草莓酵素發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物及抗氧化性的變化研究

陳小偉 程勇杰 蔣立新 崔艷麗 毛建衛(wèi)，3 沙如意*

（1 浙江科技學(xué)院生化學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州310023 2 浙江大學(xué)化學(xué)系 杭州310027 3 浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江紹興312000）

自由基（Free radical）在人體內(nèi)由正常代謝產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生危害，能夠降低細(xì)胞抵抗力，引起線粒體的結(jié)構(gòu)損傷，從而造成細(xì)胞老化，引起帕金森綜合癥，還能破壞碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)構(gòu)型，從而使人體免疫力下滑，動(dòng)脈粥樣硬化，形成致癌物質(zhì)等[1-2]。日益加快的生活節(jié)奏，使人們的飲食、運(yùn)動(dòng)皆受到影響，飲食不規(guī)律，長(zhǎng)時(shí)間不運(yùn)動(dòng)等都會(huì)使人體內(nèi)自由基積累，從而引起免疫力降低，患病率上升。

食用植物酵素（Edible Plant Jiaosu）具有自由基清除能力，對(duì)由人體內(nèi)自由基積累過多引發(fā)的各種疾病有顯著的預(yù)防作用[3]。食用植物酵素不僅保留了植物原料中原有的功效成分，而且經(jīng)過益生菌代謝作用，其中較難利用的活性物質(zhì)被進(jìn)一步降解，其次級(jí)代謝產(chǎn)物及部分小分子成分有利于機(jī)體的吸收與利用[4-5]。

草莓（Strawberry）為薔薇科（Rosaceae）植物[6]，目前主要以初級(jí)加工制品，如新鮮水果和草莓干等形式投放市場(chǎng)，存在產(chǎn)品開發(fā)價(jià)值低和附加值不高等問題。如將草莓加工成富含高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的草莓酵素，則有利于草莓產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)和高值化利用。研究發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物和抗氧化活性變化情況對(duì)草莓酵素發(fā)酵調(diào)控、品質(zhì)控制和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)至關(guān)重要。

本文以草莓酵素為對(duì)象，研究不同發(fā)酵時(shí)間的總糖、總酸、檸檬酸、L-蘋果酸、醋酸、乳酸、總酚等活性成分的變化，檢測(cè)草莓酵素對(duì)3 種自由基（DPPH、羥基和ABTS）的清除效率，并考察其對(duì)還原力的影響，以期構(gòu)建有關(guān)草莓酵素的綜合性指標(biāo)評(píng)價(jià)體系，進(jìn)而為草莓酵素的精準(zhǔn)制備和發(fā)酵控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 草莓：2017年3月采于浙江湖州；發(fā)酵用糖：由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑 甲醇、蒽酮、福林酚（10 %）、三羥甲基氨基甲烷【（HOCH2）3CNH2】、雙氧 水（H2O2）、鐵氰化鉀、三氯化鐵，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸、2，2-聯(lián)氮基-雙-二胺鹽（ABTS）、抗壞血酸（VC），阿拉丁試劑有限公司（上海）；1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH），TIC 公司。以上試劑均為分析純級(jí)。

檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)物、醋酸標(biāo)準(zhǔn)物、乳酸標(biāo)準(zhǔn)物，阿拉丁試劑有限公司（上海）；DL-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)物，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.3 儀器 PHS-3C 型酸度計(jì)，杭州齊威儀器有限公司；Waters e2695 液相色譜，美國(guó)Waters 公司；UV-5500 PC 型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。50 L 316 L 型不銹鋼發(fā)酵罐，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草莓酵素的制備 使用常溫?zé)o菌水輕輕沖洗草莓，自然瀝干，切片，按草莓與糖液質(zhì)量比3∶4加入無菌發(fā)酵罐中，再加入適量酵液，于室溫條件下避光發(fā)酵，于發(fā)酵第10，20，30，50，75 和110天分別取樣，置于8 000 r/min 條件下，離心10 min，棄沉淀物，將得到的草莓酵素上清液置于-20 ℃保存，待測(cè)。

1.2.2 總糖含量的測(cè)定 參照張曉靜[7]的方法，采用蒽酮-H2SO4比色法分析不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素中的總糖。

1.2.3 總酸含量和pH 值的測(cè)定 總酸含量的測(cè)定：采用電位滴定法檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素的總酸含量。根據(jù)滴定樣品稀釋液與檸檬酸溶液消耗的NaOH 溶液量，計(jì)算樣品中的總酸含量（檸檬酸當(dāng)量）。

利用酸度計(jì)直接測(cè)定草莓酵素發(fā)酵液的pH。

1.2.4 特征性有機(jī)酸含量的測(cè)定 參照蔣增良等[8]的方法，采用HPLC 法檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素的有機(jī)酸含量。

待測(cè)樣品的預(yù)處理：取草莓酵素樣品，用1.36 g/L KH2PO4緩沖液稀釋至一定的倍數(shù)，將稀釋液通過孔徑0.22 μm 的濾膜，透過液備用。

1.2.5 總酚含量的測(cè)定 參照蔣增良等[9]的方法，采用福林酚法檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素的總酚含量。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 參照沙如意等[10]的方法測(cè)定。

1.2.7 羥基自由基清除能力的測(cè)定 參照裴智山等[11]和Wang 等[12]的方法測(cè)定。

1.2.8 ABTS 自由基清除能力的測(cè)定 參照杜國(guó)榮等[13]的方法測(cè)定。

1.2.9 還原力的測(cè)定 參照Y?ld?r?m 等[14]的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中總糖含量的變化

采用硫酸-蒽酮法建立總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，相關(guān)系數(shù)R2=0.9990，說明當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為10～80 μg/mL 時(shí)，吸光度和濃度呈良好的線性擬合度。以糖類物質(zhì)作為微生物發(fā)酵過程中的主要碳源，通過總糖含量變化分析微生物生長(zhǎng)和代謝狀況。由圖2可知，在發(fā)酵的前30 d，總糖濃度呈顯著下降的趨勢(shì)，說明此階段微生物的生長(zhǎng)比較旺盛，糖類物質(zhì)主要用于微生物的增殖和合成代謝。發(fā)酵至第50 天，總糖含量降到0.38 g/mL，為發(fā)酵第10 天總糖濃度的46.02%，之后，總糖含量趨于穩(wěn)定并有緩慢增加的趨勢(shì)。發(fā)酵至第110 天，總糖濃度相比最低點(diǎn)（第50 天）上升了8.07%，這可能是因?yàn)殡S著微生物的大量繁殖和代謝，發(fā)酵液中的總糖濃度下降，使得微生物通過分解作用利用草莓原料中的糖類物質(zhì)，促進(jìn)更多的糖類物質(zhì)溶于發(fā)酵液中。張靜雯等[15]對(duì)蘋果酵素發(fā)酵過程中總糖含量進(jìn)行追蹤發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前15 d總糖含量下降明顯，微生物迅速擴(kuò)增，大量消耗糖類物質(zhì)，之后總糖含量緩慢回升，微生物分解蘋果，部分含糖代謝產(chǎn)物生成，使得酵素總糖含量升高?？偺呛康淖兓c微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝作用有極大關(guān)系，這與本研究中觀察的現(xiàn)象一致。

圖1 總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of total sugar

圖2 草莓酵素發(fā)酵過程中的總糖消耗量Fig.2 The consumption of total sugar in strawberry jiaosu fermentation

2.2 發(fā)酵過程中總酸含量與pH 值的變化

pH 值可以反映發(fā)酵過程的異常情況，總酸同樣表明發(fā)酵過程中微生物的代謝變化情況。草莓原料中有機(jī)酸的主要組成為檸檬酸[16]。本文采用檸檬酸為對(duì)照，得到草莓酵素各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的總酸含量的變化趨勢(shì)（圖3）。在草莓酵素發(fā)酵前20 d，發(fā)酵液中的總酸含量較低，維持在（15.54 ±1.25）mg/mL，呈緩慢增加的趨勢(shì)，此時(shí)微量酸類物質(zhì)產(chǎn)生可能是因微生物尚未快速生長(zhǎng)代謝，由草莓原料汁液中有機(jī)酸滲出所致。當(dāng)發(fā)酵20～30 d時(shí)，總酸含量顯著增長(zhǎng)，這主要是由于酵母菌等微生物大量繁殖，產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物（如乳酸和醋酸等有機(jī)酸）所致。相應(yīng)地，pH 值迅速下降，這與圖1中總糖含量顯著降低的趨勢(shì)相一致。發(fā)酵第75 天，總酸含量不斷累積至78.98 mg/mL，隨后總酸含量輕微下降，可能是因?yàn)檩^低的pH 值會(huì)較大程度地影響益生菌的繁殖以及代謝，進(jìn)而降低了醋酸等有機(jī)酸的積累；在發(fā)酵后期，乳酸菌等益生菌旺盛的繁殖、代謝，乳酸發(fā)酵占據(jù)主導(dǎo)地位，多元酸的持續(xù)降解導(dǎo)致總酸含量略有下調(diào)。萬春美等[17]以茶糖水為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，加入紅茶菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中加入糖越多，細(xì)菌繁殖速度越快，菌落總數(shù)迅速達(dá)到最大值，然而維持時(shí)間較短。發(fā)酵30 d 后，發(fā)酵液中總糖含量顯著下降造成微生物增殖速度變緩，有機(jī)酸亦可能被某些益生菌作為替代碳源被部分消耗，這也是導(dǎo)致總酸含量降低的另一原因。

圖3 草莓酵素不同發(fā)酵時(shí)間總酸、pH 的變化Fig.3 Changes in pH value，total titratable acidity during strawberry jiaosu fermentation

2.3 發(fā)酵過程中特征有機(jī)酸含量的變化

食用植物酵素制備過程中最常見的3 種菌種主要是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[18]。對(duì)食用植物酵素發(fā)酵過程中醋酸和乳酸等含量的變化研究有助于了解發(fā)酵狀態(tài)和發(fā)酵階段。草莓果實(shí)中含量最高的兩種有機(jī)酸是檸檬酸和L-蘋果酸[16]。本文主要以檸檬酸、L-蘋果酸、醋酸和乳酸為研究對(duì)象，考察草莓酵素于其發(fā)酵過程中4 種有機(jī)酸含量的變化情況。計(jì)算并繪制上述4 種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示?？梢? 種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性回歸擬合度，R2均高于0.99。

測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素發(fā)酵液中4 種有機(jī)酸含量，由圖4可知，整個(gè)發(fā)酵過程中，總酸含量與4 種有機(jī)酸含量的增長(zhǎng)趨勢(shì)相同，發(fā)酵110 d 后4 種有機(jī)酸總含量輕微降低。發(fā)酵前20 d，發(fā)酵液中未檢測(cè)到醋酸和乳酸，檸檬酸和L-蘋果酸含量?jī)H緩慢上升，總糖含量明顯下降，總酸度顯著降低，這說明在發(fā)酵前期主要是酵母菌利用糖類物質(zhì)生成丙酮酸、乙醇等代謝產(chǎn)物。發(fā)酵30 d 后，醋酸和乳酸含量快速增長(zhǎng)，說明30 d 后醋酸菌開始利用酵母菌產(chǎn)生的乙醇合成醋酸，乳酸菌利用原料中溶出的L-蘋果酸合成乳酸，導(dǎo)致L-蘋果酸含量停止上升并維持在一個(gè)較為穩(wěn)定的水平，而乳酸積累量有所增加。發(fā)酵后期L-蘋果酸的積累量緩慢降低，可能是經(jīng)由蘋-乳代謝路徑，乳酸菌將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸產(chǎn)物。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table1 Standard curves of organic acids

2.4 草莓酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

草莓中酚類含量與其抗氧化活性有著密切的關(guān)系[19]。從圖5可以發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵過程中，總酚含量呈先明顯增加后有所降低的變化趨勢(shì)。發(fā)酵至第50 天，總酚積累量達(dá)到最高值，為1.67 mg/mL。50 d 內(nèi)，特別是發(fā)酵20～30 d，總酚含量極速上升，一方面，可能是這個(gè)時(shí)間段草莓在高滲透壓作用下多酚類物質(zhì)大量溶出；另一方面，可能是此時(shí)草莓酵素中微生物的生長(zhǎng)代謝較為迅速，消耗原料中的某些成分進(jìn)而合成多酚類化合物或者酚類物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化所致。Dordevic等[20]以覆盆子為原料，在未添加酵母、15 ℃發(fā)酵72 h 后，總酚含量由初始的1 415.7 mg GAE/L，增到2 191 mg GAE/L；在22 ℃同條件發(fā)酵時(shí)，總酚含量達(dá)2 820 mg GAE/L。30～50 d，微生物作用下草莓酵素發(fā)酵液中多酚含量進(jìn)一步提高。延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間后，微生物繼續(xù)消耗糖分，液相中生成的酚類物質(zhì)和原料中溶出的酚類含量趨于平衡。此外，總酚含量上升，對(duì)微生物的生長(zhǎng)起到一定的抑制作用[21]。部分生存能力強(qiáng)的微生物逐漸適應(yīng)總酚濃度較高的發(fā)酵液，并利用酚類物質(zhì)合成其它次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而導(dǎo)致總酚類物質(zhì)含量稍微下降。

2.5 草莓酵素發(fā)酵過程中抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià)

2.5.1 DPPH 自由基清除能力變化 隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，草莓酵素對(duì)DPPH 自由基清除率指標(biāo)的影響如圖6所示。發(fā)酵前75 d，草莓酵素對(duì)DPPH 自由基的清除率呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)。草莓酵素發(fā)酵75 d 時(shí)，其清除率達(dá)最高值80.96%。發(fā)酵前50 d，對(duì)DPPH 自由基的清除率呈顯著上升趨勢(shì)，50 d 后趨于平穩(wěn)，有小幅下降，這可能與微生物對(duì)總酚的降解作用有直接的關(guān)系。相比較于發(fā)酵10 d，發(fā)酵至110 d 清除率提高了861.91%，說明較長(zhǎng)的時(shí)間發(fā)酵有利于大幅提升草莓酵素清除DPPH 自由基的能力。此外，草莓酵素發(fā)酵過程中，發(fā)酵液對(duì)DPPH 自由基清除率與發(fā)酵液中總酚含量具有相似的變化趨勢(shì)，表明清除DPPH 自由基的能力與酚酸類化合物之間有一定的相關(guān)性。在發(fā)酵第0～75 d，草莓酵素對(duì)DPPH 自由基的清除能力持續(xù)提高，之后總酚含量略微下降，其DPPH 自由基清除率亦隨之略有下降。綜上可知，草莓酵素中的酚類物質(zhì)對(duì)DPPH 清除能力有一定的貢獻(xiàn)。

圖4 發(fā)酵過程中4 種有機(jī)酸變化圖Fig.4 Changes of four organic acids in the fermentation process

圖5 草莓酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.5 Changes of total phenolic content in the fermentation of Strawberry Jiaosu

2.5.2 羥基自由基清除能力的變化 羥基自由基是人體內(nèi)常見的自由基之一，可以破壞紅細(xì)胞，對(duì)DNA、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)造成危害[22]。不同發(fā)酵階段的草莓酵素清除羥基自由基清除率的變化情況如圖7所示。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，導(dǎo)致草莓酵素清除羥基自由基的能力明顯增強(qiáng)，50 d 時(shí)清除率達(dá)到最高值76.44%，而在發(fā)酵前20 d 呈現(xiàn)促氧化現(xiàn)象，草莓酵素發(fā)酵液中可能含有某些促羥基自由基氧化的物質(zhì)，第20 天，促氧化與抗氧化作用基本達(dá)到平衡。發(fā)酵20 d 后抗氧化效果上升顯著，50～75 d清除率趨于穩(wěn)定，發(fā)酵75 d 后清除率略微下降，這可能與微生物的衰亡有關(guān)。Jayabalan R[23]研究發(fā)現(xiàn)，在紅茶菌發(fā)酵過程中，細(xì)菌和酵母代謝產(chǎn)生的部分酶，極可能引起茶中成分的結(jié)構(gòu)修飾，使其對(duì)氮氧化物和超氧化物自由基兩者的清除能力得到增強(qiáng)，而對(duì)于羥基自由基，清除效果表現(xiàn)不佳。由此可見，對(duì)羥基自由基清除的能力因原料種類而異。目前關(guān)于草莓發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物以及清除羥基自由基的能力報(bào)道很少。郭玉華等[24]發(fā)現(xiàn)草莓本身對(duì)羥基自由基具有清除能力，推測(cè)發(fā)酵前期的促氧化作用很可能與原料表面帶入的細(xì)菌、酵母等產(chǎn)生的酶有關(guān)。

圖6 草莓酵素對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.6 The DPPH free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

圖7 草莓酵素對(duì)羥基自由基的清除率Fig.7 The hydroxyl free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

2.5.3 ABTS 自由基清除能力的變化 除DPPH自由基外，ABTS 自由基同樣可用于評(píng)估體外抗氧化活性，在生物制品抗氧化活性的判定中具有較好的應(yīng)用。Floegel 等[25]通過對(duì)比DPPH、ABTS 自由基檢測(cè)50 種果蔬的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，利用ABTS 自由基清除率表征的抗氧化指標(biāo)更能顯著體現(xiàn)果蔬的抗氧化水平。通常情況下，對(duì)于高富含植物色素，疏水性強(qiáng)的抗氧化劑，通過ABTS 測(cè)定比DPPH 方法能更好地反映各種樣品中的抗氧化能力。草莓酵素對(duì)于ABTS 自由基清除率的時(shí)間-效應(yīng)曲線見圖8。當(dāng)樣品取樣量為150 μL 時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品對(duì)ABTS 自由基的清除率持續(xù)上升，在發(fā)酵20～30 d 之間上升顯著，發(fā)酵至50 d 時(shí)對(duì)ABTS 自由基的清除率高達(dá)98.39%，然后趨于穩(wěn)定。由于發(fā)酵時(shí)間再次延長(zhǎng)，草莓酵素的ABTS 自由基清除率逐漸上升甚至接近100%。蔣增良等[9]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酵素天然發(fā)酵過程中總酚的積累量與其抗氧化指標(biāo)（ABTS 自由基清除率）之間有明顯的相關(guān)性，因此推斷草莓酵素所具有的良好的清除ABTS 自由基的能力可能與酚酸類物質(zhì)的含量密切相關(guān)。

2.5.4 還原力的變化 還原力亦為評(píng)估體外抗氧化活性的另一重要方法。在一定范圍內(nèi)，還原力越大，抗氧化活性越好。圖9顯示不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素的還原力的變化。

圖8 草莓酵素對(duì)ABTS 自由基的清除率Fig.8 The ABTS free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

圖9 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.9 Changes in reducing power during fermentation

如圖9所示，在發(fā)酵的前30 d，還原力上升較為明顯，30 d 后保持緩慢上升。整個(gè)發(fā)酵過程中，還原力的增長(zhǎng)呈現(xiàn)“先快后慢”的變化趨勢(shì)，這與上述3 種抗氧化指標(biāo)的變化趨勢(shì)均有一定相似之處。在取樣量為75 μL，發(fā)酵110 d 時(shí)還原力達(dá)到0.78。然而，在整個(gè)發(fā)酵過程中，還原力與其余3種抗氧化指標(biāo)仍存有一定的差別。還原力是一個(gè)綜合性抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)，與多種抗氧化機(jī)制有關(guān)，包括過多金屬離子型的催化劑、已結(jié)合自由基的清除、過氧化物的分解反應(yīng)等[26]。

2.6 主成分分析

草莓酵素發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中各種代謝產(chǎn)物，如總酸、總酚、醋酸、總糖、檸檬酸、L-蘋果酸、乳酸等含量，可能與各抗氧化指標(biāo)性能有內(nèi)在聯(lián)系，然而各種活性物成分含量與各抗氧化指標(biāo)變化趨勢(shì)并不完全一致。為了綜合考慮各組分和指標(biāo)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素品質(zhì)和功效的影響，采用主成分分析法建立草莓酵素的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

首先，對(duì)發(fā)酵過程中各成分與抗氧化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。發(fā)酵過程中各參數(shù)相關(guān)性見表2。草莓酵素的4 種抗氧化指標(biāo)之間具有顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），且與總酚和總酸的積累量之間也有顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），說明草莓酵素中所含酚酸類物質(zhì)和有機(jī)酸等均有一定的抗氧化功能。其中檸檬酸和L-蘋果酸與抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)之間存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01）。總糖和pH 值與其它參數(shù)均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中益生菌消耗糖類物質(zhì)，代謝積累酸類物質(zhì)等有關(guān)。

表2 發(fā)酵過程中各參數(shù)相關(guān)性Table2 Correlation of parameters during fermentation

草莓酵素發(fā)酵過程代謝產(chǎn)物種類多，而且比較復(fù)雜。為了更加清晰地揭示各代謝產(chǎn)物與各抗氧化指標(biāo)之間聯(lián)系，采用主成分分析法（PCA）對(duì)上述相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析。以特征值為依據(jù)，依次提取第1 主成分及第2 主成分（兩者貢獻(xiàn)率分別達(dá)到94.98%和3.31%）。主成分分析所得載荷圖如圖10所示，各指標(biāo)間的距離很好地反映了彼此的相關(guān)性程度?？偺桥cpH 在第1 和第2 主成分中均為負(fù)值，相距較近。其它檢測(cè)參數(shù)則位于載荷圖中的第1 象限，各指標(biāo)的第1 和第2 主成分系數(shù)均數(shù)值較大，且彼此間相距不遠(yuǎn)，從而表明這10 個(gè)參數(shù)均存在顯著的相關(guān)性，驗(yàn)證了之前的相關(guān)性分析結(jié)果。

發(fā)酵過程中草莓酵素的主成分樣品得分圖見圖11。發(fā)酵第10 天和第20 天第1 主成分與第30，50，75，110 天位置相聚較遠(yuǎn)，說明它們之間的性質(zhì)差別較大，發(fā)酵10 d 與50 d，發(fā)酵20 d 和30 d，第2 主成分相差不大，說明兩者間的主要差別在第1 主成分。發(fā)酵75 d 后第1 主成分與前50 d無顯著差異，不過第2 主成分得分明顯提高。依據(jù)各發(fā)酵時(shí)間的主成分得分不同，將不同發(fā)酵時(shí)間的草莓酵素樣品分為3 個(gè)階段。以主成分分析法為基礎(chǔ)，建立草莓酵素的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)體系（Comprehensive evaluation index，CEI）。按照公式（1）計(jì)算，求得CEI 值。

圖10 主成分分析的載荷圖Fig.10 Loading diagram of principal component analysis

圖11 主成分樣品得分圖Fig.11 Main component sample score chart

不同發(fā)酵時(shí)間的草莓酵素樣品的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)見圖12。發(fā)酵第10 天CEI 值最低，發(fā)酵20～30 d 綜合評(píng)價(jià)值顯著提高，發(fā)酵30 d 后CEI 值趨于穩(wěn)定，發(fā)酵第75 天CEI 值最高，發(fā)酵至110 d CEI值輕微下降，此作為草莓酵素前發(fā)酵結(jié)束的依據(jù)，為后續(xù)流加碳源、接種菌液的時(shí)間點(diǎn)判斷提供可靠的理論支撐。

3 結(jié)論

通過分析草莓酵素發(fā)酵過程中總糖、總酸、pH、4 種有機(jī)酸、總酚含量以及4 種抗氧化指標(biāo)，結(jié)果表明，草莓酵素發(fā)酵過程主要可分為3 個(gè)階段，分別是發(fā)酵初期（20 d 前）、發(fā)酵中期（20～30 d）、發(fā)酵后期（30～75 d）。發(fā)酵初期，糖類物質(zhì)消耗不大，總酸未明顯增強(qiáng)，這個(gè)階段基本不含乳酸和醋酸，清除DPPH 自由基、羥基自由基和ABTS 自由基的能力均無明顯變化，可知在此階段主要是微生物菌群的適應(yīng)期，僅有部分酵母菌代謝作用。發(fā)酵中期總糖含量迅速下降，總酸濃度上升，有機(jī)酸物質(zhì)開始大量產(chǎn)生，乳酸菌和醋酸菌分別開始利用L-蘋果酸和酵母產(chǎn)生的乙醇等物質(zhì)合成乳酸和醋酸，草莓酵素中的總酚含量呈急劇增長(zhǎng)的趨勢(shì)，相應(yīng)地，顯著提升了抗氧化活性。發(fā)酵后期，總糖、總酚和檸檬酸、L-蘋果酸、醋酸、乳酸含量趨于穩(wěn)定，總糖的緩慢上升與酚類含量的輕微下降均是微生物消亡和適應(yīng)的結(jié)果。采用主成分分析法對(duì)草莓酵素的各變量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)草莓酵素的CEI 值在發(fā)酵30 d 變化較為穩(wěn)定，發(fā)酵第75 天綜合得分最高，可作為草莓酵素前發(fā)酵結(jié)束的依據(jù)，為后續(xù)流加碳源、接種菌液的時(shí)間點(diǎn)判斷提供理論支持。

圖12 草莓酵素綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Fig.12 Comprehensive evaluation index of strawberry jiaosu