甘草次酸生物合成菌株的篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化

趙文俊 吳嘉南 何國慶 陳啟和

（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系 杭州310058）

甘草（Glycyrrhiza），是豆科植物的根和根狀莖，臨床應(yīng)用歷史長、范圍廣[1]。甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA，結(jié)構(gòu)見圖1），是甘草中天然活性物質(zhì)甘草酸（Glycyrrhizic acid，GL，結(jié)構(gòu)見圖1）水解脫去兩分子葡萄糖醛酸的三萜類皂苷產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂[2-3]等多種作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)。在甘草次酸的兩種光學(xué)異構(gòu)體中，18α-甘草次酸的生物活性強(qiáng)于18β-甘草次酸[4]。

目前，主要通過酸、堿、酶將甘草酸水解，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，然而產(chǎn)物中97%以上是18β-甘草次酸，α-異構(gòu)體的含量很少，約占3%[4]。周艷艷[5]從甘草飲片粉和甘草酸粗品的培養(yǎng)液中篩選可將甘草酸轉(zhuǎn)化成甘草次酸的菌株YGL-B-12，以甘草酸為底物，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝，將18β-甘草次酸的轉(zhuǎn)化率從21.29%提高到40.83%。木合布力等[4]將18β-甘草次酸與鹽酸的無水甲醇溶液一起加熱，經(jīng)堿性水解、酸化制備得到18α-甘草次酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%。上述工藝繁瑣、耗時(shí)長、效率低、能耗大且污染環(huán)境。

本研究以甘草為發(fā)酵底物，針對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC No.6152 等11 種菌株，以甘草、麥麩和濃縮蘋果汁配制天然培養(yǎng)基，篩選出甘草次酸轉(zhuǎn)化率最高的菌株，再通過響應(yīng)面優(yōu)化與分析方法（RSM）對(duì)影響甘草酸轉(zhuǎn)化的甘草加量、濃縮蘋果汁加量、麩皮加量和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，獲得微生物發(fā)酵法制備18α-甘草次酸的優(yōu)化發(fā)酵條件，對(duì)發(fā)展18α-甘草次酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 試驗(yàn)用黑曲霉CGMCC No.6152 等為浙江大學(xué)食品生物科學(xué)技術(shù)研究所保存的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基 在43 g PDA 培養(yǎng)基中加入1 L 去離子水，加熱充分溶解，分裝于試管中，121℃滅菌20 min，冷卻得斜面培養(yǎng)基。

2）發(fā)酵培養(yǎng)基 將甘草切片用固體粉碎機(jī)充分粉碎，60 目過篩，得到甘草粉末。甘草粉末、濃縮蘋果汁、麩皮、去離子水加量參照表1和表2。pH 自然，30 mL/250 mL 錐形瓶分裝，121 ℃滅菌20 min。

圖1 甘草酸（a）與18α-甘草次酸（b）的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of glycyrrhizic acid（a）and 18α-glycyrrhetinic acid（b）

1.1.3 試劑 PDA，杭州微生物試劑有限公司；甘草，四川新荷花中藥飲片股份有限公司；濃縮蘋果汁，天水長城果汁集團(tuán)；麩皮，四川萬鳳糧油有限公司；18α-甘草次酸（純度98%）和甘草素（純度98%），北京百靈威科技有限公司；36%HCl 溶液、乙酸乙酯、醋酸均為分析純藥品；甲醇、乙腈均為色譜純藥品。

1.1.4 儀器與設(shè)備 PB-10 pH 計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；JP-040S 超聲波清洗機(jī)，深圳市結(jié)盟清洗設(shè)備有限公司；BSA124S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LDZM-80KCS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；5C18-MS-Ⅱ色譜柱，Cosmosil。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵菌株的篩選

1.2.1.1 菌株的活化、復(fù)壯與發(fā)酵 ?。?0 ℃低溫保存的菌種解凍，用接種鏟刮取菌絲或孢子接種于PDA 斜面上，28 ℃培養(yǎng)直至菌株長滿斜面。刮取活化菌種的菌絲或孢子接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)6 d。

1.2.1.2 產(chǎn)物含量的測定

樣品溶液制備：在發(fā)酵液中加入去離子水定容30 mL，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至3，離心分離，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至揮干乙酸乙酯（45 ℃，0.05 MPa），加入適量甲醇復(fù)溶，用0.22 μm 濾膜過濾，裝入液相進(jìn)樣瓶[6]。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：準(zhǔn)確稱取18α-甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品2.3 mg 于10 mL 容量瓶中，用色譜純甲醇定容至刻度線，得到質(zhì)量濃度為0.23 mg/mL 的儲(chǔ)備液。精密吸取上儲(chǔ)備液1 mL，用色譜純甲醇梯度稀釋，得到0.1150，0575，0.0288，0.0144，0.00719，0.00360 mg/mL 的溶液。使用0.22 μm 濾膜過濾樣品溶液后裝入液相色譜進(jìn)樣瓶中。

色譜條件：C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（體積比89∶10∶1），體積流量1.0 mL/min，檢測波長248 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL[6-8]。

1.2.1.3 18α-甘草次酸產(chǎn)率的計(jì)算 參照下面公式計(jì)算18α-甘草次酸產(chǎn)率P（g/g）。

式中，r——發(fā)酵產(chǎn)物中甘草次酸含量，g；m——培養(yǎng)基中甘草的加量，g；100——系數(shù)。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件

1.2.2.1 優(yōu)化設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design，CCD）原理[9-11]，結(jié)合初篩、復(fù)篩結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的因素與水平，共21 組試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

選取復(fù)篩菌株，按照初篩的方法再次活化。以甘草加量、濃縮蘋果汁加量、麩皮加量及發(fā)酵時(shí)間作為試驗(yàn)因素，使用Expert Design 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化條件。參照表2配制21 種發(fā)酵培養(yǎng)基，每種3 個(gè)平行。在凈化工作臺(tái)中，刮取活化好的菌種的菌絲或孢子接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間參照表2。

產(chǎn)物含量測定方法與初篩相同。使用Expert Design 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到18α-甘草次酸產(chǎn)率最高的發(fā)酵條件及預(yù)計(jì)產(chǎn)率。

1.2.2.2 驗(yàn)證 以得到的18α-甘草次酸產(chǎn)率最高的發(fā)酵條件再次發(fā)酵，檢驗(yàn)實(shí)際產(chǎn)率并與預(yù)計(jì)產(chǎn)率作對(duì)比。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方Table1 Formulation of fermentation medium

表2 生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果Table2 Optimization of fermentation medium configuration

2 結(jié)果分析與討論

2.1 18α-甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

在1.2.1.2 節(jié)色譜條件下，18α-甘草次酸的保留時(shí)間約為7 min，取峰面積A 對(duì)質(zhì)量濃度ρ（mg/mL）回歸得A=3.481×107ρ+3.468×104，R2=0.999。線性關(guān)系良好。

圖2 18α-甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.2 18α-Glycyrrhetinic acid standard chromatogram

圖3 檢測樣品色譜圖Fig.3 Sample chromatogram

2.2 轉(zhuǎn)化篩選與評(píng)價(jià)

從圖4可知，18α-甘草次酸的產(chǎn)率（簡稱產(chǎn)率）受發(fā)酵菌株和發(fā)酵培養(yǎng)基影響。在所有發(fā)酵菌株中，黑曲霉（阿）、黑曲霉（半）、紅曲霉及米曲霉產(chǎn)率較高，其中黑曲霉（阿）在發(fā)酵培養(yǎng)基B 中產(chǎn)率為3.02 g/g，在發(fā)酵培養(yǎng)基A 中產(chǎn)率為1.36 g/g，高于其它菌株；黑曲霉（半）在發(fā)酵培養(yǎng)基A、B 中產(chǎn)率接近，分別為0.64、0.62 g/g；紅曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)基A 中產(chǎn)率為0.28 g/g，高于該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基B 中的產(chǎn)率0.09 g/g；米曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)基A 產(chǎn)率為0.55 g/g，遠(yuǎn)高于該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基B 中的產(chǎn)率0.03 g/g。下一步對(duì)黑曲霉（阿）、黑曲霉（半）、米曲霉3 種發(fā)酵菌株進(jìn)行復(fù)篩。

谷物的麩皮含有豐富的纖維素和烷基間苯二酚、木脂素、酚酸、植物甾醇、生育酚、生育三烯酚、葉酸等生物活性化合物[12-13]，能為微生物的生長繁殖提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[14]。蒲立檸等[15]、王小平-[16]等設(shè)計(jì)添加有麩皮、濃縮蘋果汁的天然發(fā)酵培養(yǎng)基，用于新型食品的開發(fā)，具有借鑒意義。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麩皮能提高黑曲霉（阿）的18α-甘草次酸產(chǎn)率，降低米曲霉的產(chǎn)率，可能是因?yàn)辂熎ぴ诤谇梗òⅲ┊a(chǎn)生阿魏酸酯酶[17]的作用下產(chǎn)出具有抗氧化作用的阿魏酸[18]，防止生成的甘草次酸被氧化[19]，進(jìn)而提高了甘草次酸的產(chǎn)率；而麩皮為米曲霉提供碳源、氮源及其它營養(yǎng)物質(zhì)，降低了米曲霉對(duì)甘草酸等物質(zhì)的利用。

2.3 轉(zhuǎn)化菌株的復(fù)篩驗(yàn)證

從圖5結(jié)果可知，3 種發(fā)酵菌株的18α-甘草次酸產(chǎn)率均高于對(duì)照組，黑曲霉（阿）與米曲霉的產(chǎn)率高于黑曲霉（半）。黑曲霉（阿）在發(fā)酵培養(yǎng)基A 中的產(chǎn)率為（0.27±0.072）g/g，低于B 中的產(chǎn)率（1.063±0.248）g/g，且兩者均低于初篩產(chǎn)率。黑曲霉（半）在發(fā)酵培養(yǎng)基A、B 中的產(chǎn)率接近。米曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)基A 中的產(chǎn)率為（1.306±0.205）g/g，高于B 中的產(chǎn)率（0.521±0.108）g/g，且兩者均高于初篩結(jié)果。

復(fù)篩階段的發(fā)酵時(shí)間為4 d，而初篩階段為6 d，復(fù)篩發(fā)酵中黑曲霉（阿）的18α-甘草次酸產(chǎn)率低于初篩的原因可能是部分甘草酸尚未轉(zhuǎn)化。米曲霉復(fù)篩的18α-甘草次酸的產(chǎn)率高于初篩，原因可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，甘草酸先轉(zhuǎn)化成18α-甘草次酸，之后18α-甘草次酸被轉(zhuǎn)化為酮基化、羥基化或酰基化衍生物[20]。綜合初篩、復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果，選取黑曲霉（阿）在發(fā)酵培養(yǎng)基B 的組分基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 不同菌株在不同培養(yǎng)基條件下的18α-甘草次酸產(chǎn)率比較Fig.4 Comparison of 18α-Glycyrrhetinic acid yield of different strains at different media conditions

圖5 不同菌株在不同培養(yǎng)基條件下的18α-甘草次酸產(chǎn)率比較Fig.5 Comparison of 18α-Glycyrrhetinic acid yield of different strains at different media conditions

2.4 轉(zhuǎn)化條件的響應(yīng)面優(yōu)化

應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得出響應(yīng)值R 對(duì)編碼自變量A、B、C、D 的二次回歸多項(xiàng)方程如下：

R=0.62+0.22A-0.015B+0.0039C+0.11D-0.066A2-0.048B2-0.051C2-0.077D2+0.0092AB-0.11AC+0.11AD-0.089BC+0.084BD+0.083CD

由表3可知，方程中一次項(xiàng)與二次項(xiàng)對(duì)產(chǎn)率影響顯著，呈非線性關(guān)系。回歸方程相關(guān)系數(shù)R2（R-Squared）=0.8880，說明擬合方程與實(shí)際相符，誤差較??；模型失擬項(xiàng)Prob＞F 值為0.5292，大于0.05，模型具有實(shí)際意義。由各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度F 值可以看出，甘草加量對(duì)18α-甘草次酸產(chǎn)率影響最大，發(fā)酵時(shí)間次之，濃縮蘋果汁加量再次之，麩皮加量的影響最小。這說明甘草加量促進(jìn)黑曲霉（阿）產(chǎn)生更多的糖苷酶水解甘草酸生成甘草次酸，甘草加量對(duì)甘草次酸產(chǎn)率有較大影響。菌群的擴(kuò)增以及相應(yīng)酶的生成需要一定的時(shí)間，發(fā)酵時(shí)間對(duì)甘草次酸的產(chǎn)率也有較大影響。濃縮蘋果汁、麩皮在培養(yǎng)基中提供碳源、氮源及其它營養(yǎng)物質(zhì)，能促進(jìn)黑曲霉（阿）的生長，影響甘草次酸產(chǎn)率。

表3 18α-甘草次酸響應(yīng)面二次模型方差分析Table3 ANOVA of thequadratic model for 18α-glycyrrhetinic acid yield

各因素與試驗(yàn)結(jié)果的分析如圖6所示。甘草加量和濃縮蘋果汁加量的響應(yīng)面、甘草加量和麩皮加量的響應(yīng)面、甘草加量和發(fā)酵時(shí)間的響應(yīng)面曲面坡度陡峭且等高線密集，說明甘草加量和濃縮蘋果汁加量、麩皮加量、發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)18α-甘草次酸產(chǎn)率的增長影響極顯著；濃縮蘋果汁加量和麩皮加量的響應(yīng)面曲面坡度較陡峭且等高線較密集，說明濃縮蘋果汁加量和麩皮加量的交互作用對(duì)18α-甘草次酸產(chǎn)率的增長影響顯著[21]。

通過對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，可得到黑曲霉（阿）產(chǎn)18α-甘草次酸的最佳發(fā)酵條件：甘草加量9.83%，濃縮蘋果汁加量8.05%，麩皮加量9.76%，發(fā)酵時(shí)間6.79 d，預(yù)計(jì)18α-甘草次酸產(chǎn)率為0.9256 g/g。以此條件發(fā)酵，18α-甘草次酸的實(shí)際產(chǎn)率為0.7619 g/g，比預(yù)計(jì)產(chǎn)率低0.16 g/g，減少17.6%，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)計(jì)相近。

3 結(jié)論

18α-甘草次酸是由胞內(nèi)β-D-葡萄糖醛酸苷酶內(nèi)切甘草酸β-1，3 糖苷鍵水解脫掉兩分子葡萄糖醛酸得到的產(chǎn)物[22]。18α-甘草次酸的產(chǎn)率受甘草酸的濃度、細(xì)胞膜通透性、β-D-葡萄糖醛酸苷酶的數(shù)量和活性等因素的影響。

本文從黑曲霉（阿）等11 種食用級(jí)菌株出發(fā)，以甘草、麥麩、濃縮蘋果汁配成發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，再借助高效液相色譜，采用郝淞瑤[23]測定甘草次酸的HPLC 條件檢測產(chǎn)物中的18α-甘草次酸并計(jì)算產(chǎn)率。在發(fā)酵菌株的初篩與復(fù)篩中，筆者發(fā)現(xiàn)選擇黑曲霉（阿）作為發(fā)酵菌株，優(yōu)化其在發(fā)酵培養(yǎng)基B 的發(fā)酵條件，以甘草加量、麩皮加量、濃縮蘋果汁加量及發(fā)酵時(shí)間作為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到18α-甘草次酸產(chǎn)率最高的發(fā)酵條件，即：甘草加量9.83%，濃縮蘋果汁加量8.05%，麩皮加量9.76%，發(fā)酵時(shí)間6.79 d，預(yù)計(jì)18α-甘草次酸產(chǎn)率為0.9256 g/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與預(yù)計(jì)相符。后續(xù)研究可圍繞以下方向展開：對(duì)pH、溫度等它發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，研究與18α-甘草次酸轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶的生物化學(xué)特性，對(duì)甘草次酸進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞評(píng)價(jià)。

圖6 甘草加量、濃縮蘋果汁加量、麩皮加量、發(fā)酵時(shí)間的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map of licorice，concentrate apple juice，bran and fermentation time