豌豆低聚肽硒螯合物的體外抗氧化作用

秦修遠(yuǎn) 陸 路 崔欣悅 王雨辰 谷瑞增 魯 軍 劉文穎

（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京100015）

中國(guó)自古以來(lái)就有食用豌豆的記載，其蛋白質(zhì)含量非常豐富，有報(bào)道稱豌豆已發(fā)展成為加拿大西部地區(qū)主要蛋白質(zhì)作物[1]。近年來(lái)，大量的文獻(xiàn)報(bào)道了豌豆蛋白多肽的性質(zhì)，如張敏佳等[2]指出豌豆多肽能夠緩解環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠免疫低下。Temitola[3]在豌豆多肽中發(fā)現(xiàn)了具有α-淀粉酶活性的部分，有望成為肥胖及II 型糖尿病患者熱量攝入管理的功能營(yíng)養(yǎng)食品原料。

硒是一種人體必需的微量元素。人類生活土壤中缺乏硒可導(dǎo)致當(dāng)?shù)厣钊巳后w內(nèi)缺硒[4-5]，而缺硒的直接后果是影響由硒蛋白參與的代謝過(guò)程。據(jù)報(bào)道，缺硒可能引起大骨節(jié)病、克山病等[6]。相比無(wú)機(jī)硒，有機(jī)硒毒性小且生物利用率高，能夠更有效地在生物機(jī)體內(nèi)同化[7]。研究者通常以螯合修飾等手段將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，以期制備出食用的補(bǔ)硒產(chǎn)品[8]。

豌豆低聚肽硒螯合物是將豌豆低聚肽與亞硒酸鈉通過(guò)一定的工藝螯合而成。本文分析豌豆低聚肽硒螯合物的基礎(chǔ)理化成分，以DPPH 和OH自由基清除和Fe3+還原能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)豌豆低聚肽硒螯合物的抗氧化活性，旨在進(jìn)一步拓寬豆科植物在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用，同時(shí)也為一種補(bǔ)硒型的抗氧化劑的開發(fā)提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

豌豆低聚肽，由北京中食海氏生物科技有限公司提供；亞硒酸鈉（Na2SeO3）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、水楊酸（C7H6O3）、硫酸亞鐵（FeSO4）、抗壞血酸（VC）、氯化鐵（FeCl3）、氫氧化鈉（NaOH）、無(wú)水乙醇（C2H6O）、30%過(guò)氧化氫（30%H2O2），分析純級(jí)，北京化工廠；2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH），色譜純級(jí)，Biotopped；鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸（C2HCl3O2），分析純級(jí)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；三氟乙酸（TFA），分析純級(jí)，Alfa Aesar 公司；乙腈（C2H3N），色譜純級(jí)，F(xiàn)isher 公司；去離子水，Milli Q 制得。

J-HH-6A 精密數(shù)顯恒溫水浴鍋，冠森生物科技（上海）有限公司；GT-S 超聲波振蕩器，廣東固特超聲股份有限公司；HS-DHG-9203A 臥式鼓風(fēng)干燥箱，上海和晟儀器科技有限公司；PHS-2C精密酸度計(jì)，冠森生物科技（上海）有限公司；Mr酶標(biāo)儀，Dynex Spectra；F30200150 凱氏定氮儀，Velp Scientifica 公司；LC-20AD 型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豌豆低聚肽硒螯合物的制備 取豌豆低聚肽5 g 溶于100 mL 去離子水中，充分?jǐn)嚢杌靹?，加?.5 g 亞硒酸鈉，使豌豆低聚肽與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為2∶1。將混合物以超聲波振蕩器充分振蕩均勻，以1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)混合溶液至pH 9.0，在80 ℃恒溫水浴中孵育30 min，然后全部倒在4 倍體積的無(wú)水乙醇中，經(jīng)12 h 靜置沉淀，倒出上清液。將沉淀放在30 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，干燥成粉，得到豌豆低聚肽硒螯合物。

1.2.2 螯合物得率計(jì)算公式

式中，m1——螯合產(chǎn)物的質(zhì)量；m0——加入螯合體系總物質(zhì)的質(zhì)量。

1.2.3 理化成分分析方法 參照GB 5009.5-2016、GB 22729-2008、GB 5009.3-2016[9-11]，分別對(duì)豌豆低聚肽硒螯合物的總氮（蛋白質(zhì)）、酸溶蛋白、水分含量進(jìn)行檢測(cè)。采用參照文獻(xiàn)[12]所述方法測(cè)定樣品的分子質(zhì)量。

1.2.4 清除DPPH 自由基能力測(cè)定 將檢測(cè)物質(zhì)與0.1 mol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液以1 ∶1 的體積比混合，避光保存30 min，于紫外-可見(jiàn)光譜波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)量混合液的吸光值（OD），記為A1。相應(yīng)的，將DPPH-無(wú)水乙醇溶液替換為無(wú)水乙醇溶液，以同樣方式操作得到OD 值記為A10。將樣品替換為去離子水，以同樣方式操作得到OD 值記為A0。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差。以亞硒酸鈉和豌豆低聚肽作為組間對(duì)照，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)式（2）計(jì)算豌豆低聚肽硒螯合物DPPH 自由基清除率。

1.2.5 清除OH 自由基能力測(cè)定 將檢測(cè)物質(zhì)與5 mol/L FeSO4、5 mol/L 水楊酸-無(wú)水乙醇溶液以體積比1∶2∶2 混勻，以1 體積的5 mol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，在37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，于紫外-可見(jiàn)光譜波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)量OD 值，記為A2。相應(yīng)的，以去離子水代替5 mol/L H2O2溶液，以同樣方式操作得到OD 值記為A20。以去離子水代替樣品溶液，以同樣方式操作得到OD 值記為A02。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差。以亞硒酸鈉和豌豆低聚肽作為組間對(duì)照，以VC 作為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)式（3）計(jì)算豌豆低聚肽硒螯合物OH 自由基清除率。

1.2.6 還原能力測(cè)定 將檢測(cè)物質(zhì)與0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K3[Fe（CN）6]溶液以體積比1∶1∶1 混合均勻，于50℃水浴中保存10 min 后，迅速用冷水冷卻。加入1體積比例、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，迅速避光充分搖勻，從中取出1 體積比例的反應(yīng)混合物，加入1 體積比例的去離子水和0.2 體積比例、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液，充分避光搖勻，靜置10 min，于波長(zhǎng)700 nm 處測(cè)量OD 值。以亞硒酸鈉和豌豆低聚肽作為組間對(duì)照，以VC 作為陽(yáng)性對(duì)照，以得到的OD 值作為樣品還原能力參數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 豌豆低聚肽硒螯合物基礎(chǔ)理化成分

根據(jù)方法1.2.1 節(jié)制得的豌豆肽硒螯合物得率為27.87%，總氮（粗蛋白）含量為（23.87 ±0.30）%，酸溶蛋白含量為（23.22±0.12）%，則酸溶蛋白占總氮（粗蛋白）的比例為97.28%，水分含量為（14.17±1.12%）。豌豆低聚肽硒螯合物平均分子質(zhì)量分布情況如圖1所示。豌豆低聚肽硒螯合物中有93.45%的分子質(zhì)量分布在1 000 u 之下。研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，此類小分子肽易消化吸收，具有大分子蛋白質(zhì)所沒(méi)有的一些物理、化學(xué)特性及生理活性。

2.2 豌豆低聚肽硒螯合物清除DPPH 自由基

圖1 豌豆低聚肽硒螯合物分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖Fig.1 The gel chromatogram of molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide

DPPH 是一種在氮橋上的一個(gè)原子中具有未配對(duì)價(jià)電子的自由基[15]。因不同研究者設(shè)置的試驗(yàn)條件不同，如濃度、水浴時(shí)間、pH 值等，故不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果不能相互比較[16]。亞硒酸鈉對(duì)DPPH自由基有很弱的清除能力，且與亞硒酸鈉濃度無(wú)關(guān)，其清除率幾乎穩(wěn)定在20%左右。豌豆低聚肽對(duì)DPPH 自由基有清除能力，且清除率隨豌豆低聚肽濃度的升高而升高，呈拋物線趨勢(shì)，清除變化率逐漸減小。根據(jù)拋物線公式計(jì)算得到豌豆低聚肽對(duì)DPPH 自由基清除的IC50值為（3.39 ± 0.02）mg/mL。螯合物對(duì)DPPH 自由基有較強(qiáng)的清除能力，且隨螯合物劑量的變化而變化。隨著螯合物濃度的升高，其對(duì)DPPH 自由基清除率也逐漸升高，在螯合物質(zhì)量濃度低于5 mg/mL 范圍，清除率變化趨勢(shì)幾乎是線性的，隨著濃度繼續(xù)升高，清除率變化逐漸放緩，呈拋物線趨勢(shì)。從圖2中曲線公式求得豌豆低聚肽硒螯合物的IC50=（1.77 ± 0.01）mg/mL。螯合后，螯合物對(duì)于DPPH 自由基清除能力變強(qiáng)，高于原料豌豆低聚肽和亞硒酸鈉，其IC50值幾乎是豌豆低聚肽的一半。陽(yáng)性對(duì)照VC 組的IC50值為（4.85±0.02）μg/mL。

圖2 螯合前、后清除DPPH 自由基作用對(duì)比Fig.2 Scavenging effect on DPPH free radicals before and after chelating

圖3 VC 清除DPPH 自由基作用Fig.3 Scavenging effect of VC on DPPH free radicals

2.3 豌豆低聚肽硒螯合物清除OH 自由基

文獻(xiàn)[17]，[18]指出，非酶硒可能具有抗氧化作用，硒或可通過(guò)調(diào)節(jié)氧自由基、抗氧化酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用[19-20]，特別是Na2SeO3對(duì)于OH 自由基的清除能力是其實(shí)現(xiàn)抗氧化功能的重要途徑。本試驗(yàn)證實(shí)了Na2SeO3清除OH 自由基的功能。如圖4所示，隨著Na2SeO3濃度的升高，其對(duì)OH 自由基清除能力幾乎呈線性變化，且斜率大。在Na2SeO3質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，其對(duì)OH 自由基清除率可達(dá)100%。根據(jù)擬合曲線公式計(jì)算得到亞硒酸鈉清除OH 自由基的IC50=（1.23 ± 0.02）mg/mL。豌豆低聚肽對(duì)OH 自由基有一定的清除能力，且清除率隨豌豆肽濃度的增加呈拋物線變化趨勢(shì)。根據(jù)擬合拋物線曲線方程，求得豌豆低聚肽清除OH 自由基的IC50值為（23.55 ± 0.07）mg/mL。豌豆低聚肽硒螯合物對(duì)OH 自由基有較強(qiáng)的清除能力，從圖4看出，在其質(zhì)量濃度低于5 mg/mL 時(shí)，清除率隨濃度變化曲線接近線性，斜率較大，而隨著濃度的增加，清除率曲線變化趨勢(shì)放緩，斜率減小，幾乎與豌豆低聚肽清除率變化斜率相同。推測(cè)在質(zhì)量濃度低于5 mg/mL 時(shí)，螯合物清除OH 自由基能力受Na2SeO3濃度影響大，而超過(guò)質(zhì)量濃度5 mg/mL 時(shí)，Na2SeO3清除OH 自由基能力達(dá)到飽和。螯合物清除自由基能力主要受原料豌豆低聚肽濃度的影響。根據(jù)擬合曲線求得豌豆低聚肽硒螯合物清除OH 自由基的IC50值為（3.28±0.04）mg/mL。陽(yáng)性對(duì)照VC 清除OH 自由基的IC50值為（1024.87±5.96）μg/mL。

圖4 螯合前、后清除OH 自由基對(duì)比圖Fig.4 Scavenging effect on OH free radicals before and after chelating

圖5 VC 清除OH 自由基作用Fig.5 Scavenging effect of VC on OH free radicals

2.4 豌豆低聚肽硒螯合物的還原能力

將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵是抗氧化功能評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)，其原理是抗氧化劑給出電子與自由基結(jié)合，從而清除自由基，將K3[Fe（CN）6]的三價(jià)鐵還原成二價(jià)，進(jìn)而二價(jià)鐵與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，在波長(zhǎng)700 nm 處有最大吸光度。可用吸光值代表還原能力，吸光度的大小與化合物Fe3還原能力的強(qiáng)弱成正比[12]。如圖6所示，Na2SeO3沒(méi)有還原能力。豌豆低聚肽對(duì)Fe3還原能力隨其濃度的增加而增加，且變化趨勢(shì)呈線性。螯合物Fe3還原能力也隨其濃度的增加而增加，變化趨勢(shì)接近線性。螯合物的Fe3還原能力高于原料豌豆低聚肽。陽(yáng)性對(duì)照VC 對(duì)Fe3還原能力隨其濃度的變化呈拋物線變化趨勢(shì)。在VC 質(zhì)量濃度低于200 μg/mL 時(shí)，曲線變化接近線性，隨著濃度的升高，對(duì)Fe3還原能力的變化率逐漸變小。當(dāng)VC 的還原能力對(duì)應(yīng)的吸光值約為1.6 時(shí)，所需VC 質(zhì)量濃度為400 μg/mL。相應(yīng)地，要到達(dá)這一吸光值，所需豌豆低聚肽硒螯合物質(zhì)量濃度為50 mg/mL。當(dāng)豌豆低聚肽質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時(shí)，其吸光值約0.8。從圖6可推測(cè)，豌豆低聚肽硒螯合物對(duì)Fe3還原能力的提升并非是原料豌豆低聚肽與Na2SeO3的簡(jiǎn)單疊加，而是螯合工藝使還原能力增強(qiáng)。

圖6 螯合前、后Fe3 還原能力對(duì)比圖Fig.6 Reducing power comparison before and after chelating

圖7 VC 的還原能力Fig.7 Reducing power of VC

3 結(jié)論

Na2SeO3對(duì)于DPPH 自由基清除能力較弱，且與劑量無(wú)關(guān)，而對(duì)OH 自由基清除能力很強(qiáng)，Na2SeO3清除OH 自由基的IC50=（1.23±0.02）mg/mL。Na2SeO3不具有Fe3還原能力。豌豆低聚肽對(duì)于DPPH 自由基和OH 自由基都有一定的清除能力，且與劑量呈近似拋物線的關(guān)系，其對(duì)DPPH 自由基和OH 自由基的半抑制濃度分別為IC50=（3.39±0.02）mg/mL 和（23.55±0.07）mg/mL，并且具有一定的Fe3還原能力。

以豌豆低聚肽和Na2SeO3為原料，通過(guò)螯合工藝制得豌豆低聚肽硒螯合物得率為27.87%。通過(guò)理化成分分析得到螯合物水分含量為（14.17±1.12）%，總氮（粗蛋白）含量為（23.87%±0.30）%，酸溶蛋白含量為（23.22% ± 0.12）%，則酸溶蛋白占總氮（粗蛋白）的比例為97.28%，有93.45%的分子質(zhì)量都分布在1 000 u 以下。豌豆低聚肽硒螯合物對(duì)于DPPH 自由基和OH 自由基的清除能力相對(duì)于原料肽都有很大提高，其對(duì)DPPH 自由基和OH 自由基的半抑制濃度分別為IC50=（1.77±0.01）mg/mL 和（3.28±0.04）mg/mL，有較強(qiáng)Fe3還原能力，且對(duì)其Fe3還原能力并非螯合原料肽與Na2SeO3的簡(jiǎn)單疊加，而是螯合工藝提高了對(duì)Fe3+的還原能力。

豌豆低聚肽硒螯合物具有抗氧化功能，這為植物蛋白的應(yīng)用、抗氧化補(bǔ)硒食品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。硒作為人體必需的一種微量元素，如何保證其在生理可控濃度范圍內(nèi)發(fā)揮豌豆低聚肽硒螯合物的抗氧化功能，仍需進(jìn)一步研究。