低強度超聲體外抑制SMMC-7721細胞增殖

石明芳， 劉邦忠， 劉光華， 王 平， 楊名珍

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院康復(fù)科，上海 200032

低強度超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是治療頻率和強度均較低的波，具有組織中易穿透、聲能吸收少、對組織損傷小的特點。LIPUS具有機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，能夠有效促進骨折的愈合、軟組織修復(fù)、溶栓作用、感染炎癥的修復(fù)和促進藥物的滲透等。近年來，隨著對超聲生物學(xué)效應(yīng)研究的深入，LIPUS成為腫瘤治療的一種新手段。研究[1]表明，正常細胞對LIPUS的作用具有抵抗力，而惡性腫瘤細胞對其很敏感。LIPUS能提高血腦屏障和血瘤屏障通透性，增加局部的藥物濃度，提高化療藥物的療效[2-3]。同時，在體內(nèi)外環(huán)境下，LIPUS聯(lián)合微泡劑能有效促進腫瘤細胞中靶基因?qū)牒捅磉_[4]，增強基因治療腫瘤的效果。LIPUS作為一種新型的治療方法，對腫瘤細胞具有殺傷效應(yīng)，并能協(xié)同其他治療手段，有望用于腫瘤治療，發(fā)揮抗癌效應(yīng)[5]。

肝細胞癌(簡稱“肝癌”)是全球范圍內(nèi)多發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率在男性中占腫瘤的第5位、致死率居腫瘤第2位，在女性中占腫瘤的第7位、致死率居腫瘤第6位[6]。由于大量慢性乙型肝炎和黃曲霉毒素感染人群的存在，中國肝癌發(fā)病率居高不下。在不斷完善優(yōu)化現(xiàn)有治療手段的基礎(chǔ)上，進一步尋找新的治療技術(shù)和方法迫在眉睫。國內(nèi)Sun等[7]用低強度聚焦超聲介導(dǎo)微泡破裂，用于治療兔VX2原位肝腫瘤，結(jié)果證實LIPUS可抑制VX2肝癌細胞的生長。本研究將LIPUS作用于肝腫瘤細胞系SMMC-7721細胞，觀察其對細胞增殖活性的影響，并篩選最優(yōu)強度，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備 人肝癌細胞系SMMC-7721細胞由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所惠贈。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、雙抗(青霉素和鏈霉素)、胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)均購于美國Gibco公司，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒購于美國Invitrogen公司，MTT試劑購于上海碧云天生物公司。酶標儀由德國Eppendorf公司生產(chǎn)，F(xiàn)ACSort流式細胞儀由美國BD Biosciences公司生產(chǎn)，實驗用超聲治療儀由英國BTL公司生產(chǎn)。

1.2 SMMC-7721細胞培養(yǎng)及處理 將SMMC-7721細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱中。將處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞接種于6孔板內(nèi)，接種密度為0.5×106/mL；待細胞處于對數(shù)生長期且細胞活力>95%，80%～90%滿時，室溫下進行LIPUS處理。

LIPUS處理腫瘤細胞的方法參照Feril等[8]的實驗：將超聲探頭(有效面積5 cm2)垂直固定于6孔板底部(底面積9.5 cm2)，其間用耦合劑填充以隔絕空氣；頻率為1 MHz，工作周期為25%、時間為1 min，處理強度根據(jù)前期實驗[9]結(jié)果采用0.3、0.5、1.0、 1.3、 2.0 W/cm2。對照組超聲治療儀工作狀態(tài)：強度為0 W/cm2，頻率1 MHz，工作周期25%、時間為1 min，其他參數(shù)均與實驗組相同。細胞經(jīng)LIPUS處理，孵育6 h后，置于倒置顯微鏡下觀察形態(tài)改變。每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 MTT法測定細胞增殖抑制率 收集對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，按照5×103/孔細胞密度接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2恒溫孵育箱中)。培養(yǎng)24 h后，LIPUS組用LIPUS處理細胞，對照組予超聲探頭假照1 min，操作后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育。6 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸掉上清后，每孔加入50 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速震蕩20 min，最后采用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔吸光度(OD,490 nm)。上述步驟均重復(fù)3次。細胞存活率=(實驗組OD值÷對照組OD)×100%。根據(jù)SMMC-7721細胞存活率，篩選出超聲最佳作用強度。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 待細胞生長至對數(shù)生長期時，LIPUS組采用MTT法結(jié)果確定的最佳作用強度處理，對照組用超聲探頭假處理。處理后繼續(xù)孵育6 h，收集細胞，PBS重懸計數(shù)；取5×105個細胞加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2 結(jié) 果

2.1 LIPUS對SMMC-7721細胞增殖活性的影響 以對照組細胞存活率為100%，結(jié)果(表1)表明：0.3 W/cm2組細胞存活率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0.5 W/cm2及以上強度組細胞存活率逐漸下降，呈強度依賴性，與對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。0.5 W/cm2組細胞存活率與0.3 W/cm2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與1.0 W/cm2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；1.3 W/cm2組細胞存活率與1.0 W/cm2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與1.5 W/cm2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。最終確定0.5 W/cm2、1.3 W/cm2、2.0 W/cm2強度用于后續(xù)實驗。

表1 超聲處理1 min后SMMC-7721孵育6 h 存活率

注：細胞存活率以對照組為100%計算.*P<0.05，**P<0.01與對照組相比；n=5

2.2 LIPUS對SMMC-7721細胞凋亡率和壞死率的影響 流式細胞術(shù)檢測(圖1)顯示：預(yù)處理1 min后孵育6 h，對照組僅有0.24% annexin V-FITC陽性細胞(凋亡細胞)，0.5、1.3 、2.0 W/cm2組細胞凋亡率分別為4.66%、8.99%、32.41%，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。對照組未見PI陽性細胞(壞死細胞)，0.5、1.3 、2.0 W/cm2組細胞壞死率分別為0.3%、0.8%、1.8% 。

圖1 流式細胞術(shù)檢測超聲處理1 min后孵育6 h細胞凋亡率和壞死率

3 討 論

超聲治療作為康復(fù)醫(yī)學(xué)的一個重要治療手段，在骨關(guān)節(jié)疾病、疼痛的治療方面發(fā)揮了巨大作用。近年來，國內(nèi)外將LIPUS用于腫瘤細胞體外實驗，取得可喜進展[8,10-11]。LIPUS具有多方面的生物學(xué)效應(yīng)，包括空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)[12]。在超聲作用下，介質(zhì)中產(chǎn)生自由基及過氧化物質(zhì)，同時超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力降低，從而誘導(dǎo)酶失活和脂質(zhì)體解聚、氧自由基的清除減少，最終殺傷細胞[5,13]。此外，超聲在傳播過程中能使介質(zhì)點進入振動狀態(tài)，導(dǎo)致細胞膜透化、細胞間連接破壞，促進腫瘤細胞DNA損傷[14]、改變骨架基礎(chǔ)蛋白[15]，促進細胞凋亡。有學(xué)者認為，超聲波在介質(zhì)內(nèi)傳播的過程中，其能量不斷被吸收而使介質(zhì)溫度升高，產(chǎn)生熱效應(yīng)，而當(dāng)超聲能量被組織吸收轉(zhuǎn)為熱量而溫度升高時，正常組織可通過血流循環(huán)而散熱，癌變組織則因血流少、散熱差，溫度易超出周圍組織5～9 ℃[16]?；谝陨侠碚?，LIPUS被廣泛用于腫瘤研究。LIPUS單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用微泡劑產(chǎn)生的空化泡載體，不僅能增加細胞膜的通透性，同時能增加化療藥物在局部的濃度并增加靶細胞的敏感性，促進基因?qū)牒捅磉_[17]。

本研究將不同強度的超聲作用于SMMC-7721細胞，檢測其對細胞的增殖活性。結(jié)果顯示，經(jīng)0.5 W/cm2及以上強度的LIPUS處理后，細胞的存活率明顯下降，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明LIPUS能夠抑制SMM-7721細胞的增殖活性。而0.3 W/cm2組細胞存活率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Feril等[8]用LIPUS誘導(dǎo)U937(人組織細胞淋巴瘤細胞株)時發(fā)現(xiàn)，自由基(·OH)僅在0.3 W/cm2以上強度超聲處理細胞時才可被檢測到；氧化應(yīng)激指示劑血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)在0.3 W/cm2強度超聲下也無明顯變化，當(dāng)處理強度達到0.4 W/cm2時，HO-1表達迅速上調(diào)至對照組的12倍，這與本研究結(jié)果相一致。本研究中MTT結(jié)果顯示，LIPUS組隨著超聲作用強度增大，SMMC-7721細胞存活率逐漸下降，呈一定的強度依賴性。

目前國內(nèi)外超聲輻照腫瘤細胞的強度為0.05～5.12 W/cm2，對于LIPUS的界定并無明確的范圍，國外一般以超聲功率小于3或5 W/cm2作為低強度標準[18]，國內(nèi)目前一般要求不超過2 W/cm2[19]。本研究采用的BTL-5720型超聲治療儀治療強度范圍為0～3 W/cm2，而臨床多采用在0.3～1.3 W/cm2。因此，本研究將0.5、1.3、2.0 W/cm2作為處理強度用于凋亡檢測及后續(xù)研究。本研究顯示，對照組細胞凋亡率為0.24%，LIPUS組隨超聲強度的增大，SMMC-7721的凋亡率逐漸升高。 LIPUS能誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡，同時致細胞壞死率較低。細胞凋亡在腫瘤形成的不同階段均具有十分重要的作用，而壞死則可引起局部炎癥反應(yīng)，因此誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并減少壞死是抗癌的重要思路。

綜上所述，LIPUS能抑制肝腫瘤細胞系SMMC-7721細胞的增殖活性，誘導(dǎo)其凋亡，其效應(yīng)呈強度依賴性。LIPUS有定位準確、組織穿透力強、簡便易行的特點，易被患者接受，成為研究腫瘤治療的一個新方向。目前研究主要針對LIPUS單獨或聯(lián)合其他治療方法作用于腫瘤細胞的效應(yīng)，而尚未揭示其抑制癌細胞活性、促進腫瘤細胞凋亡的分子生物學(xué)機制。若能從分子水平揭示LIPUS選擇性的促進腫瘤細胞凋亡而不影響正常細胞的活性，以及同其他治療方法協(xié)同作用的機制，則將為臨床靶向治療腫瘤提供更多的理論依據(jù)。