針吸細胞學聯(lián)合qPCR技術(shù)診斷肺外結(jié)核病的價值

王 莉， 郝穎華， 劉 平， 陳修文， 湯顯斌

十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)病理科，十堰 442000

目前，結(jié)核病仍然是嚴重威脅人類健康的傳染病。2016年WHO發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，僅2015年，全球范圍內(nèi)就有1 000多萬的新發(fā)結(jié)核病患者，180萬人死于結(jié)核[1]。結(jié)核病的病原菌為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)[2]。最常見的感染部位是肺，而發(fā)生在肺外的結(jié)核感染更為隱匿，易漏診[3]。

患者因須明確病變性質(zhì)到病理科行細胞學檢查，其中相當一部分為可疑肺外結(jié)核病。本科采用針吸細胞學(fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC)聯(lián)合實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR)做出診斷與鑒別，效果滿意，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇湖北省十堰市太和醫(yī)院2016年4月至2018年12月經(jīng)FNAC涂片顯示為可疑結(jié)核病感染或需排除結(jié)核病感染的患者57例。其中，男性28例、女性29例，年齡15～77歲，中位年齡39歲。樣本來源于表淺可觸及體表囊腫的穿刺液，其中淋巴結(jié)46例，關(guān)節(jié)腔2例，泌尿生殖系統(tǒng)4例，胸腹壁5例。

1.2 FNAC檢查 常規(guī)局部消毒，用左手拇指及示指固定穿刺部位，右手持10 mL一次性塑料注射器(7號針頭)前后左右多方向穿刺取材。將部分穿刺液均勻涂抹于載玻片上，95%乙醇固定，蘇木精-伊紅(H-E)染色，在BX51生物顯微鏡(奧林巴斯)下觀察。其余穿刺液預(yù)留，用于qPCR檢測。

1.3 提取DNA 在穿刺液中加入2～3倍體積的4%NaOH溶液，37℃水浴0.5～1 h，至完全液化。16 000×g離心10 min，棄上清，加入1 mL 0.9%氯化鈉液并一起移入1.5 mL離心管中。16 000 ×g離心10 min，棄上清，根據(jù)沉淀量加入30～50 μL DNA提取液，吹打混勻，37℃水浴30 min，再100℃干浴10 min，16 000 ×g離心10 min，取上清檢測DNA。

1.4 qPCR檢測 熒光定量PCR儀購自ABI公司(ABI7500)；結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自qiagen公司。qPCR反應(yīng)總體系為40 μL，包括反應(yīng)液37.8 μL、Taq酶0.2 μL、UNG 0.06 μL及待測DNA樣本2 μL。設(shè)陰性對照、強陽性對照和臨界陽性對照。PCR反應(yīng)條件：37℃去除污染5 min；94℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s、60℃退火加延伸30 s，共40個循環(huán)。實驗結(jié)果按照說明書進行判讀。

2 結(jié) 果

2.1 臨床診斷結(jié)果 57例可能感染或需排除感染結(jié)核分枝桿菌的患者中，判斷傾向結(jié)核者43例，傾向其他但需排除結(jié)核者14例。57例中有臨床確診結(jié)果者23例，其中結(jié)核分枝桿菌陽性16例、陰性7例(表1)。

表1 樣本檢測結(jié)果比較

2.2 FNAC初篩結(jié)果 57例樣本中，F(xiàn)NAC檢測為結(jié)核陽性43例、陰性14例，診斷符合率為82.61%(19/23)；假陰性3例、假陽性1例(表1、圖1)。

2.3 qPCR檢測結(jié)果 57例樣本中，qPCR檢測為結(jié)核分枝桿菌陽性42例、陰性15例，診斷符合率為86.96%(20/23)；假陰性2例、假陽性1例(表1、圖2)。

圖1 組織結(jié)核分枝桿菌FNAC檢查結(jié)果(H-E染色)

A：陽性，可見壞死；B：陽性，可見朗漢斯巨細胞；C：陰性，僅見大量淋巴細胞. Original magnifications: ×10(A、B), ×20(C)

圖2 結(jié)核分枝桿菌qPCR典型檢測結(jié)果

2.4 FNAC與qPCR聯(lián)合診斷結(jié)果 有臨床確診結(jié)果的23例患者中，F(xiàn)NAC聯(lián)合qPCR檢測為結(jié)核陽性16例、陰性7例，診斷符合率為92.98%(22/23)；假陽性1例(表1)。

3 討 論

肺外結(jié)核病指發(fā)生在肺以外的結(jié)核病，發(fā)生率占結(jié)核病的12.0%～28.5%[4]。肺外結(jié)核病的臨床表現(xiàn)多不典型，診斷有一定困難。傳統(tǒng)的檢測方法，如痰涂片找抗酸桿菌、抗酸染色等陽性率低，且結(jié)核桿菌培養(yǎng)法周期很長，難以滿足臨床需要[5]。

與其他檢測方法相比，F(xiàn)NAC具有檢測快速、創(chuàng)傷小、費用低、特異性高和敏感性高的優(yōu)點。Saatian等的研究[6]中，100例頸部包塊的FNAC檢測結(jié)果與組織病理檢測的符合率可達79%。本研究中，F(xiàn)NAC的陽性預(yù)測值為92.86%(13/14)，陰性預(yù)測值為66.67%(6/9)，診斷符合率為82.61%(19/23)，與上述研究相似。結(jié)核病的細胞學表現(xiàn)多為均勻粉染的徹底性壞死，可見類上皮細胞或郎漢斯巨細胞[7]。但結(jié)核病有時與其他類上皮細胞肉芽腫難以鑒別，如真菌感染、結(jié)節(jié)病等；也可能與某些化膿性感染難以區(qū)分，如有液化壞死或混合感染時，也可見膿細胞和壞死物[8]。因此，診斷結(jié)核病時，需將FNAC與其他檢測方法聯(lián)合應(yīng)用。

qPCR可特異性地擴增模板DNA上的一段序列，并通過熒光標記的探針實時記錄擴增產(chǎn)物的量，具有操作簡便、敏感、特異的優(yōu)點。目前，qPCR法已廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織樣本中結(jié)核桿菌核酸的檢測[9-10]，效果較好，但在穿刺液中的應(yīng)用還鮮有報道。本研究采用的qPCR試劑盒包含dUTP-UNG酶防污染系統(tǒng)，可有效降低假陽性。在有臨床確診結(jié)果的23例患者中，qPCR的陽性預(yù)測值為93.33%(14/15)，陰性預(yù)測值為75%(6/8)，與臨床診斷的符合率達86.96%(20/23)，本研究中qPCR對結(jié)核分枝桿菌感染的檢測率較高除了與其準確率較高有關(guān)外，還與前期FNAC篩選及例數(shù)較少有一定關(guān)系。為避免漏診，建議對所有FNAC涂片鏡檢時發(fā)現(xiàn)有類上皮細胞，伴或不伴壞死的樣本行qPCR檢測。

綜上所述，F(xiàn)NAC是診斷肺外結(jié)核病，尤其是有體表囊腫的肺外結(jié)核病的首選手段，可在減輕患者痛苦的基礎(chǔ)上減少漏診。將FNAC和qPCR法聯(lián)合用于肺外結(jié)核病，可提高診斷準確率。