熱輔助超聲波處理中VBNC態(tài)鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生及其機(jī)制

張蕊蕊 聶新穎 廖紅梅 劉元法

（江南大學(xué)食品學(xué)院 無錫214122）

熱輔助超聲波（thermosonication，TS）是在超聲波的基礎(chǔ)上結(jié)合中等強(qiáng)度熱處理，以達(dá)到食品殺菌、滅酶和保持品質(zhì)的一種加工方式。有研究表明TS 具有良好的殺菌效果[1-4]。例如，Lee 等[5]使用TS 處理磷酸緩沖液中的大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)在61 ℃下TS 處理2 min，可使活菌數(shù)減少2 log10（CFU/mL）。Abid 等[6]報道在60 ℃下TS 處理10 min 使蘋果汁達(dá)到商業(yè)無菌。作者在前期研究中采用TS 處理牛肉膏蛋白胨酵母提取物（Beef Peptone Yeast，BPY）培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）時發(fā)現(xiàn)能夠達(dá)到降低近8 個對數(shù)的殺菌效果[7]。在一些條件下，作者也檢測到鼠傷寒沙門氏菌的活菌數(shù)與可培養(yǎng)數(shù)之間有較大的差距，進(jìn)而提出在這些條件下部分鼠傷寒沙門氏菌轉(zhuǎn)入一種特殊的休眠狀態(tài)，即活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)。例如，在TS 處理（380 W、53 ℃、30 min）條件下，有2.84 lg（CFU/mL）鼠傷寒沙門氏菌以VBNC 態(tài)存活。這表明單以傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基平板計數(shù)來評價TS 的殺菌效果可能造成漏檢的風(fēng)險。

VBNC 態(tài)是微生物尤其是非芽孢桿菌在不適宜環(huán)境下產(chǎn)生的一種特殊休眠狀態(tài)[8]，其在適當(dāng)條件下可能復(fù)蘇的特性對食品質(zhì)量安全及消費者健康有潛在威脅。有研究表明鼠傷寒沙門氏菌在寡營養(yǎng)[9]、紫外[10]、過氧化氫[11]、高鹽高滲[12]、氯消毒劑[13]等條件下進(jìn)入VBNC 態(tài)以達(dá)到存活目的，然而鮮有報道在TS 處理中進(jìn)入VBNC 態(tài)。大量研究表明TS 技術(shù)殺菌過程中主要是基于超聲波和熱處理中機(jī)械作用、化學(xué)作用和加熱對微生物細(xì)胞膜、核酸和蛋白質(zhì)等的破壞作用而達(dá)到殺菌目的，對于其如何誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)并無報道。作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)自由基清除劑對于鼠傷寒沙門氏菌活性具有顯著影響[14]，推測TS 處理中產(chǎn)生的自由基可能對于VBNC 態(tài)的產(chǎn)生具有推動作用，因此有必要定性、定量研究自由基對VBNC 態(tài)產(chǎn)生的影響。

本文主要研究TS 處理條件對BPY 培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC 態(tài)的影響，分析TS 處理過程中自由基產(chǎn)生與VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)之間的關(guān)系，以期為TS 技術(shù)應(yīng)用于食品殺菌提供更好的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 蛋白胨、牛肉膏，北京奧博星生物科技有限公司；酵母粉、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂粉，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；細(xì)菌DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒，杭州博日公司；RT-qPCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EASY Dilution，日本Takara 公司；qPCR 試劑盒，德國Qiagen 公司；DMPO，美國Sigma Aldrich 公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 7900HT 熒光定量PCR 儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；EMX plus-10/12 電子自旋共振波譜儀，德國布魯克科技有限公司；SCIENTZ-ⅡD 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DC-0506 低溫恒溫槽，上海衡平儀器儀表廠；TGL-16M 冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.1.3 菌株 鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50115（Salmonella enterica serovar Typhimurium）由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保菌管理中心提供。

1.1.4 培養(yǎng)基 BPY 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g 和葡萄糖5 g，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值為7.0，121 ℃滅菌15 min，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液準(zhǔn)備 將-80 ℃凍存的鼠傷寒沙門氏菌菌株取出，在SS 瓊脂平板上劃線37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于100 mL BPY 液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)10 h，制成初始含量為107（CFU/mL）的菌懸液作為工作菌液。

1.2.2 TS 處理 將夾套燒杯用75%酒精浸泡15 min，用無菌水沖洗3 遍，再用待測菌液潤洗1 遍，加入5 mL 菌液，并加入DMPO 至終濃度100 mmol/L。打開水浴循環(huán)，溫度達(dá)到設(shè)定溫度時開啟超聲設(shè)備，待處理完成后立即關(guān)閉水浴循環(huán)，并立即取樣進(jìn)行DNA、RNA 的提取及可培養(yǎng)數(shù)的測定，同時進(jìn)行ESR 檢測。

1.2.3 鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測

1.2.3.1 DNA、RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 取1 mL 經(jīng)TS 處理的菌液于4 ℃、12 000 r/min 離心2 min，收集菌體，采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取DNA，得到50 μL DNA 樣品。采用細(xì)菌RNA 提取試劑盒提取RNA，得到50 μL RNA 樣品。為排除DNA干擾，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）去除基因組DNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 樣品。

1.2.3.2 總菌數(shù)、活菌數(shù)及可培養(yǎng)數(shù)檢測

1）總菌數(shù)的檢測方法 參照J(rèn)iang 等[15]和Liao 等[14]的方法進(jìn)行qPCR檢測。將DNA 用EASY Dilution 試劑（for Real Time PCR，日本Takara 公司）進(jìn)行10 倍梯度稀釋，稀釋7 個梯度100～10-6，建立qPCR 得到的熒光閾值（CT）與平板計數(shù)法得到的菌落數(shù)[log10（CFU/mL）]之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偩鷶?shù)即CT值在qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對應(yīng)的菌落數(shù)。

2）活菌數(shù)的檢測方法 參照J(rèn)iang 等[15]和Liao 等[14]的研究方法進(jìn)行RT-qPCR。將cDNA 用EASY Dilution 試劑進(jìn)行10 倍梯度稀釋，稀釋6個梯度100～10-5，建立RT-qPCR 得到的熒光閾值（CT）與平板計數(shù)法得到的菌落數(shù)[log10（CFU/mL）]之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；罹鷶?shù)即CT值在RT-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對應(yīng)的菌落數(shù)。

3）可培養(yǎng)數(shù)的檢測方法 參照國標(biāo)GB4789.2-2010 方法，采用平板計數(shù)方法測定樣品的可培養(yǎng)數(shù)。

1.2.3.3 VBNC 數(shù)及VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)的計算

VBNC 數(shù)是活菌數(shù)與可培養(yǎng)數(shù)之間的差值。VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)的計算公式：

1.2.4 自由基定量檢測 將毛細(xì)管封閉的一端折斷，吸入待測樣品高度1.5 cm。用凡士林封住遠(yuǎn)離樣品端，樣品端朝下置于核磁管中，立即將核磁管置于共振腔，并使樣品位于共振腔中部。ESR 檢測的參數(shù)設(shè)定為：中心磁場3 350 G、掃場寬度150 G、掃描時間20.01 s、掃描次數(shù)10、微波功率20 mW。數(shù)據(jù)使用Bruker Xenon 軟件分析，以碳為中心自由基的第1 條譜線的峰高代表自由基強(qiáng)度。每組重復(fù)樣品做3 次平行檢測。

1.2.5 自由基與VBNC 態(tài)形成之間的關(guān)系驗證為了驗證TS 處理過程中自由基的產(chǎn)生量與VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)之間的相關(guān)性，使用自由基清除劑丙酮酸鈉進(jìn)行驗證。在TS 處理之前加入丙酮酸鈉，經(jīng)380 W、53 ℃、6 min 處理后立即測定自由基及VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)。所有試驗經(jīng)3 組重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.5 軟件作圖，SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 TS 處理對BPY 中鼠傷寒沙門氏菌 VBNC態(tài)產(chǎn)生的影響

如圖1所示，當(dāng)功率達(dá)到190 W 及以上，活菌數(shù)與可培養(yǎng)數(shù)隨功率的增加而顯著下降，且二者的間距變大，表明TS 處理后部分細(xì)菌進(jìn)入VBNC態(tài)。在功率570 W 時，存活鼠傷寒沙門氏菌全部進(jìn)入VBNC 態(tài)（圖1a）。在32～42 ℃之間，活菌數(shù)與可培養(yǎng)數(shù)的變化不大；當(dāng)處理溫度高于42 ℃，活菌數(shù)與可培養(yǎng)數(shù)急劇下降，且二者的間距逐漸增大，說明VBNC 態(tài)數(shù)量增加。當(dāng)溫度57 ℃時，VBNC態(tài)達(dá)到最大值3.61 log10（CFU/mL）（圖1b）。在380 W、53 ℃條件下處理2 min 后，活菌數(shù)保持在1.55 log10（CFU/mL），然而可培養(yǎng)數(shù)顯著下降直至低于檢測限（8～10 min），10 min 時進(jìn)入VBNC 態(tài)4.27 log10（CFU/mL）。以上結(jié)果表明，TS 處理能有效殺滅BPY 中大部分鼠傷寒沙門氏菌，其滅菌率高達(dá)99.99%，然而仍有少量鼠傷寒沙門氏菌在TS 處理中迫于外界壓力進(jìn)入VBNC 態(tài)以存活。TS 處理強(qiáng)度與微生物失活率呈正相關(guān)，這與Anaya-Esparza等[2]的研究結(jié)果相近。以上結(jié)果表明鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生VBNC 態(tài)與TS 處理條件有關(guān)。

2.2 TS 處理過程中自由基產(chǎn)生及分析

如圖2所示，未經(jīng)TS 處理的BPY 具有極低ESR 光譜信號，而經(jīng)TS 處理（380 W、53 ℃、6 min）后，BPY 的ESR 光譜信號顯著增強(qiáng)且變得復(fù)雜。主要產(chǎn)生3 種自由基信號，包括以碳為中心的自由基（DMPO-·R：g 因子=2.00654；αN=15.4727 G；αH=22.8898 G）、羥基自由基（DMPO-·OH：g 因子=2.0065；αN=αH=14.8 G）與氫質(zhì)子自由基（DMPO-·H：g 因子=2.0066；αN=15.87 G；αH=22.5 G），其中最主要的是以碳為中心的自由基。羥基自由基和氫質(zhì)子自由基主要是因超聲波作用在水分子上而產(chǎn)生。同時羥基自由基為已知較強(qiáng)的氧化劑，能氧化BPY 中的有機(jī)物質(zhì)而產(chǎn)生以碳為中心的自由基，這種可能已被證實[16]。另一種可能是BPY中有機(jī)物質(zhì)在TS 的熱與空穴作用下發(fā)生C-H 鍵的斷裂，生成以碳為中心的自由基。具體過程因BPY 體系復(fù)雜而難以推測，需進(jìn)一步驗證。

圖1 TS 處理對鼠傷寒沙門氏菌總菌數(shù)、活菌數(shù)、可培養(yǎng)數(shù)的影響（CK 組為未處理樣品）Fig.1 Variations in total，viable and cultutable counts of S.Typhimurium during TS processing（CK：untreated sample）

2.3 TS 處理中自由基強(qiáng)度與VBNC 態(tài)發(fā)生率的關(guān)系解析

圖2 TS 處理過程中產(chǎn)生的自由基ESR 檢測譜圖Fig.2 ESR spectra of DMPO solution，untreated BPY and TS treated S.Typhimurium suspension in BPY，and fitting curves of 3 kinds of free radicals trapped by DMPO

圖3a 結(jié)果顯示，隨著功率的增加，自由基強(qiáng)度與VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)均呈增加趨勢。圖3b 結(jié)果顯示，在32～52 ℃之間，隨著溫度升高，自由基強(qiáng)度呈上升趨勢，且VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)呈上升趨勢；52 ℃后，自由基強(qiáng)度呈下降趨勢，此時VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)達(dá)到最大值1 000。圖3c 表明，隨著時間延長至8 min，自由基強(qiáng)度與VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)均呈上升趨勢；在8 min 后，VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)仍保持上升的趨勢，自由基強(qiáng)度呈明顯的下降趨勢。在TS 處理強(qiáng)度較弱時，自由基產(chǎn)生并積累，其中羥基自由基可能與BPY 中有機(jī)物質(zhì)進(jìn)一步反應(yīng)生成以碳為中心的自由基，使其強(qiáng)度增加；當(dāng)累積到最高水平后，羥基自由基和以碳為中心自由基不再持續(xù)積累。一方面由于功率和溫度升高或處理時間延長使溶液蒸氣壓持續(xù)升高，造成空穴氣泡過早斷裂，進(jìn)而其瞬間高溫與高壓發(fā)生幾率下降，自由基強(qiáng)度降低；另一方面，DMPO與碳為中心自由基的加合物隨著TS 功率和溫度升高或處理時間延長會發(fā)生熱分解[17]。

圖3 TS 處理條件對BPY 體系中產(chǎn)生自由基強(qiáng)度及鼠傷寒沙門氏菌VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)間的關(guān)系Fig.3 Effects of TS processing on generation of free radicals and their corresponding VBNC state incidence index

TS 處理過程中產(chǎn)生的自由基強(qiáng)度與VBNC態(tài)發(fā)生率指數(shù)之間關(guān)系呈現(xiàn)“S 型”曲線，可分為3個階段：起始期、快速增長期與穩(wěn)定期。所得試驗數(shù)據(jù)均勻分布在Boltzmann 模型曲線兩側(cè)，說明該模型能較好地擬合試驗數(shù)據(jù)（圖4）。自由基強(qiáng)度與VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)之間具有良好的相關(guān)性，當(dāng)自由基強(qiáng)度小于0.02，自由基對VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)影響較小。隨著自由基強(qiáng)度的增加，VBNC態(tài)發(fā)生率指數(shù)顯著增加，說明自由基是VBNC 態(tài)產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。當(dāng)自由基強(qiáng)度大于0.10，雖然其強(qiáng)度增加，但是VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)保持在最大值1000，主要是由于此時殘存細(xì)菌全部進(jìn)入VBNC 態(tài)，說明自由基是誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC 態(tài)的關(guān)鍵因素。

為了驗證模型的適用性，重新設(shè)計1 組試驗，所得數(shù)據(jù)均勻分布在該曲線上及兩側(cè)（圖5）。對VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)實測值與模型預(yù)測值進(jìn)行比較（圖5），發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)均勻分布在y = 65.25 +0.93x 線上及兩側(cè)，表明模型適用性較好。進(jìn)而采用Af、Bf、SS 與R2來評價擬合曲線的擬合度。其中，Af、Bf 越接近1，擬合度越高；SS 越小，擬合曲線的精確度越高；R2越大，曲線的擬合度越高[18-19]。得到結(jié)果：R2= 0.94，Af = 1.10，Bf = 1.38，SS =13.40。擬合曲線的擬合度良好，準(zhǔn)確度較高，Boltzmann 模型可用于評價和預(yù)測TS 處理BPY中自由基產(chǎn)生與鼠傷寒沙門氏菌VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)間的結(jié)果和趨勢。

圖4 TS 處理過程中產(chǎn)生自由基強(qiáng)度與VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)之間相關(guān)性的擬合Fig.4 Correlation between the intensity of free radicals and VBNC state incidence index in S.Typhimurium

圖5 TS 處理過程中實測與模型預(yù)測VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)之間的關(guān)系Fig.5 Correlation between the experimental data and the predicted data obtained with the Boltzmann model

2.4 自由基對VBNC 態(tài)產(chǎn)生的影響驗證

為了進(jìn)一步驗證自由基對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC 態(tài)的影響，在TS 處理前加入適量自由基清除劑，即0～200 mmol/L 丙酮酸鈉。如圖6所示，當(dāng)丙酮酸鈉濃度為0～20 mmol/L 時，鼠傷寒沙門氏菌的活菌數(shù)與可培養(yǎng)數(shù)隨其濃度的增加而快速增長，且二者之間的距離逐漸縮小，表明VBNC 態(tài)數(shù)量呈下降趨勢。與此同時，自由基強(qiáng)度也呈下降趨勢，表明丙酮酸鈉能夠清除TS 處理BPY 中鼠傷寒沙門氏菌所產(chǎn)生的自由基，在此濃度范圍隨其濃度的增加，清除更多的自由基。自由基被清除后顯著提高了鼠傷寒沙門氏菌的可培養(yǎng)性而使VBNC 態(tài)數(shù)量降低（圖7）。當(dāng)丙酮酸鈉濃度達(dá)到20 mmol/L 及更高時，體系中TS 處理產(chǎn)生的自由基幾乎全部被清除，活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)隨丙酮酸鈉濃度的增加而維持平衡，然而仍有約1.99 log10（CFU/mL）的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC 態(tài)。結(jié)果表明自由基雖是誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC態(tài)的關(guān)鍵因素，但非唯一因素。

3 結(jié)論

1）TS 處理導(dǎo)致少量鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)。隨著TS 處理強(qiáng)度（例如：功率、溫度的增加及時間的延長）的增加，VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)增加。

2）TS 處理中BPY 體系產(chǎn)生3 種自由基，包括以碳為中心的自由基、羥基自由基與氫質(zhì)子自由基。自由基強(qiáng)度與TS 處理條件相關(guān)，低處理強(qiáng)度下隨著TS 處理強(qiáng)度的增加，自由基強(qiáng)度增加；過高的功率、溫度與過長時間的處理反而使自由基強(qiáng)度降低。

3）自由基與VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)之間的相關(guān)性符合Boltzmann 模型。通過加入自由基清除劑（丙酮酸鈉），進(jìn)一步驗證了TS 處理中產(chǎn)生的自由基是導(dǎo)致鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入VBNC 態(tài)的關(guān)鍵因素，此結(jié)果可為TS 殺菌技術(shù)在食品中的應(yīng)用提供參考。

圖6 丙酮酸鈉對TS 處理（380 W、53℃、6 min）中鼠傷寒沙門氏菌總菌數(shù)、活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)的影響Fig.6 Effect of sodium pyruvate on S.Typhimurium populations distribution at different concentrations as exposed to TS processing at 380 W and 53 ℃for 6 min

圖7 丙酮酸鈉對TS 處理（380 W、53 ℃、6 min）中BPY 體系自由基強(qiáng)度與鼠傷寒沙門氏菌VBNC 態(tài)發(fā)生率指數(shù)之間的關(guān)系Fig.7 Effects of sodium pyruvate on intensity of free radicals and VBNC state incidence index as exposed to TS processing at 380 W and 53 ℃for 6 min