乳清蛋白磷酸化改性對其營養(yǎng)價值和消化吸收的影響

李金華 李 博* 王成濤

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 2 北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實驗室 北京100048）

乳清蛋白有“蛋白之王”之稱，其純度高，吸收率高且氨基酸組成最為合理。目前市場上乳清蛋白產(chǎn)品主要有濃縮乳清蛋白（WPC）、乳清分離蛋白（WPI）和乳清蛋白肽[1]。其中，WPI 含有β-乳球蛋白、α-乳白蛋白及牛血清白蛋白等[2]，易被人體消化吸收，能為特定人群提供所需優(yōu)質(zhì)蛋白。乳清蛋白因良好的乳化性、粘著性及膠凝性等特性，廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品等工業(yè)生產(chǎn)中，如在香腸和午餐肉加工中添加乳清蛋白，有助于肉塊與配料的粘結(jié)[3]，在干酪生產(chǎn)時添加WPC 以改善產(chǎn)品感官性能[4]。隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，天然的蛋白已較難滿足生產(chǎn)中的不同需求。為此，許多研究者對乳清蛋白進行改性。Lee 等[5]以WPI 為原料，經(jīng)高壓處理后提高了蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性；孫顏君等[6]通過熱處理和調(diào)節(jié)pH 值對WPC 進行改性并將改性蛋白添加到低脂稀奶油中，提高了低脂稀奶油的打發(fā)率和泡沫穩(wěn)定性。然而，改性是否會影響WPI 的營養(yǎng)品質(zhì)，目前還鮮有研究報道。

蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)包括蛋白質(zhì)含量、必需氨基酸的含量和模式以及機體對其消化利用的程度。蛋白質(zhì)的營養(yǎng)評價方法主要有生物價（BV）[7]、化學(xué)評分（CS）[8]、氨基酸評分（AAS）和必需氨基酸指數(shù)（EAAI）、氨基酸比值系數(shù)（RCAA）和氨基酸比值系數(shù)分（SRCAA）[9]等。徐向英等[10]通過AAS、CS 等指標對不同產(chǎn)地的燕麥品種進行營養(yǎng)品質(zhì)的評價。趙鳳敏等[11]應(yīng)用RCAA 和SRCAA 等方法篩選出6 個營養(yǎng)價值較高的馬鈴薯品種。機體對蛋白質(zhì)的消化吸收程度也是評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的標準之一。體外模擬消化模型和Caco-2 細胞吸收模型可較好地模擬體內(nèi)胃、腸消化吸收的生理過程，且廣泛應(yīng)用于研究中。顧浩峰等[12]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對羊奶嬰兒配方奶粉進行體外模擬胃、腸消化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)能較好地被機體吸收利用，營養(yǎng)價值高。Rubio 等[13]以動物蛋白和植物蛋白為原料，利用Caco-2 細胞吸收模型進行體外模擬吸收，結(jié)果表明動物蛋白氨基酸的吸收速率高于植物蛋白，營養(yǎng)利用率高。

本研究以WPI 為原料，利用三聚磷酸鈉（STP）對其進行改性，探究改性程度對WPI 的營養(yǎng)價值及消化吸收的影響，為乳清蛋白磷酸化改性工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：WPI、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、考馬斯亮藍染色套裝等（AR 級），北京索萊寶；三聚磷酸鈉（AR 級），天津光復(fù)；酒石酸銻鉀（AR 級），山東西亞；鉬酸銨、甲基紅、溴甲酚藍等（AR 級），國藥集團；胃蛋白酶、胰蛋白酶、氨基酸混合標準品、異硫氰酸苯酯、三乙胺，美國Sigma；非必需氨基酸、胎牛血清、HBSS、青霉素，美國HyClone；乙腈、甲醇（色譜級），F(xiàn)isher Scientific 等。

主要儀器：TA-XT plus 質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS 公司；UV-5100 紫外分光光度計，上海精密儀器儀表；K9860 全自動凱式定氮儀，海能儀器；LC-15液相泵、LC-15 梯度混合器、LC SOLUTION 15C液相操作系統(tǒng)，島津國際貿(mào)易（上海）等。

1.2 方法

1.2.1 磷酸化WPI 制備[14]取一定量的WPI 溶于pH 7.0 的0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制得8%的蛋白質(zhì)溶液，分別加入1%～7%的STP，充分混合后調(diào)節(jié)pH 8.0，45 ℃水浴振蕩2 h。振蕩結(jié)束后冷卻至室溫，4 ℃透析24 h。透析結(jié)束后，將樣品冷凍干燥48 h，得改性WPI。

1.2.2 磷酸化程度測定 參考申世強等[15]的方法并有所改動。分別量取0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL 磷標準液于50 mL 容量瓶中，用20 mL 水稀釋，依次加入2.0 mL 鉬酸銨溶液、3.0 mL 抗壞血酸溶液，用水稀釋至刻度后搖勻，室溫放置10 min。以試劑空白為對照，在波長710 nm 處測定其吸光度，繪制標準曲線。將待測樣品配制成1 mg/mL 的蛋白溶液，取10.0 mL 于100 mL 錐形瓶中，分別加入1.0 mL 硫酸溶液（濃硫酸∶水體積比為1 ∶35）、5.0 mL 過硫酸鉀溶液，調(diào)節(jié)體積至25 mL，置于電爐上煮沸至溶液快蒸干為止。取出，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，按照磷標準液的操作步驟測定樣品的吸光度，在標準曲線上查得試樣液中的磷含量。以原蛋白為空白，磷酸化程度以每100 g 蛋白質(zhì)所含的質(zhì)量表示。圖1為磷標準曲線，磷標準曲線的回歸方程為：y = 0.1805x -0.0093，R2=0.999，式中y 為吸光值，x 為磷標準溶液（mg/L）。

圖1 磷標準曲線Fig.1 Standard curve of phosphorus

1.2.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定[14]將蛋白質(zhì)用PBS 配制成0.25%的蛋白液，從中取出15 mL置于離心管中，加入5.0 mL 葵花籽油，10 000 r/min 均質(zhì)2 min。均質(zhì)結(jié)束后取50 μL 勻漿液加到5.0 mL 0.1% SDS 中，混勻后在波長500 nm 處測定其吸光值A(chǔ)0。均質(zhì)液放置10 min 后在相同的位置取50 μL 勻漿液，在波長500 nm 處測定其吸光值A(chǔ)10。以SDS 溶液為空白，乳化性EAI 和乳化穩(wěn)定性ESI 計算公式如下：

式中：n——稀釋倍數(shù)；ρ——蛋白質(zhì)量濃度（g/mL）；Ф——油體積分數(shù)，25%；A0——均質(zhì)后樣品在波長500 nm 處的吸光值；A10——均質(zhì)10 min后樣品在波長500 nm 處的吸光值。

1.2.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定[16]取0.5 g待測樣品溶于100 mL PBS 中，取25 mL 于量筒中，以16 000 r/min 速度均質(zhì)2 min，30 s 后記錄總體積，室溫靜置30 min 后記錄總體積。起泡性FA和泡沫穩(wěn)定性FS 計算公式如下：

式中：A——待測樣品均質(zhì)后的體積，mL；B——待測樣品均質(zhì)前的體積，mL；C——室溫靜置30 min 后體積，mL。

1.2.5 凝膠硬度測定[17]將待測樣品配成16%的蛋白液，90 ℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫后置于4 ℃冰箱過夜。用質(zhì)構(gòu)儀測定其硬度，測定參數(shù)為：在TPA 模式下用P2 探頭，測試前速度3 mm/s，測試速度2 mm/s，測試后速度2 mm/s，觸發(fā)力5 g，測試距離5 mm。

1.2.6 體外模擬胃消化[12]將待測樣品配制成質(zhì)量分數(shù)為2%的溶液，于37 ℃水浴預(yù)熱15 min，調(diào)節(jié)溶液pH 值為2.0。以酶與底物質(zhì)量比1∶50 的比例加入胃蛋白酶，于37 ℃水浴搖床上消化2 h，消化結(jié)束后調(diào)節(jié)溶液pH 值至7.0，滅酶。

體外模擬胃、腸總消化[18]：將待測樣品配制成質(zhì)量分數(shù)為2%的溶液，于37 ℃水浴預(yù)熱15 min，調(diào)節(jié)溶液pH 值為2.0。以酶與底物質(zhì)量比1∶50 的比例加入胃蛋白酶，于37 ℃水浴搖床上消化2 h，然后調(diào)節(jié)溶液的pH 值至7.0 進入腸消化階段。向水解液中添加胰蛋白酶，酶與底物質(zhì)量比為1∶50，在37 ℃水浴搖床中酶解2 h。酶解結(jié)束后，將水解液沸水滅酶5 min，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH值為7.0。

1.2.7 Caco-2 細胞培養(yǎng)及模擬吸收轉(zhuǎn)運 參考霍艷姣等的方法[19]。

1.2.8 體外消化率測定[20]取10 mL 消化液，加入等體積的10%三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，8 000 r/min離心15 min，取上清液，參照GB 5009.5-2010 凱式定氮法測定上清液中蛋白質(zhì)的含量，以不添加消化液的溶液為空白。樣品總蛋白質(zhì)的含量用凱式定氮法測定，體外消化率計算公式為：

1.2.9 消化產(chǎn)物分子質(zhì)量測定 采用SDS-PAGE凝膠電泳法。根據(jù)何光華等[21]的方法，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%，分離膠質(zhì)量分數(shù)為15%。

1.2.10 肽氮及氨基氮含量測定 參照王波[18]方法。

1.2.11 氨基酸組成測定和分析 采用HPLC-異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法對改性及消化吸收前、后的樣品進行氨基酸組成的測定[22]。樣品的處理參考陳敏[23]的方法。以氨基酸標品洗脫得到的圖譜為標準圖譜，對測定樣品的氨基酸組成進行定性和定量。

AAS 計算公式[24]：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 進行試驗圖表和數(shù)據(jù)的處理，通過SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行顯著性差異分析，P＜0.05 表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPI 磷酸化改性對WPI 功能性質(zhì)的影響

隨著STP 添加量的增加，WPI 的磷酸化程度不斷增大，在添加量為7%時達到46.7 mg/g（圖2a）。隨著磷酸化程度的增大，WPI 的乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性也隨之提高（圖2b、2d），而凝膠硬度先增大后減小，在磷酸化程度為4.67%時硬度明顯小于改性前的硬度（圖2c）。各功能性質(zhì)變化的原因可能是隨著STP 添加量的增加，蛋白質(zhì)體系引入負電荷，降低了乳化液表面張力，乳化性和乳化穩(wěn)定性提高；蛋白質(zhì)溶解度增大，起泡性和泡沫穩(wěn)定性增強；磷酸化引入的磷酸根基團較少時，蛋白質(zhì)的吸引力和排斥力能較好地保持平衡，凝膠硬度增大，隨著引入磷酸根基團的增加，蛋白質(zhì)分子間的排斥力不斷增大，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較難形成，凝膠硬度下降。陳旸[14]優(yōu)化了WPI 磷酸化改性工藝，STP 最優(yōu)添加量為5.47%。本研究選用STP 添加量1%～5%改性組進行蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價。

2.2 WPI 磷酸化改性對其氨基酸組成及評價的影響

圖2 STP 添加量對WPI 磷酸化程度及功能性質(zhì)的影響Fig.2 Effects of STP addition on extent of phosphorylation and functional properties of WPI

磷酸化改性后，WPI 的必需氨基酸中賴氨酸（Lys）的含量隨著磷酸化程度的增加而減小，在STP 添加量為5%時Lys 含量減小約4%；蘇氨酸（Thr）和亮氨酸（Leu）的含量減小，甲硫氨酸（Met）和酪氨酸（Tyr）的含量增加。而WPI 的非必需氨基酸中，谷氨酸（Glu）的含量減小，在STP 添加量5%時減小約5%（表1）。有研究表明，在pH 7～9 時，Lys 的自由氨基具有親核性，STP 主要與該氨基結(jié)合[26]，而谷氨酰胺（Gln）的自由氨基在此條件下也有親核性。本試驗中采用的氨基酸檢測方法將Gln 的含量歸入Glu 中。由表1可以看出Glu 含量為Lys 的2 倍以上，推測Gln 也可能是磷酸化改性的位點之一。

表1 改性前、后WPI 氨基酸含量（%）Table1 Percentage of amino acids of WPI before and after modification（%）

（續(xù)表2）

理論上來說，氨基酸在人體內(nèi)的吸收是以其配比及其在必需氨基酸中所占比例進行的[27]。改性前、后WPI 必需氨基酸的AAS、RCAA 及SRCAA 比較結(jié)果見表2。在各樣品組中，苯丙氨酸+酪氨酸（Phe+Tyr）的RCAA 最低，為第一限制性氨基酸，且與纈氨酸（Val）均相對不足（RCAA＜1）。磷酸化改性后，Lys 的AAS 隨改性程度的增大而降低，其RCAA 仍大于1 且更接近1，說明改性后Lys 仍相對過剩且更接近模式氨基酸。SRCAA 越接近100，氨基酸組成與標準模式越接近，營養(yǎng)價值越高。由表2可看出，未改性組和改性組的SRCAA 均高于75 且無明顯差異，說明改性不影響其營養(yǎng)價值。

表2 改性前、后WPI 的氨基酸評分（AAS）、氨基酸比值系數(shù)（RCAA）及氨基酸比值系數(shù)分（SRCAA）比較Table2 Amino acid score（AAS），ratio coefficient of amino acid（RCAA）and score of RC（SRCAA）of WPI before and after modification

2.3 WPI 磷酸化改性對其消化的影響

改性組與未改性組的胃消化率、胃腸總消化率無顯著差異（P＞0.05，見圖3）。WPI 在改性后，其分子結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，磷酸化程度對分子質(zhì)量的分布無顯著影響（圖4）。經(jīng)模擬胃消化后，未改性WPI 及改性后的WPI 都產(chǎn)生新的分子質(zhì)量小于11 ku 的條帶，且未改性組和改性組的分子條帶無明顯差別，說明磷酸化改性對模擬胃消化無顯著性影響。經(jīng)模擬腸消化后，與未消化前相比，WPI 分子質(zhì)量較大的條帶消失，改性WPI 分子條帶的分布與未改性的沒有明顯差別。以上說明WPI 磷酸化改性對其胃、腸消化無顯著性影響。

圖3 STP 添加量對WPI 消化率的影響Fig.3 Effects of STP addition on digestibility of WPI

對胃、腸消化產(chǎn)物進行氨基酸組成測定，結(jié)果顯示：改性WPI 的Val、半胱氨酸（Cys）和Lys的含量降低，天冬氨酸（Asp）、Glu 及Leu 的含量升高（表3），說明WPI 磷酸化改性對其模擬胃、腸消化產(chǎn)物的氨基酸組成有影響。

圖4 STP 添加量對WPI 分子質(zhì)量的影響Fig.4 Effects of STP addition on molecular weight of WPI

表3 體外模擬胃、腸消化后WPI 氨基酸含量（%）Table3 Percentage of amino acids of WPI after simulation digestion in vitro（%）

2.4 WPI 磷酸化改性對其吸收的影響

改性后，WPI 肽氮轉(zhuǎn)運率為10.24%～10.79%，游離氨基氮轉(zhuǎn)運率為4.65%～4.80%（圖5），數(shù)據(jù)分析表明肽氮及氨基氮轉(zhuǎn)運率與改性前沒有顯著差異（P＞0.05）。對轉(zhuǎn)運產(chǎn)物的氨基酸組成進行分析，發(fā)現(xiàn)各氨基酸組成沒有顯著差異（P＞0.05，見表4），說明WPI 磷酸化改性對消化后的氨基酸組成有一定的影響，而對氨基酸的吸收無顯著影響。

表4 模擬小腸吸收后WPI 氨基酸組成（%）Table4 Percentage of amino acids of WPI after simulation absorption in vitro（%）

圖5 STP 添加量對WPI 轉(zhuǎn)運率的影響Fig.5 Effects of STP addition on transport rates of WPI

3 討論

近年來，大量的研究是關(guān)于各種蛋白質(zhì)的改性。Thompson 等[28]利用琥珀酰胺對乳清蛋白進行改性并應(yīng)用到冰淇淋生產(chǎn)中，提高了冰淇淋的耐融化性和穩(wěn)定性。Enomoto 等[29]將α-乳白蛋白在干熱條件下進行糖基化和磷酸化改性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改性明顯提高了乳清蛋白的熱穩(wěn)定性及乳化性。劉麗莉等[30]將雞蛋清蛋白進行磷酸化改性，提高了蛋白的水溶性、保水性及乳化性等特性。

然而，目前對改性蛋白的營養(yǎng)安全性研究較少，影響在工業(yè)上的應(yīng)用。本文研究WPI 改性對蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)的影響。評價食品蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)首先要考慮其必需氨基酸的含量和比例。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）在1973年提出了符合成人需要的8 種必需氨基酸模式和AAS 的概念[24]，SRCAA[25]廣泛用于評價蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。本研究全面評價了磷酸化改性程度對WPI 營養(yǎng)價值的影響，以FAO/WHO 提出的必需氨基酸模式為基礎(chǔ)，利用AAS、RCAA 和SRCAA 對改性蛋白進行營養(yǎng)評價，結(jié)果顯示：隨著STP 添加量從1%增到7%，改性程度增至3.97%，WPI 的功能性質(zhì)有所改善，各必需氨基酸的AAS 雖有所降低，但SRCAA 均大于75 且無明顯差別，說明改性不影響WPI 的營養(yǎng)價值。

此外，評價蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)還應(yīng)考慮機體對其消化利用程度。人體試驗通?；ㄙM昂貴且在倫理方面也有爭議。隨著科技的發(fā)展，體外模擬消化吸收模型被逐漸地開發(fā)和完善。體外模擬消化模型中，胃蛋白酶和胰蛋白酶消化法是模擬人體胃和十二指腸的消化過程，可反映食物蛋白質(zhì)在不同消化階段的消化情況。而體外模擬吸收模型中，Caco-2 細胞吸收轉(zhuǎn)運模型具有與體內(nèi)小腸上皮細胞相同的細胞極性、轉(zhuǎn)運系統(tǒng)以及酶系統(tǒng)，被證實是目前研究小腸吸收功能最可靠的體外模型，被廣泛用于研究中。李倩等[31]采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步消化法探究乳清蛋白的熱變性率與消化率的關(guān)系。Feng M 等[32]以膠原蛋白為原料，利用胃蛋白酶-胰蛋白酶消化模型和Caco-2 細胞吸收轉(zhuǎn)運模型探究膠原蛋白酶解與其消化性和轉(zhuǎn)運率的關(guān)系。本研究采用體外模擬消化模型和Caco-2 細胞吸收模型研究WPI 磷酸化改性對其消化吸收的影響。

不同的改性方法對蛋白質(zhì)的消化率有不同的影響。李燕燕[33]用微波和?；瘡?fù)合改性大米蛋白，改性后蛋白的消化率提高。姜燕等[34]通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（TGase）對大豆分離蛋白膜、小麥面筋蛋白膜等進行改性，結(jié)果表明TGase 處理顯著降低了蛋白膜的消化率。而在本研究中，磷酸化改性在蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團中引入磷酸根離子，改性程度在4%以內(nèi)時，改性前、后WPI 的消化率沒有顯著性差異。唐文婷[35]用STP 對小麥面筋蛋白進行改性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改性程度在4%以內(nèi)時蛋白體外消化率無明顯變化，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，雖然在模擬胃、腸消化過程中改性WPI 的氨基酸組成與未改性的有差異，但Caco-2 細胞吸收轉(zhuǎn)運實驗表明WPI 磷酸化改性對其吸收轉(zhuǎn)運率及吸收產(chǎn)物氨基酸組成無顯著影響，這說明WPI磷酸化改性不影響其消化吸收。

4 結(jié)論

隨著磷酸化改性程度的增大，WPI 的功能性質(zhì)有所改善，SRCAA 均大于75 且與未改性的無明顯差別，在模擬胃、腸消化和Caco-2 細胞吸收轉(zhuǎn)運后，改性后的WPI 消化吸收率、氨基酸組成與未改性的無顯著差異。

綜上，WPI 磷酸化改性在改善其功能性質(zhì)的同時，不影響其營養(yǎng)價值和消化利用，可更廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)生產(chǎn)中。