果香型葡萄酒酵母的發(fā)酵特征與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

許維娜，王 磊，李記明*，劉延琳

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 陜西楊凌 712100 2 煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司 山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東煙臺(tái) 264001 3 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（葡萄酒學(xué)院） 山東煙臺(tái) 264003）

酵母菌是葡萄酒生產(chǎn)中的主要微生物，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味及質(zhì)量至關(guān)重要[1]。 葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母負(fù)責(zé)將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化成酒精和CO2，并生成數(shù)百種香氣物質(zhì)，形成葡萄酒最重要的香氣——發(fā)酵香（酒香、二類香氣），與品種香（果香、一類香氣）和陳釀香（三類香氣）一起構(gòu)成葡萄酒復(fù)雜而獨(dú)特的風(fēng)味[2-3]，因此，酵母被稱為“葡萄酒之父”。

葡萄酒中的主要香氣物質(zhì)有酯類（乙酸酯類和脂肪酸乙酯類）、醇類、酸類、酚類、酮類、醛類、萜烯類、含硫化合物等[4]。 其中部分在葡萄原料中是以結(jié)合態(tài)存在的潛在香氣物質(zhì)，需要酵母代謝進(jìn)行轉(zhuǎn)化和激發(fā)。 目前葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的千余種香氣物質(zhì)，超過(guò)400 種是在酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的[5]。性狀優(yōu)良的果香型酵母能充分激發(fā)葡萄原料中的潛在香氣，對(duì)提升葡萄酒果香型風(fēng)味與質(zhì)量是必不可少的[6]。我國(guó)氣候以及葡萄種植多樣化的特點(diǎn)造就了豐富的葡萄酒酵母資源[7]。由于長(zhǎng)期的自然選擇作用，酵母菌株已經(jīng)逐漸適應(yīng)了我國(guó)的風(fēng)土和葡萄特性，這些本土酵母用于葡萄酒釀造時(shí)，能夠充分反映葡萄品種的特色，具有強(qiáng)化葡萄酒中風(fēng)土特性的潛力，釀造出個(gè)性和風(fēng)格突出的優(yōu)質(zhì)葡萄酒[8-9]。 本土優(yōu)良酵母的選育及應(yīng)用對(duì)于國(guó)產(chǎn)葡萄酒質(zhì)量提升具有重要意義。

本項(xiàng)目組前期從陜西蛇龍珠發(fā)酵樣品中分離到一株果香表現(xiàn)突出的釀酒酵母菌株SSF12 （專利號(hào)ZL 2020 1 1494317.7），將其與另一株果香表現(xiàn)較差的菌株各自發(fā)酵后，收集酵母細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究?jī)芍杲湍妇D(zhuǎn)錄組學(xué)的差異。結(jié)合發(fā)酵液的理化指標(biāo)、香氣物質(zhì)含量和感官特性，解析果香型酵母代謝機(jī)理，為優(yōu)良酵母菌開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生葡萄酒酵母SSF12、NGF6 為前期從陜西蛇龍珠、 寧夏貴人香發(fā)酵的葡萄酒樣品中分離所得；蛇龍珠葡萄取自煙臺(tái)蓬萊某葡萄園。

葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Takara 酵母RNAiso plus 試劑盒，Takara 公司；DNase-free 水、RNase-free 水，金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司。YEPD 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

M391F 垂直層流超凈工作臺(tái)，法國(guó)Erlab 公司； 發(fā)酵罐，煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；5180R臺(tái)式大容量離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；UVS-99核酸蛋白測(cè)定儀，上海彥哲儀器設(shè)備有限公司；Agligent 6890N-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母的活化、接種、發(fā)酵 配制YEPD 培養(yǎng)基，進(jìn)行SSF12 和NGF6 的劃線轉(zhuǎn)接與活化。

成熟的蛇龍珠葡萄除梗破碎，浸漬12 h 后將皮渣過(guò)濾除去，取純汁。用葡萄汁進(jìn)行酵母種子液的制備，以5%的接種量接種至20 L 發(fā)酵罐中，24～26 ℃恒溫發(fā)酵。每日監(jiān)測(cè)發(fā)酵液比重和失重情況。

1.3.2 葡萄酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)的測(cè)定 待發(fā)酵液比重≤0.995 且日失重趨于穩(wěn)定時(shí)，停止發(fā)酵（發(fā)酵6 d）。將發(fā)酵液澄清、倒罐并于4 ℃下儲(chǔ)藏。對(duì)酒樣的基本理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，包括還原糖、總糖、總酸以及酒精度。 還原糖、 總糖測(cè)定采用費(fèi)林滴定法，總酸測(cè)定采用酸堿滴定法，酒精度測(cè)定采用密度瓶法[10]。 每個(gè)酒樣設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3 香氣成分與含量的檢測(cè) 將2 g 氯化鈉和8 mL 酒樣放入萃取瓶中并密封。 添加混合內(nèi)標(biāo)用于半定量分析（內(nèi)標(biāo)1：薄荷醇464.5 μg/L；內(nèi)標(biāo)2：2-辛醇500 μg/L）。 將樣品在45 ℃平衡5 min 后，用SPME Arrow 自動(dòng)進(jìn)樣裝置以250 r/min 的轉(zhuǎn)速下平衡樣品，并在相同轉(zhuǎn)速下用SPME Arrow 纖維進(jìn)行50 min 吸附。 待吸附平衡后迅速將進(jìn)樣器插入氣相色譜進(jìn)樣口解析，檢測(cè)色譜柱：WAX 毛細(xì)管柱（60 m×0.25 nm×0.25 nm）；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持1 min，以3 ℃/min 升溫至180℃，再以20 ℃/min 升溫至230 ℃，保持15 min；載氣（He）：1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，壓力：20.0 kPa。 質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲0.5 min。 每個(gè)樣品設(shè)2 個(gè)平行。將各香氣成分質(zhì)譜圖結(jié)果與NIST2008 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行比較，結(jié)合人工圖譜解析，進(jìn)行香氣物質(zhì)定性；采用2-辛醇內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量[11-12]。

1.3.4 感官質(zhì)量分析 感官分析小組由15 名經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的品酒師組成（7 男8 女，22～51 歲），參照GB/T 15038-2006[10]中的感官分析方法，從果香香氣（40 分）、果香口感（40 分）、果香整體（風(fēng)格和典型性，20 分） 三個(gè)方面對(duì)不同酒樣進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。 每個(gè)酒樣設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.5 發(fā)酵樣品中酵母的收集與轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序發(fā)酵6 d 后，離心收集酵母細(xì)胞 （6 000 r/min，4℃，5 min），并用DNase-free 水洗滌2 遍。 每5×107個(gè)細(xì)胞中加入1 mL 的RNAiso Reagent 溶液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RNA 的提取。 獲得RNA 沉淀后，加入RNase free 水使其完全溶解。用紫外吸收法檢測(cè)RNA 的濃度與純度（A260/280≥1.8）。 質(zhì)檢合格的RNA 樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序。 每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)平行。

獲得原始數(shù)據(jù)后，先進(jìn)行過(guò)濾，提高其質(zhì)量。過(guò)濾結(jié)束后，以釀酒酵母S.cerevisiae S288C（GCF_000146045.2_R64）的基因組為參考，采用TopHat2 （http：//ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtmL）進(jìn)行比對(duì)分析。采用RSeQC（v2.6.3）對(duì)測(cè)序飽和度、基因覆蓋率和重復(fù)讀取進(jìn)行分析，以評(píng)估轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的總體質(zhì)量。 為了鑒定差異基因（Differentially expressed genes，DEGs），采用FPKM（Fragments per kilobase of exon per million mapped reads）計(jì)算每個(gè)基因的差異表達(dá)水平，并使用EdgeR （Empirical analysis of Digital Gene Expression in R，v3.10）進(jìn)行差異表達(dá)分析，將Padjust<0.05 且|log2fold change （FC）|≥1 設(shè)置為默認(rèn)閾值。 根據(jù)Ding 等[13]的方法，將DEGs 用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）進(jìn)行功能注釋與富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒樣品基本理化指標(biāo)

兩酵母發(fā)酵樣品的基本理化指標(biāo)如表1 所示。 SSF12 發(fā)酵的樣品酒精度相對(duì)較高，糖含量和總酸較低，而NGF6 發(fā)酵的樣品酒精度較低，糖含量和總酸較高。 總體而言，SSF12 發(fā)酵樣品的發(fā)酵程度和糖利用率更高。

表1 發(fā)酵樣品的基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physicochemical parameters of fermentation samples

2.2 香氣物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

兩樣品中的香氣物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果如表2 所示，共檢測(cè)出73 種香氣物質(zhì)，按照結(jié)構(gòu)特性將其分為醛酮類（6 種）、酯類（44 種）、醇類（9 種）、酸類（8種）、萜烯、C13-降異戊二烯類（5 種）、酚類（1 種）等。

表2 發(fā)酵樣品香氣成分含量與香氣描述Table 2 The content and aroma description of aroma components in different fermentation samples

兩樣品中，酯類物質(zhì)的種類和含量均最多，醇類、 酸類物質(zhì)次之，酚類最少。 戊酸乙酯只在SSF12 的發(fā)酵樣品中檢測(cè)出來(lái)，其它物質(zhì)在兩樣品中均存在。

檢測(cè)到的香氣物質(zhì)中，種類和含量最多的為酯類，大多為葡萄酒貢獻(xiàn)果香、花香[14]。SSF12 發(fā)酵樣品中酯類物質(zhì)含量較NGF6 更高，預(yù)期花果香更明顯。含量第二的是醇類，通常來(lái)源于葡萄漿果本身以及發(fā)酵過(guò)程[15]。 低濃度的高級(jí)醇（＜300 mg/L）能夠增加葡萄酒香氣的復(fù)雜度[16]，兩樣品中醇類物質(zhì)含量均較為適宜，SSF12 略高。 葡萄酒中不同濃度的脂肪酸類、 醛類物質(zhì)會(huì)給酒體帶來(lái)不同的影響，適宜濃度時(shí)有助于塑造酒體的層次感和豐富度，濃度過(guò)高時(shí)則會(huì)產(chǎn)生腐敗和刺激性氣味[17-18]。 兩樣品中酸類物質(zhì)含量均在適宜范圍內(nèi)，且差別不大（NGF6 中含量略高）；醛類物質(zhì)雖濃度有差異（NGF6 中含量更高），但也均在適宜范圍內(nèi)。 另外，SSF12 中萜烯、C13-降異戊二烯類、酚類物質(zhì)含量也略高于NGF6。 總體而言，SSF12 的香氣物質(zhì)種類和含量均高于NGF6。

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

2.3 感官質(zhì)量分析結(jié)果

兩樣品的感官分析結(jié)果如表3 所示，其外觀無(wú)明顯差異，SSF12 發(fā)酵的樣品口感柔和，果香香氣和口感更為突出，酒體更加平衡、協(xié)調(diào)，綜合質(zhì)量更佳。

表3 感官質(zhì)量品評(píng)數(shù)據(jù)Table 3 Aroma sensory evaluation data

2.4 酵母轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果

利用Illumina HiSeq 技術(shù)對(duì)兩酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選|log2FC（SSF12/NGF6）|≥1 且Padjust<0.05 的基因作為差異基因（DEGs），共檢測(cè)出了434 個(gè)差異基因，包括290 個(gè)上調(diào)基因 （圖1，紅色）和144 個(gè)下調(diào)基因（圖1，綠色）。

圖1 SSF12 與NGF6 的基因表達(dá)差異火山圖Fig.1 The volcano graph of gene expression difference between SSF12 and NGF6

2.4.1 差異基因的KEGG 聚類分析結(jié)果 采用KEGG 聚類分析對(duì)果香酵母SSF12 和非果香型酵母NGF6 之間主要代謝途徑的差異進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2 所示。 所有的DEGs 被劃分為5 個(gè)主要類別，包括代謝（碳水化合物代謝，核苷酸代謝，氨基酸代謝，輔因子和維生素代謝，能量代謝，脂質(zhì)代謝6 個(gè)亞類，141 個(gè)DEGs），遺傳信息處理（轉(zhuǎn)錄，翻譯，折疊、 分類和降解3 個(gè)亞類，69 個(gè)DEGs），細(xì)胞過(guò)程（細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡，運(yùn)輸和分解代謝2 個(gè)亞類，34 個(gè)DEGs），環(huán)境信息處理（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)1 個(gè)亞類，9 個(gè)DEGs）和生物體系統(tǒng)（環(huán)境適應(yīng)1 個(gè)亞類，4 個(gè)DEGs）。 大部分途徑中上調(diào)基因比下調(diào)基因的數(shù)量更多，只有氨基酸代謝與能量代謝途徑中包含更多的下調(diào)基因，表明SSF12 中碳水化合物（包括葡萄糖、氨基糖和核苷酸糖、乙醛酸和二羧酸、丙酮酸、磷酸戊糖、淀粉和蔗糖、半乳糖、果糖、甘露糖等）、輔因子（泛酸、CoA、葉酸、核黃素）、核苷酸等的代謝效率更高，并且SSF12在DNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞生長(zhǎng)、物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境適應(yīng)等方面表現(xiàn)更好，這些現(xiàn)象可能有助于SSF12 快速適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境[19]；而NGF6 在部分氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸等）和氮代謝（能量代謝）方面有一定優(yōu)勢(shì)。

圖2 差異基因的KEGG 聚類統(tǒng)計(jì)柱形圖Fig.2 Statistics histogram of KEGG pathways of the DEGs

2.4.2 中心碳代謝及香氣物質(zhì)代謝途徑分析 葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的香氣物質(zhì)產(chǎn)生情況是酵母菌的重要特征之一，這些香氣物質(zhì)主要包括脂肪酸、高級(jí)醇、酯類、醛類、氨基酸等[20-21]，它們大多是中心碳代謝途徑的次級(jí)產(chǎn)物。 為了探明果香型酵母中心碳代謝和香氣物質(zhì)代謝的情況，對(duì)這些途徑及相關(guān)DEGs 進(jìn)行了更詳細(xì)的研究，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 中心碳代謝和香氣物質(zhì)代謝途徑中的差異表達(dá)基因（a）及差異表達(dá)倍數(shù)（b）Fig.3 The transcriptome profiles （a） and fold changes （b） of DEGs involved in the central carbon metabolism and volatile compound metabolism

淀粉和蔗糖代謝 （Starch and sucrose metabolism） 途徑中，SSF12 有8 個(gè)上調(diào)基因和1個(gè)下調(diào)基因。 其中，只有編碼葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶的SGA1 基因表達(dá)下調(diào)，log2FC 值為-1.30，其它基因均上調(diào)，包括IMA1，IMA2，IMA5，MAL12，MAL32 等葡萄糖苷酶基因。 這些基因的集中轉(zhuǎn)錄上調(diào)有助于蔗糖、葡萄糖、果糖等糖類的相互轉(zhuǎn)化。

糖酵解（Gluconeogenesis）途徑是葡萄糖經(jīng)過(guò)一系列的酶促反應(yīng)生成丙酮酸的過(guò)程，乙醛、乙酸和乙醇均在糖酵解中產(chǎn)生。此代謝途徑中，相較于NGF6，SSF12 有HXK2，ERR3，ADH6轉(zhuǎn)錄上調(diào)，F(xiàn)BP1，GPM2，PDC6，ADH2，ALD3 轉(zhuǎn)錄下調(diào)。 據(jù)報(bào)道，HXK2 參與葡萄糖抑制的調(diào)節(jié)，而且此調(diào)節(jié)作用具有很強(qiáng)的菌株特異性[22-23]。 乙醇脫氫酶（ADH家族）催化醛及相應(yīng)醇的轉(zhuǎn)化[24]，其中乙醇脫氫酶Ⅵ（ADH6p）參與醇類的合成，Mendes 等[25]認(rèn)為釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中ADH6 等基因的高水平表達(dá)與異丁醇、異戊醇和苯乙醇產(chǎn)量的提高相關(guān)，本研究中也觀察到了類似現(xiàn)象 （表2）。 乙醇脫氫酶II（ADH2p）催化醇向醛的轉(zhuǎn)化，劉奎等[26]研究發(fā)現(xiàn)中斷ADH2 基因能夠減少乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，提高乙醇產(chǎn)率。 本研究中ADH2 的log2FC 值為-1.82，且SSF12 發(fā)酵液乙醇含量高于NGF6（表1），與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符。Pigeau 等[27]、Heit 等[28]報(bào)道ALD3編碼的乙醛脫氫酶Ⅲ的高表達(dá)是導(dǎo)致冰酒中乙酸含量升高、乙酸乙酯含量降低的重要原因。本研究中NGF6 的ALD3 基因轉(zhuǎn)錄水平更高，乙酸含量高，乙酸乙酯含量低，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

磷酸戊糖途徑 （Pentose phosphate pathway）是葡萄糖氧化分解的另一個(gè)途徑，產(chǎn)生大量核糖和NADPH。 此途徑中，SSF12 有PRS3 和PRS4 轉(zhuǎn)錄上調(diào)，TKL2、GND2、SOL3 轉(zhuǎn)錄下調(diào)。 PRS3 和PRS4 是編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶的5 個(gè)基因家族中的2 個(gè)，催化多種生物合成途徑的第1 步，包括嘌呤和嘧啶的生物合成。 營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，PRS3 對(duì)于維持細(xì)胞完整性、離子穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞骨架是必不可少的[29]。 同時(shí)，PRS3 的高表達(dá)有助于細(xì)胞提高對(duì)高乙酸等環(huán)境逆境的適應(yīng)能力[30]。 GND2編碼磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，SOL3 編碼的6-磷酸葡萄糖醛酸酶也是磷酸戊糖途徑的重要酶類。 Liu 等[31]報(bào)道GND2、SOL3 等基因的增強(qiáng)表達(dá)對(duì)于NADPH 的再生具有重要意義，以提供乙醛轉(zhuǎn)化、脂肪酸合成等所需的輔助因子。 本研究中NGF6 發(fā)酵液中乙醛含量高于SSF12 （表2），GND2、SOL3 的轉(zhuǎn)錄上調(diào)并未加劇這兩種物質(zhì)的消耗。 而NGF6 中脂肪酸類物質(zhì)含量高于SSF12（表2），提示該菌株中過(guò)多的碳通量轉(zhuǎn)向脂質(zhì)的合成，Silverman 等[32]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。

三羧酸循環(huán) （TCA cycle） 途徑中，SSF12 有MDH2 轉(zhuǎn)錄下調(diào)，二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）途徑中，SHM2 轉(zhuǎn)錄上調(diào)，ICL1、MLS1 轉(zhuǎn)錄下調(diào)，其中MDH2、ICL1、MLS1 的下調(diào)可能會(huì)減弱對(duì)乙醛酸循環(huán)和糖異生的回補(bǔ)[33]。另外，果糖和甘露糖代謝（Fructose and mannose metabolism）途徑中，PFK27 轉(zhuǎn)錄上調(diào)；氨基糖和核苷酸糖代謝 （Amino sugar and nucleotide sugar metabolism） 途徑中，PSA1 轉(zhuǎn)錄上調(diào)； 丁酸代謝（Butanoate metabolism） 途徑中，ILV2 轉(zhuǎn)錄上調(diào)，BDH1 轉(zhuǎn)錄下調(diào)。研究報(bào)道，PFK27 編碼6-磷酸果糖-2-激酶，是糖酵解途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，會(huì)在葡萄糖缺乏的情況下抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[34]；PSA1 的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)非適宜溫度的耐受性[35]；這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)可能有助于增強(qiáng)SSF12 細(xì)胞的環(huán)境適應(yīng)性。 ILV2 表達(dá)水平與高級(jí)醇產(chǎn)量負(fù)相關(guān)，即敲除該基因有助于提高高級(jí)醇含量[36]，這與本研究SSF12 發(fā)酵液中高級(jí)醇含量更高的結(jié)果并不相符，這可能是由于基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平不一致，以及其它基因（ADH2、ADH6 等）轉(zhuǎn)錄調(diào)控的綜合作用結(jié)果。

脂肪酸代謝中，參與甘油酯代謝（Glycerolipid metabolism） 的GPP1、GPP2 以及參與脂肪酸代謝（Fatty acid degradation/biosynthesis/elongation）的FAA3、ELO3 轉(zhuǎn)錄上調(diào)。 GPP1、GPP2 編碼甘油-3-磷酸磷酸酶，催化甘油-3-磷酸向甘油的轉(zhuǎn)化。 文獻(xiàn)報(bào)道，GPP1 和GPP2 的高表達(dá)雖然不能顯著增加甘油產(chǎn)量，但可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)滲透、厭氧和氧化應(yīng)激的耐受性[37]。 FAA3 編碼長(zhǎng)鏈脂肪酸CoA 連接酶，ELO3 編碼脂肪酸延長(zhǎng)酶，這2 個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)有助于脂質(zhì)的積累。

另有多個(gè)DEGs 參與氨基酸代謝過(guò)程，如參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝的ILV1 和CYS4，參與賴氨酸合成的LYS12，參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的ADE12，參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝的ERG13，以及參與β-丙氨酸代謝的PAN6 轉(zhuǎn)錄上調(diào)；參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的AAT1、GLT1，參與半胱氨酸和蛋氨酸代謝的MDH2 轉(zhuǎn)錄下調(diào)。 這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可能影響相應(yīng)氨基酸的合成和分解。

葡萄酒中由發(fā)酵產(chǎn)生的酯主要有兩類，分別是乙酸酯（高級(jí)醇/乙醇和活性乙酰輔酶A 之間的縮合）和脂肪酸乙酯【活性脂肪酸（酰基輔酶A）/高級(jí)醇（?；o酶A）和乙醇之間的縮合】[38]。 ATF2（編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶Ⅱ，log2FC 為1.25） 參與乙酸酯的合成，其上調(diào)可能導(dǎo)致乙酸酯的合成代謝加快。本研究SSF12 發(fā)酵液中乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯等乙酸酯含量均高于NGF6（表2），可能與ATF2 的轉(zhuǎn)錄上調(diào)相關(guān)。

總的來(lái)說(shuō)，SSF12 和NGF6 的中心碳代謝和揮發(fā)性化合物代謝途徑存在差異。 SSF12 在糖類轉(zhuǎn)化、高級(jí)醇生成、酯類代謝等途徑中有更多的上調(diào)基因，而NGF6 在乙醛合成、脂肪酸合成等途徑更具優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

對(duì)比果香型酵母SSF12 與果香表現(xiàn)較差的酵母NGF6 的發(fā)酵和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩菌株的代謝及代謝調(diào)控情況有較大的差異。 SSF12 糖利用度和發(fā)酵度高，發(fā)酵液中酯類、醇類、萜烯類物質(zhì)含量高于NGF6，醛類、脂肪酸含量低于NGF6，果香感官特性明顯優(yōu)于NGF6。 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SSF12 在碳水化合物（尤其是糖類、高級(jí)醇、酯類）代謝、核酸代謝途徑中表現(xiàn)更突出，NGF6 在乙醛合成、脂肪酸合成、部分氨基酸代謝途徑中表現(xiàn)更好。 ADH2，ADH6，ALD3，ATF2 等基因在SSF12中轉(zhuǎn)錄上調(diào)，且與香氣物質(zhì)代謝密切相關(guān)，可作為基因工程改良酵母的研究基因，為果香型酵母的選育提供參考。

選育性狀優(yōu)良的本土特色酵母是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。 本文通過(guò)對(duì)比分析果香型表現(xiàn)好的酵母與果香型表現(xiàn)差的酵母的發(fā)酵表現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異，了解果香酵母香氣物質(zhì)代謝通路調(diào)節(jié)情況，解析各基因在發(fā)酵過(guò)程中的作用及影響，為果香型酵母的篩選與改良提供依據(jù)，有助于高效篩選高品質(zhì)本土酵母，釀造出更具風(fēng)土特性的國(guó)產(chǎn)葡萄酒。