福建省樟樹潰瘍病病原菌的分離與鑒定

張曉陽，吳 松，王美鑫，韓森匯，宋 漳，陳全助

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院，福建 福州 350002)

樟樹[Cinnamomumcamphora(L.) Presl]，又名香樟、芳樟，屬樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木，是國務(wù)院1999年8月4日批準(zhǔn)的國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生植物之一[1]。樟樹材質(zhì)致密美觀，含有特殊香氣，耐濕，抗腐防蟲，是造船、家具等行業(yè)的上等用材。樟樹植株全身皆可提取樟腦和芳香油，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥，是重要的特用經(jīng)濟(jì)林[2]。隨著人們對樟樹資源潛在價(jià)值認(rèn)識的深入及開發(fā)利用技術(shù)的提高，全國各樟樹適生區(qū)開始大面積種植樟樹[3]。樟樹自然分布于中國南方各省、越南以及日本等地[4-6]，亞洲東部、大洋洲和太平洋諸島也都有分布。2015年以來，福建省全省林業(yè)有害生物普查發(fā)現(xiàn)，福州、三明、龍巖和南平等地均有樟樹潰瘍病的分布，其中僅南平市順昌縣受害面積便高達(dá)20 hm2，為樟樹種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展敲響了警鐘，摸清該病害的病原菌也成了迫在眉睫的任務(wù)。

樟樹潰瘍病1994年首次在湖南發(fā)現(xiàn)，郭立中等[7]初次鑒定病原為囊孢殼菌(Physalosporasp.)，有性態(tài)為大莖點(diǎn)霉(Macrophomasp.)；隨后鄧先瓊等[8]調(diào)整鑒定病原有性態(tài)為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，無性態(tài)為七葉樹殼梭孢(Fusicoccumaesculi)。在2019年翟立峰等[9]對重慶樟樹潰瘍病進(jìn)行了分離和系統(tǒng)鑒定，前期的研究范圍主要集中在湖南[7-8]、江蘇[10]和上海[11]等地，目前關(guān)于福建省樟樹潰瘍病的研究鮮見報(bào)道。鑒于此，本研究通過采集福建省內(nèi)樟樹潰瘍病樣本進(jìn)行病原菌純化，根據(jù)病原菌的形態(tài)學(xué)特征、致病性以及對核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer of ribosome gene，ITS)、翻譯延伸因子(translation elongation factor，EF-1α)、RNA聚合酶Ⅱ大亞基(RNA polymerase Ⅱ large subunit，RPB2)和β-微管蛋白(β-tubulin，BT)基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，對病原菌進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定，從而填補(bǔ)福建省樟樹潰瘍病研究這一空缺。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

樣本采集自福建省福州市倉山區(qū)、三明市明溪縣、南平市建陽區(qū)和順昌縣，現(xiàn)由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所保存。

1.2 病原菌分離與純化

采用常規(guī)病組織分離法[12]。取病健交界處表皮，剪成5 mm×5 mm的組織塊，用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡30 s，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的升汞浸泡1 min后，用無菌水漂洗3遍，置于濾紙上吸干水分，將組織塊呈梅花狀置于先前倒好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)平板上。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，待組織塊周圍長出菌絲后，挑取菌絲移至新的PDA平板中繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)菌落的顏色以及形態(tài)特征編號。

1.3 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，采用活體針刺和無傷接種法進(jìn)行致病性測定。將菌餅接種在健康且長勢基本一致的2年生樟樹幼苗枝干上，對照組接種空白PDA，每個(gè)處理重復(fù)3次，用濕潤的脫脂棉包扎，最外面使用醫(yī)用膠帶固定，將接種的幼苗置于溫室30 ℃保濕培養(yǎng)，逐日測量病斑的長度與寬度，并利用橢圓面積公式計(jì)算病斑擴(kuò)展面積。取接種發(fā)病后的部位進(jìn)行組織分離、鏡檢觀察和ITS序列比較，確定病原菌，將具有致病性的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察記錄菌落形態(tài)[13]，并在接種的枝干上每日觀察枝干表面子實(shí)體形成的情況，子實(shí)體形成后采用冷凍切片和壓片的方法在顯微鏡下觀察菌株的子實(shí)體和孢子形態(tài)，顯微鏡拍照并測量孢子大小。

1.5 病原菌分子鑒定

將菌株接種在PDA平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后刮取新鮮的菌絲，采用SP Fungal DNA Kit試劑盒，提取病原菌脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)，分別對ITS、EF-1α、RPB2和BT基因序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增[14-15]。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，52～55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存10 min。將擴(kuò)增好的DNA條帶，使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行DNA回收，之后將DNA片段連接到載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過陽性驗(yàn)證后，將菌液送至北京擎科生物科技公司測序。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將得到的序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)里初步比對，然后整理自己的序列和下載的對比序列，按照ITS、EF-1α、RPB2、BT的順序建立一個(gè)文本，利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行對齊分析，將輸出的文件使用Sequence Matrix軟件進(jìn)行4個(gè)基因的串聯(lián)拼接，用數(shù)據(jù)分析模型和鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展支持值(bootstrap)為1 000。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件對病斑擴(kuò)展數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。測量孢子大小得出的數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟樹潰瘍病病害癥狀

樟樹枝干潰瘍病從3月份開始出現(xiàn)，該病害最初在枝干、枝丫出現(xiàn)近圓形黑褐色病斑，隨著病斑的擴(kuò)展枝干開始凹陷，在枝干表皮開始有黑色子實(shí)體產(chǎn)生，如圖1(a)所示，隨著病斑擴(kuò)展形成梭形病斑，并且顏色加深；后期發(fā)病處樹皮開裂甚至腫大形成瘤狀物，如圖1(b)所示；病斑以上的枝條和葉片逐漸壞死，如圖1(c)所示。該病害在林間擴(kuò)展迅速，短時(shí)間內(nèi)可形成大面積的枝干枯死，危害巨大。

(a)枝干上的子實(shí)體Fruit bodies on the branch (b)枝干開裂Cracked branches (c)頂端枯萎Apical blight

圖1 樟樹潰瘍病癥狀
Figure 1 Symptoms of camphor tree canker disease

2.2 病原菌的致病性測定

采用活體接種的方式將不同地區(qū)分離到的75份菌株在盆栽的樟樹幼苗上進(jìn)行致病性測定。結(jié)果顯示，在接種JY-1、JY-2、JY-3、JY-4、JY-5、JY-6、FZ-1、MX-5和SC-1菌株的樟樹枝干上出現(xiàn)潰瘍癥狀，接種2 d后開始有淺褐色近圓形的病斑出現(xiàn)，其中JY-5、MX-5、SC-1菌株有少量菌絲產(chǎn)生。隨著病斑的擴(kuò)展，形成近橢圓或梭形的褐黑色病斑；7 d后枝干病斑內(nèi)周開始產(chǎn)生黑色子實(shí)體，并且病斑開始輕微凹陷；接種病原菌21 d的病斑形態(tài)如圖2所示，后期病斑逐漸環(huán)繞，病斑上部的枝干開始出現(xiàn)枯死。

(a)CK(b)JY-1(c)JY-2 (d)JY-3 (e)JY-4

(f)JY-5(g)JY-6(h)FZ-1(i)MX-5(j)SC-1

圖2 接種病原菌21 d的病斑形態(tài)
Figure 2 Speckle morphology of trees after 21 days of inoculation

對發(fā)病的枝條進(jìn)行再分離，所得病原菌與原接種病菌形態(tài)一致，并且ITS序列相同。對不同致病菌株接種樟樹幼苗后21 d的病斑面積進(jìn)行差異性顯著分析，結(jié)果如圖3所示：不同菌株之間致病性差異顯著，其中JY-5菌株致病性最強(qiáng)，病斑面積達(dá)340.17 mm2，JY-2菌株的致病性最弱，病斑面積為51.94 mm2。

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。Note: the different lowercase letters indicate the difference at level 0.05.

圖3 不同致病菌株對樟樹幼苗的致病性測定
Figure 3 Pathogenicity of different pathogenic strains on camphor seedlings

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)特性

從不同地區(qū)共采集到樟樹潰瘍病樣品75份，經(jīng)過組織分離，致病性測定，最后得到43株具有葡萄座腔菌屬真菌特征的菌株。根據(jù)在PDA上的菌落形態(tài)和孢子特征分為4個(gè)類型，分別為Ⅰ型(JY-5、JY-8、JY-13、JY-34、JY-35、MX-5、MX-7、MX-8、MX-11、MX-21、SC-1、SC-4、SC-7)，Ⅱ型(JY-1、JY-2、JY-4、JY-6、JY-9、JY-22、JY-23、JY-40、MX-2、MX-3、MX-9、MX-23、MX-24、MX-25、MX-37、SC-9、SC-10、FZ-6)，Ⅲ型(JY-3、JY-15、JY-17、MX-1、MX-15、FZ-4)，Ⅳ型(FZ-1、FZ-2、FZ-3、FZ-12、FZ-13、FZ-33)。

代表菌株JY-5的菌落特征和分生孢子形態(tài)與小新殼梭孢(N.parvum)相似，小新殼梭孢形態(tài)學(xué)特征如圖4所示。從圖4可以看出，在PDA平板上，菌落為白色，氣生菌絲較為密集，2 d后菌落氣生菌絲變成灰白色，菌落背部開始出現(xiàn)橄欖綠色，后期菌落上部為一些白色氣生菌絲，下部的菌絲變成黑色，菌落背部為深灰色或者黑色。分生孢子器著生在樟樹枝干表面，黑色、近球形、單腔。分生孢子器壁褐色，由致密、厚壁的角質(zhì)化組織構(gòu)成。分生孢子梗無色透明，著生在分生孢子器的內(nèi)壁上，短棒狀、尖端略尖，產(chǎn)生分生孢子。分生孢子單孢，近橢圓形至紡錘形，薄壁、無隔、無色透明，且內(nèi)有油球，大小為(11.90～18.90) μm×(5.34～7.29) μm。

(a)前期和后期的菌落正面The front of the colony in the early and later stages(b)分生孢子器Pycnidium(c)子囊Ascus

(d)分生孢子Conidia(e)萌發(fā)的分生孢子Germinated conidia(f)萌發(fā)的分生孢子Germinated conidia

圖4 小新殼梭孢形態(tài)學(xué)特征
Figure 4 Morphological characteristics ofN.parvum

根據(jù)代表菌株JY-3的菌落特征和分生孢子形態(tài)初步判定為假可可毛色二孢(L.pseudotheobromae)，其形態(tài)學(xué)特征如圖5所示。從圖5可以看出，在PDA平板上，菌落氣生菌絲較為稀疏，顏色呈白色，菌落背部也呈白色。菌落后期菌絲變密，顏色呈灰黑色，菌落背部也呈灰黑色；分生孢子器，單腔，大小不一致，在分生孢子器內(nèi)組織形成分生孢子梗，從而形成分生孢子。該菌株會形成2種類型分生孢子，初期分生孢子無色透明，棒狀或者近橢圓形，無隔膜，內(nèi)含油球，大小為(20.65～29.10) μm×(11.06～17.51) μm，壁厚達(dá)(1.04±0.02) μm；成熟孢子顏色呈褐色，出現(xiàn)橫膈膜，并且有縱紋產(chǎn)生，大小為(20.83～30.96) μm×(12.46～16.19) μm。

(a)前期菌落形態(tài)(正面和反面)Early colony morphology(front and back)(b)后期菌落形態(tài)(正面和反面)Late colony morphology(front and back)(c)分生孢子器和分生孢子梗Pycnidium and conidiophore

(d)分生孢子Conidia(e)萌發(fā)的孢子Germinated conidia(f)成熟的分生孢子Mature conidia

圖5 假可可毛色二孢形態(tài)學(xué)特征
Figure 5 Morphological characteristics ofL.pseudotheobromae

根據(jù)代表菌株JY-6的菌落特征和分生孢子形態(tài)初步判定為可可毛色二孢(L.theobromae)，其形態(tài)學(xué)特征如圖6所示。從圖6可以看出，菌落正面氣生菌絲較為密集，顏色呈白色，菌落背部也呈白色。菌落后期菌絲顏色呈灰黑色，菌落背部呈灰黑色。分生孢子器，單腔，大小不一致，在分生孢子器內(nèi)組織形成分生孢子梗，從而形成分生孢子。該菌株會形成2種類型分生孢子，初期分生孢子無色透明，近橢圓形，無隔膜，內(nèi)含油球，大小為(17.64～29.72) μm×(11.28～18.38) μm，壁厚達(dá)(0.94±0.01) μm；成熟孢子顏色呈褐色，出現(xiàn)橫膈膜，顏色較深并且有縱紋產(chǎn)生，大小為(19.92～27.83) μm×(12.11～15.14) μm。

(a)前期菌落形態(tài)(正面和反面)Early colony morphology(front and back)(b)后期菌落形態(tài)(正面和反面)Late colony morphology(front and back)(c)分生孢子器Pycnidium

(d)分生孢子梗Conidiophore(e)早期的分生孢子Early conidia(f)成熟的分生孢子Mature conidia

圖6 可可毛色二孢形態(tài)學(xué)特征
Figure 6 Morphological characteristics ofL.theobromae

根據(jù)代表菌株FZ-1的菌落特征和分生孢子形態(tài)初步判定為L.iranensis，其形態(tài)學(xué)特征如圖7所示。從圖7可以看出，菌落正面氣生菌絲較為密集，顏色呈白色，菌落背部也呈白色。菌落后期菌絲顏色呈灰黑色，菌落背部呈灰黑色。分生孢子器，單腔，大小不一致，直徑可達(dá)228.57 μm。在分生孢子器內(nèi)組織形成分生孢子梗和側(cè)絲，側(cè)絲較為明顯，分生孢子梗上產(chǎn)生分生孢子。該菌株會形成2種類型分生孢子，初期分生孢子無色透明，近橢圓形或者棒狀，無隔膜，內(nèi)含油球，大小為(21.62～31.23) μm×(11.46～16.19) μm，壁厚達(dá)(1.32±0.02)μm；成熟孢子顏色呈褐色，出現(xiàn)橫膈膜，顏色較深并且有縱紋產(chǎn)生，大小為(19.30～26.25) μm×(11.65～14.91) μm。

(a)前期菌落形態(tài)(正面和反面)Early colony morphology(front and back)(b)后期菌落形態(tài)(正面和反面)Late colony morphology(front and back)(c)分生孢子器Pycnidium

(d)分生孢子梗Conidiophore(e)早期的分生孢子Early conidia(f)成熟的分生孢子Mature conidia

圖7L.iranensis形態(tài)學(xué)特征
Figure 7 Morphological characteristics ofL.iranensis

2.4 病原菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過對9個(gè)代表菌株的ITS、EF-1α、RPB2和BT序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，對得到的序列進(jìn)行串聯(lián)分析，最后構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖8、圖9所示，SC-1、JY-5、MX-5這3個(gè)代表菌株都與N.parvum聚在同一組群上。JY-3菌株聚在L.pseudotheobromae上，與菌株CBS 116459相似性達(dá)97%，F(xiàn)Z-1菌株聚在L.iranensis上，與菌株CBS 124710相似性達(dá)99%，其他4個(gè)菌株都聚在L.theobromae這一組群上。

注：進(jìn)化樹分支上的數(shù)值表示置信度。Note: the value on the branch of the phylogenetic tree represents the confidence.

圖8 新殼梭孢屬代表菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹
Figure 8 Phylogenetic tree of the representing strains of the genusNeofusicoccum

注：進(jìn)化樹分支上的數(shù)值表示置信度。Note: the value on the branch of the phylogenetic tree represents the confidence.

圖9 毛色二孢屬代表菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹
Figure 9 The phylogenetic tree of the representing strains of the genusLasiodiplodia

3 討論與結(jié)論

毛色二孢屬(Lasiodiplodia)和新殼梭孢屬(Neofusicoccum)[16-17]都屬于葡萄座腔菌科(Botryosphaericeae)無性階段的菌物，有性態(tài)屬于葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)。它們的寄主廣泛，能夠侵染多數(shù)的果樹和經(jīng)濟(jì)樹種。對于潰瘍病已報(bào)道的有桉樹潰瘍病[18]、核桃潰瘍病[19]、胡桃木莖潰瘍病[20]和澳大利亞松樹潰瘍病[21]等。本研究在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了小新殼梭孢的有性態(tài)孢子，其形態(tài)為具有棒狀子囊，子囊內(nèi)含有8個(gè)不規(guī)則排列的子囊孢子，子囊孢子和分生孢子形態(tài)相似。對于毛色二孢菌暫未發(fā)現(xiàn)有性態(tài)，故在本研究中，對于病原菌的命名統(tǒng)一使用無性態(tài)來命名。

對福建省內(nèi)樟樹枝干潰瘍病樣本分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后結(jié)合ITS、EF-1α、RPB2和BT串聯(lián)基因序列進(jìn)行分子鑒定，最終確定4種類型菌株，分別為小新殼梭孢(代表菌株JY-5、MX-5、SC-1)，假可可毛色二孢(代表菌株JY-3)，可可毛色二孢(代表菌株JY-2、JY-2、JY-4、JY-6)，L.iranensis(代表菌株FZ-1)。樟樹潰瘍病首次在湖南發(fā)現(xiàn)[7]后經(jīng)鄧先瓊等[8]調(diào)整鑒定為B.dothidea，以及在2019年翟立峰等[9]的研究中將可可毛色二孢(有性態(tài)：B.dothidea)和小新殼梭孢(有性態(tài)：B.parva)作為病原菌進(jìn)行了報(bào)道，以上報(bào)道與本研究結(jié)果一致；與趙桂華[10]、王明生等[11]的研究結(jié)果有所偏差，其原因可能是地理位置的差異，使得植物和真菌均呈現(xiàn)出不同于其他地區(qū)的生長特性，且毛色二孢屬和新殼梭孢屬的菌株更易受溫濕度的影響。此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)樟樹潰瘍病病原菌也包含假可可毛色二孢和L.iranensis這2種類型菌株。

通過對致病性的研究表明，各種菌株之間的致病性差異明顯，其中小新殼梭孢最強(qiáng)，L.iranensis最弱，但是所有致病菌株在無傷接種的情況下并不發(fā)病，這也為防治樟樹潰瘍病提供了一定的思路，在野外為樟樹修剪枝條時(shí)，除了要在合適的時(shí)期進(jìn)行，修剪完后可以噴灑化學(xué)試劑，起到保護(hù)作用，避免因?yàn)樾拗χ圃斓膫趯?dǎo)致潰瘍病爆發(fā)。