and extruded foxtail millet

圖3 小米原粉、擠壓粉和植物乳桿菌發(fā)酵粉多肽ACE 抑制活性變化Fig.3 Changes in ACE inhibitory activity of peptide from raw，extruded and Lactobacillus plantarum fermented foxtail millet

從圖3可以看出，經(jīng)胃蛋白酶-胰酶水解得到的小米原粉，擠壓粉和植物乳桿菌發(fā)酵粉多肽都具有一定的ACE 抑制活性。相比原粉，同樣處理?xiàng)l件下，經(jīng)擠壓處理的小米多肽ACE 抑制活性顯著提高（P＜0.01），而經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵導(dǎo)致小米多肽ACE 抑制活性顯著降低（P＜0.01）。原粉、擠壓粉和植物乳桿菌發(fā)酵粉制備的多肽ACE 抑制活性之間存在顯著性差異。小米擠壓粉蛋白水解肽的IC50值最低（0.057 mg 肽/mL），即具有最強(qiáng)的ACE 抑制活性。

擠壓作用使小米蛋白的消化率顯著提高，說明對(duì)其的降解作用也更明顯，進(jìn)而ACE 抑制活性強(qiáng)。由于菌體特殊的微生物學(xué)特性，所以發(fā)酵過程可能造成小米蛋白復(fù)雜的生化變化，進(jìn)而影響生物活性物質(zhì)的生成及終產(chǎn)品的生理功能[25]。從試驗(yàn)結(jié)果可知，植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)小米多肽ACE 抑制活性的作用效果較差。ACE 抑制肽活性的強(qiáng)、弱與其結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量分布等也有著緊密的聯(lián)系[26]，其內(nèi)在機(jī)理還需研究。

2.4 抗氧化能力分析

小米蛋白經(jīng)酶解釋放出有特殊活性的肽段，其中抗氧化能力也是其重要活性之一。經(jīng)胃蛋白酶-胰酶水解得到的小米原粉、擠壓粉和植物乳桿菌發(fā)酵粉多肽的DPHH 自由基清除能力和鐵離子還原能力變化情況如圖4a 和4b 所示。

圖4 小米原粉、擠壓粉和發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除能力（a）和鐵離子還原能力變化（b）Fig.4 Changes in DPPH free radical scavenging ability（a）and ferric reducing ability of plasma（b）of peptides from millet raw powder，extruded powder and fermented powder

由圖4a 和4b 可知，擠壓粉和植物乳桿菌發(fā)酵粉多肽的DPPH 自由基清除能力（10.99 μmol/g肽）和鐵離子還原力（82.92 μmol/g 肽）基本高于相應(yīng)的原粉多肽。相比于原粉，擠壓和發(fā)酵處理對(duì)小米多肽的抗氧化能力都有顯著的提高（P＜0.01），且各存在顯著性差異。曹亞蘭等[27]對(duì)大豆肽的抗氧化研究表明，擠壓預(yù)處理可顯著提高大豆肽的抗氧化活性。擠壓可使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)伸展、重組，表面電荷重新分布趨向均勻化，分子間氫鍵、二硫鍵等部分?jǐn)嗔?，暴露出更多的酶切位點(diǎn)，提高了酶解敏感性[22]，進(jìn)而提高小米多肽的抗氧化能力。王宏茲等[28]研究發(fā)現(xiàn)，與紫薯原粉相比，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的紫薯粉抗氧化能力顯著提高。植物乳桿菌發(fā)酵使小米蛋白中氨基酸組成和含量發(fā)生變化，進(jìn)而可能影響其抗氧化活性[19]。另外，多肽的抗氧化能力可能與其氨基酸組成和順序有關(guān)[29]。

3 結(jié)論

小米粉經(jīng)擠壓和發(fā)酵處理后，其蛋白消化率均提高。比較而言，擠壓對(duì)小米蛋白消化率的提高幅度更大一些。另外，同樣處理?xiàng)l件下，與原粉相比，經(jīng)胃蛋白酶-胰酶水解得到的擠壓小米多肽能夠顯著提高ACE 抑制活性（P＜0.01）；經(jīng)胃蛋白酶-胰酶水解得到的擠壓和發(fā)酵小米多肽的DPPH 自由基清除能力和鐵離子還原能力都顯著提高（P＜0.01）。由此可見，從擠壓小米蛋白的胃蛋白酶-胰酶水解物中繼續(xù)篩選高活性的ACE 抑制劑，是進(jìn)一步研究小米功能的一條新途徑?；诒驹囼?yàn)研究結(jié)果，未來還將探討更多的加工方式對(duì)小米多肽ACE 抑制活性和抗氧化能力的影響。