培養(yǎng)肉的研究進(jìn)展與挑戰(zhàn)

周光宏 丁世杰 徐幸蓮

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心 南京210095）

肉類因含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營養(yǎng)成分而成為人類最重要的食品之一。隨著世界總?cè)丝诘脑鲩L以及發(fā)展中國家生活水平的提高，全球肉類消費(fèi)量持續(xù)升高，預(yù)計(jì)到2050年會(huì)增加50%以上[1]。2030年，我國的人均肉類消費(fèi)量預(yù)計(jì)較2010年增長100%～200%[2]。依賴畜牧業(yè)的肉類生產(chǎn)方式與資源環(huán)境稟賦之間的矛盾日益突出，畜牧業(yè)生產(chǎn)資源消耗多，溫室氣體排放量大，對環(huán)境污染嚴(yán)重，同時(shí)也存在動(dòng)物福利和健康等方面的問題[1]。近年來，非洲豬瘟、禽流感等動(dòng)物疫病的流行也給肉類安全生產(chǎn)帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，亟需開發(fā)高效綠色的肉類生產(chǎn)技術(shù)。培養(yǎng)肉技術(shù)是近年來興起的一項(xiàng)顛覆性肉類生產(chǎn)技術(shù)，可以部分取代傳統(tǒng)畜牧業(yè)生產(chǎn)肉類，是一種未來食品生產(chǎn)技術(shù)[3-4]。

培養(yǎng)肉（Cultured Meat，亦稱為細(xì)胞培養(yǎng)肉或培育肉）是依據(jù)動(dòng)物肌肉生長修復(fù)機(jī)理，利用其干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)而獲得的肉類，它不需要經(jīng)過動(dòng)物養(yǎng)殖，直接用細(xì)胞工廠化生產(chǎn)肉類[5-7]。培養(yǎng)肉技術(shù)是近年來興起的一項(xiàng)具有顛覆性的未來食品生產(chǎn)技術(shù)，與傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)方式相比，培養(yǎng)肉可以減少7%～45%的能源消耗，降低78%～96%的溫室氣體排放量，降低99%的土地使用，減少82%～96%的用水量等[8]。2013年8月，荷蘭Mark Post教授在英國倫敦舉辦了全球首次培養(yǎng)牛肉漢堡試吃大會(huì)，第1 次證明了培養(yǎng)肉的概念的可行性[9]。自2013年以來，對培養(yǎng)肉的研究在國際上迅速發(fā)展，取得了一系列重大突破。2019年11月18日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)使用豬肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)20 d，獲得中國第1 塊細(xì)胞培養(yǎng)肉。

由于基礎(chǔ)研究、工業(yè)化生產(chǎn)、食品化技術(shù)以及安全監(jiān)管等問題，目前全球還沒有培養(yǎng)肉商業(yè)化產(chǎn)品。本文首先總結(jié)了培養(yǎng)肉的發(fā)展歷程，然后從肌肉的生長發(fā)育規(guī)律出發(fā)，結(jié)合肉類的理化性質(zhì)和加工特性，從種子細(xì)胞獲取、干性維持、無血清培養(yǎng)條件、擴(kuò)大培養(yǎng)、大規(guī)模分化、食品化技術(shù)、產(chǎn)品安全評價(jià)與管理規(guī)范7 個(gè)方面闡述培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的挑戰(zhàn)及可能的未來發(fā)展方向，為培養(yǎng)肉相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展提供參考。

1 培養(yǎng)肉發(fā)展歷程

培養(yǎng)肉的概念早在1931年由丘吉爾提出[10]，經(jīng)過近80年的技術(shù)積累才逐漸變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。動(dòng)物肌肉的生長發(fā)育、細(xì)胞生物學(xué)和組織工程等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了培養(yǎng)肉技術(shù)研究。表1梳理了培養(yǎng)肉的發(fā)展歷史。

表1 培養(yǎng)肉的發(fā)展歷史Table1 Events in cultured meat history

2 肌肉發(fā)育及損傷修復(fù)

培養(yǎng)肉的生產(chǎn)是模擬和遵循動(dòng)物肌肉的生長發(fā)育以及肌肉損傷修復(fù)規(guī)律。深入研究肌肉組織發(fā)育和損傷修復(fù)過程，可以為培養(yǎng)肉生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支撐。肌肉細(xì)胞的發(fā)育主要分為胚胎期、胎兒期以及出生后3 個(gè)部分[20-21]。在發(fā)育過程中，一部分細(xì)胞分化形成軸旁中胚層，再發(fā)育為生皮肌節(jié)，最后進(jìn)一步發(fā)育成為肌肉祖細(xì)胞。肌肉祖細(xì)胞相互融合形成初級肌纖維和次級肌纖維，幫助胚胎期和胎兒期的肌肉形成。出生以后，肌肉則主要依靠增加肌原纖維骨架蛋白合成實(shí)現(xiàn)肌肉增長[20-21]。在成體肌肉組織中，還存在肌肉干細(xì)胞（Muscle Stem Cell，MuSC）。肌肉干細(xì)胞又被稱為肌衛(wèi)星細(xì)胞（Satellite cell），主要來源于胎兒期的肌肉祖細(xì)胞，負(fù)責(zé)出生后的肌肉組織損傷修復(fù)[22]。

在肌肉發(fā)育和損傷修復(fù)過程中，肌源性細(xì)胞會(huì)表達(dá)特異性的轉(zhuǎn)錄因子，包括Pax3/7 以及其它的肌肉調(diào)節(jié)因子，如Myf5，MyoD，Mrf4 和Myog等，并最終表達(dá)肌肉細(xì)胞特有的如MyHC 等肌肉蛋白[20]。肌肉細(xì)胞形成的主要生物學(xué)過程見圖1。闡明肌細(xì)胞形成規(guī)律，為體外形成肌肉組織奠定了良好的理論基礎(chǔ)，推動(dòng)了培養(yǎng)肉的研究進(jìn)程。

3 肉的組成及加工特性

肉類的肌肉蛋白質(zhì)賦予肉獨(dú)特的理化性質(zhì)和加工特性。從化學(xué)成分上來說，肉中的蛋白質(zhì)含量約為20%，是最重要的營養(yǎng)成分[23-24]。肉中的蛋白質(zhì)主要包括約50%的肌原纖維蛋白，約30%的肌漿蛋白和約20%的基質(zhì)蛋白[24]。肉中的蛋白質(zhì)對于肉的加工特性、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、顏色等都有著非常重要的作用[24-25]。肌原纖維蛋白是肉制品加工過程中最重要的蛋白質(zhì)，在較高的鹽離子強(qiáng)度下，肌原纖維蛋白充分溶解，幫助形成良好的肌肉蛋白凝膠制品。肌漿蛋白可以增強(qiáng)肌原纖維蛋白凝膠。結(jié)締組織蛋白由于溶解性較差，因此對于肉制品的凝膠作用有限[24]。同時(shí)，肌肉蛋白對乳化型肉制品的乳化特性也非常重要。將肌漿蛋白和高鹽離子強(qiáng)度下溶解的肌原纖維蛋白一起作為乳化劑，可以降低脂肪和水之間的界面張力，形成穩(wěn)定乳濁液，肌原纖維蛋白的乳化特性更好[24]。另外，肌肉蛋白對于色澤（肌紅蛋白）、風(fēng)味（美拉德反應(yīng)）等食用特性也有非常重要的作用[26]。

細(xì)胞培養(yǎng)肉目前還很難形成大塊的肌肉組織，而分化的肌管中富含大量的肌肉特有的蛋白質(zhì)?？紤]到肌肉組織中蛋白質(zhì)的重要作用，在培養(yǎng)肉的生產(chǎn)過程中，應(yīng)注重肌管生成效率，最大程度地生產(chǎn)肌肉細(xì)胞和肌肉細(xì)胞蛋白，從而幫助生產(chǎn)“真正”的培養(yǎng)肉肉制品。

圖1 骨骼肌細(xì)胞譜系圖Fig.1 Proposed lineage scheme for skeletal muscle

4 培養(yǎng)肉生產(chǎn)流程

根據(jù)肌肉細(xì)胞的生物學(xué)過程以及肌肉的理化、加工特性，培養(yǎng)肉生產(chǎn)的第1 要?jiǎng)?wù)就是生成大量的肌肉細(xì)胞及蛋白質(zhì)。培養(yǎng)肉的產(chǎn)業(yè)化方案見圖2。首先需要分離獲取肌肉干細(xì)胞（muscle Stem cell，MuSC）、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）和其它底盤細(xì)胞（Others）等種子細(xì)胞，種子細(xì)胞需要具有或可誘導(dǎo)的肌源性（脂源性）細(xì)胞命運(yùn)；然后，通過生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)種子細(xì)胞的大規(guī)模增殖；再利用分化模具、生物反應(yīng)器或3D 打印的方法大規(guī)模生產(chǎn)肌肉組織；最后利用食品化加工技術(shù)制作培養(yǎng)肉產(chǎn)品。

圖2 培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)化方案Fig.2 Schematic of cultured meat production

5 培養(yǎng)肉的研究進(jìn)展及技術(shù)挑戰(zhàn)

利用現(xiàn)有的技術(shù)方法，可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)肉的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)，然而，要實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)肉低成本、高效率和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)仍有很多技術(shù)難題需要攻克。

5.1 干細(xì)胞獲取

干細(xì)胞獲取是培養(yǎng)肉生產(chǎn)的基礎(chǔ)。根據(jù)肌肉發(fā)育和損傷修復(fù)的生物學(xué)過程，肌源性細(xì)胞命運(yùn)是培養(yǎng)肉種子細(xì)胞的必然要求。除此之外，培養(yǎng)肉的種子細(xì)胞還需具備以下的要求：①細(xì)胞要易于獲取，且能夠在體外持續(xù)增殖并有較高的肌管分化效率；②在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的基因組要相對穩(wěn)定。目前，適宜的培養(yǎng)肉種子細(xì)胞大致有以下幾種，包括肌肉干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和其它底盤細(xì)胞。

肌肉干細(xì)胞又稱肌衛(wèi)星細(xì)胞，是肌肉組織中的專能干細(xì)胞。肌肉干細(xì)胞易于分離培養(yǎng)和肌源性分化特性使其成為良好的培養(yǎng)肉種子細(xì)胞[27]。由于肌肉組織中存在著至少十幾種不同類型的細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血液細(xì)胞等，所以如何分離獲取畜禽動(dòng)物高純度肌肉干細(xì)胞成為一大難題[28-29]。早期研究肌肉干細(xì)胞通常采用貼壁法或Percoll 密度梯度離心法。這類的方法可以實(shí)現(xiàn)一定程度上的肌肉干細(xì)胞富集，然而方法的重復(fù)性和細(xì)胞純度存在較大的不穩(wěn)定性[28，30-31]?，F(xiàn)階段的流式細(xì)胞分選技術(shù)則是根據(jù)肌肉干細(xì)胞特有的表面標(biāo)志物進(jìn)行分離，細(xì)胞純度很高，然而該方法的成本較高[28-29]。未來肌肉干細(xì)胞的分離技術(shù)需要通過肌肉干細(xì)胞特有的代謝特點(diǎn)，制定特異性的分離條件，選擇性地促進(jìn)肌肉干細(xì)胞生長或者通過代謝障礙選擇性地抑制其它類型的細(xì)胞生長。相關(guān)的技術(shù)已應(yīng)用于肌肉干細(xì)胞、心肌細(xì)胞的純化，然而穩(wěn)定性和細(xì)胞純度還需進(jìn)一步研究[32-33]。

其它細(xì)胞類型，由于自身不具有肌源性細(xì)胞命運(yùn)，所以需要進(jìn)行誘導(dǎo)才能作為種子細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞具有全能性，經(jīng)過細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控，可以定向誘導(dǎo)分化為PAX7 陽性的肌肉干細(xì)胞或者M(jìn)yHC 陽性的多核肌管[20，34]。相關(guān)的命運(yùn)調(diào)控過程遵循胚胎肌肉發(fā)育過程。相關(guān)的研究也集中在小鼠和人的研究中，涉及畜禽動(dòng)物的研究還較少[35]。未來研究ESC 和iPSC 作為培養(yǎng)肉種子細(xì)胞，需要建立相關(guān)的畜禽動(dòng)物ESC/iPSC細(xì)胞系并完善培養(yǎng)方法，制定屬于畜禽動(dòng)物最合適的肌源性誘導(dǎo)分化方法。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類多能性干細(xì)胞，具有分化成脂肪組織、骨組織和軟骨組織的潛力。已有的一些研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化形成肌細(xì)胞，然而分化效率很低[36-38]。未來將MSC 作為種子細(xì)胞，需要進(jìn)一步研究畜禽動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，進(jìn)行肌源性定向誘導(dǎo)分化研究，提高分化效率。另外，MSC 可以作為脂肪組織的種子細(xì)胞，用來開發(fā)含有脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)肉組織。

除了上述的干細(xì)胞，通過異位基因表達(dá)，可以讓其它底盤細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成肌細(xì)胞，作為種子細(xì)胞。底盤細(xì)胞可以選取常見的成纖維細(xì)胞等，細(xì)胞來源較為容易。該方法需要通過基因編輯操作，使底盤細(xì)胞表達(dá)成肌決定因子，如MYOD，PAX3/7等，從而具有肌源性的細(xì)胞命運(yùn)[20]。利用這類方法制作種子細(xì)胞，需要首先注意基因編輯操作直接用于食品的安全性評價(jià)。另外，需要構(gòu)建畜禽動(dòng)物異位表達(dá)成肌決定因子細(xì)胞株[39]。

在培養(yǎng)肉的生產(chǎn)過程中，其它類型的種子細(xì)胞都需要誘導(dǎo)分化形成肌肉干細(xì)胞或者成肌細(xì)胞，通過肌源性細(xì)胞命運(yùn)生產(chǎn)肌肉細(xì)胞和肌肉蛋白。在以下論述時(shí)，主要以肌肉干細(xì)胞作為討論對象。

5.2 肌肉干細(xì)胞的干性維持

培養(yǎng)肉是需要在體外大量培養(yǎng)具有分化為肌管能力的種子細(xì)胞。以肌肉干細(xì)胞為例，肌肉干細(xì)胞的干性維持主要是維持細(xì)胞的增殖能力和肌源性分化能力。細(xì)胞在長期培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力減弱，稱為海佛里克極限（Hayflick Limit）[40]。其主要原因是端粒的長度在細(xì)胞分裂過程中逐漸縮短，最終引發(fā)基因組不穩(wěn)定而導(dǎo)致細(xì)胞衰老[40]。不僅如此，體外培養(yǎng)還會(huì)造成表觀遺傳變異、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡等一系列細(xì)胞衰老現(xiàn)象[41]。豬、牛等動(dòng)物肌肉干細(xì)胞的體外培養(yǎng)結(jié)果表明：培養(yǎng)過程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力減弱，干性基因表達(dá)量下降，細(xì)胞的肌管形成能力和修復(fù)肌肉損傷的能力也顯著降低[28-29]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，通過添加一定的炎癥因子來模仿骨骼肌再生的炎癥環(huán)境，能夠幫助肌肉干細(xì)胞增殖和干性維持[42-43]。另外，抑制p38 信號通路也可以維持體外培養(yǎng)的肌肉干細(xì)胞干性[29，44]。目前的研究大多集中在小鼠模型上，未來能否借鑒應(yīng)用于畜禽農(nóng)產(chǎn)動(dòng)物，還需做大量的研究。另外，能否通過基因編輯維持端粒酶活性，從而維持端粒的長度，延緩畜禽動(dòng)物肌肉干細(xì)胞衰老，也需進(jìn)一步研究。

5.3 無血清培養(yǎng)基

胎牛血清是體外培養(yǎng)基中常見的補(bǔ)充物，然而胎牛血清來源困難，營養(yǎng)成分未知，批次之間品質(zhì)難以控制，有感染病毒風(fēng)險(xiǎn)等問題[45]。建立無血清培養(yǎng)方法對于降低培養(yǎng)肉的生產(chǎn)成本，保證生產(chǎn)過程的可控性非常重要。J.van der Valk 等[45]總結(jié)了開發(fā)無血清培養(yǎng)基的模塊化方法。在該金字塔模型中，由下到上包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞外基質(zhì)包被的培養(yǎng)表面、生長因子、激素、β-巰基乙醇、脂類、維生素等。越接近金字塔頂部，作為無血清培養(yǎng)成分的特異性越高[45]。目前針對胚胎干細(xì)胞、血液干細(xì)胞已開發(fā)出無血清培養(yǎng)基[46-47]。早期針對肌肉干細(xì)胞或成肌細(xì)胞的無血清培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，適宜的睪酮激素能夠幫助成肌細(xì)胞增殖[48]。類胰島素生長因子也能夠持續(xù)促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖[49-50]。Florini 等[51]進(jìn)一步測試了各類激素、糖蛋白和生長因子，最終總結(jié)出一種成肌細(xì)胞無血清培養(yǎng)條件。該培養(yǎng)基用Ham’s F-12 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加胎球蛋白、胰島素和地塞米松，最終得到的培養(yǎng)基能夠達(dá)到與10%馬血清培養(yǎng)基相似的增殖效率[51-52]。無血清分化培養(yǎng)基也是培養(yǎng)肉的研究重點(diǎn)，通過IGF-1 等生長因子配制的無血清分化培養(yǎng)基幫助成肌細(xì)胞體外分化，然而效率還有待提高[53-55]。另一種商業(yè)的血清替代物Ultroser G 能夠幫助成肌細(xì)胞更好地分化融合為肌管[28，56-57]。然而，Ultroser G 含有人源蛋白，從而限制了其在培養(yǎng)肉研究中的應(yīng)用。在胚胎干細(xì)胞體外分化為肌肉細(xì)胞的研究中，利用胰島素和N-2 培養(yǎng)基組成的無血清培養(yǎng)基也可以誘導(dǎo)肌管分化[58-59]。

對于培養(yǎng)肉而言，將小鼠和人的無血清研究成果轉(zhuǎn)化應(yīng)用到畜禽動(dòng)物細(xì)胞上，并進(jìn)一步優(yōu)化到食品領(lǐng)域，仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。未來研究應(yīng)通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)（包括脂質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)等）、蛋白組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)用，建立肌源性細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過程中的營養(yǎng)物質(zhì)的攝入和廢棄物產(chǎn)出的“精準(zhǔn)營養(yǎng)”調(diào)控過程，從而實(shí)現(xiàn)無血清培養(yǎng)基的個(gè)性化定制。另外，篩選出培養(yǎng)肉所需的生長因子等重要無血清成分后，利用生物工程技術(shù)，合成相關(guān)功能因子，從而大幅降低培養(yǎng)基成本，提高培養(yǎng)基的穩(wěn)定性[4，60]。

5.4 種子細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)

Mark Post 教授第1 塊85 g 培養(yǎng)肉漢堡約含有1.5×1010個(gè)成肌細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)分化生成培養(yǎng)肉組織[9]。而普通的10 cm 培養(yǎng)皿只能生產(chǎn)約1×106個(gè)細(xì)胞。如何實(shí)現(xiàn)工業(yè)化種子細(xì)胞生產(chǎn)，也是制約培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)化的重要難題。傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)因較低的表面積體積比，不能對培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，傳代過程繁瑣等一系列不足而不能用于培養(yǎng)肉種子細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)。大規(guī)模培養(yǎng)通常所用的方法是微載體懸浮培養(yǎng)[61]、固定化培養(yǎng)[62]或者聚集體懸浮培養(yǎng)[63]等方法。肌肉干細(xì)胞由于貼壁培養(yǎng)以及分化過程中需要細(xì)胞融合的生物學(xué)特性，因此選擇微載體懸浮培養(yǎng)是目前較為可行的培養(yǎng)方法。微載體細(xì)胞培養(yǎng)就是使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)[64]。

微載體培養(yǎng)成肌細(xì)胞過程中，高密度容易發(fā)生細(xì)胞聚集和分化現(xiàn)象[65]。Pascale Boudreault 等[66]詳細(xì)研究了二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)早期的流體剪切力會(huì)抑制細(xì)胞生長。Sanne Verbruggen等[61]研究發(fā)現(xiàn)，牛的成肌細(xì)胞能用幾種商業(yè)的微載體懸浮培養(yǎng)，并且細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)在微載體上的轉(zhuǎn)移。上述研究僅針對1 L 以下的轉(zhuǎn)瓶條件，而在2～20 L 生物反應(yīng)器以及更大的超過200 L 的生物反應(yīng)器中還沒有詳細(xì)研究[60，67]。未來的研究首先應(yīng)關(guān)注畜禽動(dòng)物肌肉干細(xì)胞高密度培養(yǎng)下的干性維持；然后，需要優(yōu)化微載體培養(yǎng)時(shí)的種類、微載體含量、細(xì)胞接種數(shù)目、攪拌頻率等工藝參數(shù)；最后，需要設(shè)計(jì)規(guī)模200 L 以上的生物反應(yīng)器，培養(yǎng)條件如細(xì)胞攝入氧氣的動(dòng)力學(xué)參數(shù)、剪切應(yīng)力對細(xì)胞的影響等也需進(jìn)一步研究[67]。

5.5 種子細(xì)胞大規(guī)模分化形成肌管

在生理狀態(tài)下，肌肉組織最終通過筋腱連接在骨骼上。通過模仿生理狀態(tài)下的肌肉，這種拉伸的組織工程模具能夠幫助肌肉細(xì)胞的排列、延伸，最終形成良好的收縮性和功能的肌肉組織[68-70]。目前用于生產(chǎn)肌肉組織的模具主要有單柱型、雙柱型以及多柱型[9，68]。然而，傳統(tǒng)的組織工程所生產(chǎn)的肌肉組織較小，通常應(yīng)用到藥物篩選和小鼠模型研究中。如何生產(chǎn)較大的肌肉組織用于培養(yǎng)肉生產(chǎn)也成為一大難題。未來研究應(yīng)聚焦于大型肌肉組織模具的開發(fā)，并研究如何大批量生產(chǎn)肌肉組織的方法。

在生理狀態(tài)下，骨骼肌肌肉細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)的包裹下有序排列，形成肌肉組織。這些細(xì)胞外基質(zhì)一般包括層粘黏蛋白、膠原蛋白IV、膠原蛋白I 和糖蛋白等[71-73]。在三維的肌肉組織研究中，通常用天然分離的生物材料或合成的生物材料作為細(xì)胞外基質(zhì)[74]。未來的支架材料應(yīng)首先利用現(xiàn)有的食品動(dòng)物源蛋白材料（膠原蛋白、明膠等）作為支架材料，研究培養(yǎng)肉肌肉組織生產(chǎn)過程和工藝，作為培養(yǎng)肉的過渡生產(chǎn)方式[75]。然而，培養(yǎng)肉的初衷是減少動(dòng)物飼養(yǎng)，要研究非動(dòng)物源的生物材料，如植物源的蛋白以及多糖類大分子，通過修飾或者改性后用于肌肉組織生產(chǎn)[76]。另外，研究一些可生物降解的合成材料，如聚乳酸，用于培養(yǎng)肉組織生產(chǎn)。最后，依據(jù)生物支架材料所需的特性，利用合成生物學(xué)的方法生產(chǎn)，如用大腸桿菌、酵母等生產(chǎn)體外重組膠原蛋白等[77]。

由于培養(yǎng)肉的主要目的是獲得分化的肌細(xì)胞，并大量生產(chǎn)肌肉蛋白，因此提高細(xì)胞的分化效率以及蛋白合成效率也是需要研究的重要課題。IGF-1/PI3K/Akt 信號通路[78]，mTORC1 信號通路[79]可以幫助肌細(xì)胞在體外分化并誘導(dǎo)肌管肥大，從而增加肌管的蛋白質(zhì)合成。Insulin，IGF 和Wnt7a等可以通過這些信號通路來誘導(dǎo)肌管肥大[80-81]。機(jī)械拉伸作用[82-83]、電刺激[84]也能進(jìn)一步幫助肌管成熟。明確這些信號通路在畜禽農(nóng)產(chǎn)動(dòng)物成肌細(xì)胞分化中的作用，從而幫助培養(yǎng)肉的蛋白生產(chǎn)還需進(jìn)一步研究。

培養(yǎng)肉生產(chǎn)的最終目標(biāo)是在體外培養(yǎng)1 塊與真實(shí)肌肉組織相同的肌肉組織，因此需探索分化形成大塊肌肉組織的方法。三維結(jié)構(gòu)支架+灌注式反應(yīng)器是一種潛在的方式[3]。然而，經(jīng)過測算，這樣的方式僅能用于幾毫米到1～2 cm 厚的支架，相關(guān)的生物反應(yīng)器也需要進(jìn)一步開發(fā)[67]。另外，現(xiàn)階段的3D 打印技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)較大塊的肌肉組織生產(chǎn)。Kang H W 等[69]利用3D 打印的方式，生產(chǎn)出1塊（15×5×1）mm3的小鼠肌肉組織。未來可以通過混合可食用支架材料以及不同種細(xì)胞，直接3D打印肌肉組織用于培養(yǎng)肉的生產(chǎn)。

5.6 食品化技術(shù)

現(xiàn)階段，各公司和科研機(jī)構(gòu)生產(chǎn)的培養(yǎng)肉肌肉組織在肉特有的色、香、味、型等方面還存在不足，需要通過商品化加工和重塑成型處理，制成培養(yǎng)肉產(chǎn)品[85]。食品化的首要前提是了解畜禽動(dòng)物的肌肉組織構(gòu)成以及產(chǎn)品的色、香、味、型形成原因。在肌肉組織中，血紅蛋白和肌紅蛋白是肉類顏色的主要來源；脂質(zhì)氧化、美拉德反應(yīng)是肉品風(fēng)味的重要來源；肌肉細(xì)胞內(nèi)的小分子代謝產(chǎn)物，加工過程中大分子降解生成的一些小分子肽、氨基酸、核苷酸等是肉品滋味的主要來源；而肉品的加工特性如乳化特性、凝膠特性等都是依賴肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的作用[24，86-87]。根據(jù)色、香、味、型的形成原理，利用添加各種輔料以及培養(yǎng)肉自身的蛋白特性，制作培養(yǎng)肉產(chǎn)品[88]。趙鑫銳等[85]綜述了培養(yǎng)肉食品化的一些途徑，包括生物合成血紅蛋白以維持產(chǎn)品的色澤和風(fēng)味，體外美拉德反應(yīng)形成風(fēng)味物質(zhì)，生物合成脂肪酸等以豐富產(chǎn)品的色、香、味等辦法，用于未來培養(yǎng)肉產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。未來研究中除了要開發(fā)利用生物合成、體外化學(xué)合成生產(chǎn)培養(yǎng)肉的加工輔料外，還應(yīng)關(guān)注如何提高培養(yǎng)肉自身肌紅蛋白合成，以及研究培養(yǎng)肉生成的肌肉蛋白對色、香、味、型的作用。

5.7 培養(yǎng)肉產(chǎn)品安全評價(jià)與管理規(guī)范制定

由于培養(yǎng)肉是新興的肉類生產(chǎn)技術(shù)，因此其安全性需要慎重研究。美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)和美國農(nóng)業(yè)部就培養(yǎng)肉監(jiān)管問題進(jìn)行了多次商討，制定了管理框架[89]。國內(nèi)一些學(xué)者也在積極研究培養(yǎng)肉的生產(chǎn)過程，探討培養(yǎng)肉安全性評價(jià)和監(jiān)管辦法[90]。培養(yǎng)肉的食品安全風(fēng)險(xiǎn)主要來自生產(chǎn)過程中的化學(xué)安全、生物安全和營養(yǎng)安全[5，90]。對于化學(xué)安全，主要是生產(chǎn)過程中的化合物成分、支架材料、模具材料以及加工輔料等，這些材料對于細(xì)胞的增殖、分化以及產(chǎn)品加工等過程非常重要，然而許多材料還沒有食品安全使用史[5，90]。生物安全一方面是細(xì)胞在分離、增殖和分化過程中，可能在體外培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了基因突變而帶來與體內(nèi)發(fā)育過程不一樣的細(xì)胞核酸、蛋白等成分。另一方面，采用基因編輯等手段進(jìn)行種子細(xì)胞改造時(shí)，容易引入高風(fēng)險(xiǎn)的生物外源物質(zhì)，因此更要對細(xì)胞的功能和食用特性進(jìn)行致敏性、毒性等安全性評價(jià)[91]。此外，需要考慮培養(yǎng)肉與普通肉在組成成分、加工后成分變化以及食用后的消化吸收情況，評估培養(yǎng)肉的攝入標(biāo)準(zhǔn)與營養(yǎng)價(jià)值。未來應(yīng)針對相應(yīng)的化學(xué)、生物和營養(yǎng)安全，建立培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)鏈條中各產(chǎn)品的安全性評價(jià)指標(biāo)，構(gòu)建培養(yǎng)肉營養(yǎng)評價(jià)模型，制定培養(yǎng)肉評估暴露膳食攝入標(biāo)準(zhǔn)，為培養(yǎng)肉的市場推廣提供安全性政策、法規(guī)保障[5，90]。

6 結(jié)語

培養(yǎng)肉作為一種未來食品生產(chǎn)技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)肉類蛋白的高效綠色生產(chǎn)。未來培養(yǎng)肉研究應(yīng)圍繞如何產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)肌肉蛋白這一核心問題，在基礎(chǔ)研究、擴(kuò)大生產(chǎn)、食品化技術(shù)以及市場準(zhǔn)入等方面繼續(xù)攻關(guān)。目前歐美等國正處在技術(shù)攻堅(jiān)和商業(yè)化應(yīng)用開拓的關(guān)鍵時(shí)期，我國也應(yīng)該加大培養(yǎng)肉投入，力爭在未來的培養(yǎng)肉技術(shù)競爭中實(shí)現(xiàn)并跑甚至領(lǐng)跑。最終讓培養(yǎng)肉能早日走上百姓餐桌，保障我國未來動(dòng)物蛋白供應(yīng)。