甲亢患者鋅指蛋白A20 表達(dá)意義的探討

魏潔瓊，樊勇，萬尖尖，尚豐

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊)

0 引言

甲狀腺功能亢進癥，簡稱甲亢，系指由多種原因?qū)е碌募谞钕偌に禺a(chǎn)生和分泌過多，引起的神經(jīng)、循環(huán)、消化等多個系統(tǒng)興奮性增高和代謝亢進為主要表現(xiàn)的一種臨床綜合征。臨床以Graves病最常見，約占所有甲亢患者的85%。此文主要研究甲亢Graves病患者，多見于成年女性，男女比為1：4～1：6，以20-40 歲女性多見。Graves 病發(fā)病與自身免疫有關(guān)，屬于器官特異性自身免疫性疾病。其中引起甲狀腺功能亢進最重要的抗體是促甲狀腺素受體抗體(TRAb)，也稱TSH 結(jié)合抑制性免疫球蛋白[1]。A20，也稱為TNFAIP3(TNF α 誘導(dǎo)蛋白3)，參與對NF-κB 活化的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。泛素編輯和NF-κB 抑制蛋白A20 的抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[2]。研究表明，A20 表達(dá)與多種炎癥及自身免疫性疾病有關(guān)。對A20 表達(dá)和/或功能研究對新的治療策略研究近年來成為熱點，而同樣作為自身免疫性疾病的甲亢，國內(nèi)外文獻對A20 在甲亢發(fā)生發(fā)展的研究甚少。本實驗采用實時熒光定量 PCR，通過檢測30 例初發(fā)甲亢與30 例健康體檢者外周血鋅指蛋白A20 的表達(dá)，探討A20與甲亢的發(fā)生發(fā)展關(guān)系。以及A20 與TRAb 之間相關(guān)聯(lián)系，為進一步研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 對象

選擇2018 年10 月至2019 年5 月在我院內(nèi)分泌科就診確診Graves 病患者30 例，均符合2008 年《中國甲狀腺疾病診治指南》。30 例中，男5 例，女25 例，平均(38.3±9.96)歲，年齡范圍在：20～60 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 已使用過抗甲狀腺藥物、131I 及手術(shù)治療病人；(2)使用免疫抑制劑、生物制劑、糖皮質(zhì)激素類藥物等；(3)合并心、肝、腎及腦血管疾病，自身免疫性疾病及惡性腫瘤等。(4)近期有手術(shù)，感染、創(chuàng)傷及感染等應(yīng)激情況，或處于妊娠期、哺乳期。采集同期我院健康體檢患者30 例作為對照組，男7 例，女23例，平均(40.20±12.27) 歲，年齡范圍在：20～67 歲。本研究方法患者或家屬知情并自愿參與。

1.2 研究方法

1.2.1 PBMCs 的提取抽取

將研究對象的空腹外周靜脈血3mL，加入相同體積的PBS，充分混合、稀釋血細(xì)胞。添加6mL 淋巴細(xì)胞分離液，室溫下，1500rpm 水平離心20 分鐘。離心后將第二層單個核細(xì)胞小心吸出加入到另一個離心管中。加入PBS 洗滌2 次。

1.2.2 Trizol 法提取PBMCs 中的RNA

向提取的PBMCs 中加入lmL Trizol 試劑，靜置10min。加氯仿200uL 劇烈震蕩15s，冰上放置10min。在4℃，12000rpm，離心15min，吸取三層里面最上層無色水相500uL 至新EP 管。加入500uL 異丙嗪混勻，室溫靜置10min，在4℃，12000rpm，離心10min。離心后在EP 管底的白色物質(zhì)為RNA 沉淀。去上清液，將1mL 80% 乙醇加入EP 管，洗滌沉淀。室溫下，7500rpm，離心3min。去上清，靜置3min。向EP 管中添加30uL DEPC 水溶解，反復(fù)吹打。取少量己溶解好的RNA，使用蛋白核酸測定儀來測定提吸光度，計算OD260/OD280 評估純度。選用OD260/OD280 處于1.8-2.0，說明RNA 樣品純度好的標(biāo)本。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

超凈臺內(nèi)，將RNase Free 的PCR 管置于冰上，依次加入引物(Primer Oligo)1uL，5×Reaction buffer( 反 應(yīng) 液)4uL，RNAase inhibitor(RNA 酶抑制劑)1 uL，10mm dNTP mix(10mm dNTP 混合液)2uL，RTase(RT 酶)1uL，RNA lug(V1=1/RNA 濃度)，無核酶水V2(V2=11-V1)。將加好樣的PCR 管置于漩渦振蕩器，離心備用。隨后將PCR 管置于PCR 儀里，按預(yù)設(shè)程序進行：42 ℃，60min，70℃5min，4℃保存。所得產(chǎn)物即為cDNA。

1.2.4 引物設(shè)計參考己發(fā)表過的文獻，實時熒光定量引物序列(5’-3’)：TNFAIP3F：CTGCTGGCTGCCTGTCTCAAG；T N F A I P 3 R：G T T C T G G A A C C T G G A C G C T G T G；H-bactin-F：TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG；H-b-actin-R：TCACCTTCACCGTTCCAGTTT。SYBR Green I 嵌合熒光法進行Real Time PCR，選用25uL 反應(yīng)體系。按以下反應(yīng)條件PCR 擴增：預(yù)變性95℃ 3min，PCR 95℃ 5s，40 個循環(huán)，退火/ 延伸60℃ 15s。結(jié)果以β-actin 作為內(nèi)參計算目的基因mRNA，選用2-△△CT法對計算目的基因mRNA 實時熒光定量PCR 相對表達(dá)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，符合正態(tài)分布計量資料以表示，方差齊時采用獨立樣本t 檢驗。計數(shù)資料選列聯(lián)表檢驗。對兩參數(shù)相關(guān)性研究，采用Pearson 相關(guān)性分析比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象基本參數(shù)比較

甲亢組與健康體檢組的基礎(chǔ)資料，在年齡和性別之間無統(tǒng)計學(xué)差異，分別為：年齡(t=-0.659，P=0.513＞0.05)，性別(=0.417，P=0.519＞0.05)可對試驗數(shù)據(jù)進一步比較。見表1。

2.2 兩組間周血 PBMC 中鋅指蛋白 A20mRNA 水平比較

方差齊性滿足，采用兩獨立樣本t 檢驗：結(jié)果顯示健康體檢組中鋅指蛋白 A20mRNA 表達(dá)水平(1.20±0.35)比甲亢組外周血 PBMC 中鋅指蛋白 A20mRNA 表達(dá)水平(0.63±0.37) 明顯升高，t=-6.186，P=0.000，遠(yuǎn)小于0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 研究對象臨床資料及實驗室檢測結(jié)果

2.3 甲亢組中相關(guān)性指標(biāo)比較

采用Pearson 相關(guān)性分析比較鋅指蛋白A20mRNA 表達(dá)水平與其TRAb 關(guān)系，結(jié)果表明，甲亢組中外周血PBMC 中鋅指蛋白A20mRNA 表達(dá)水平與其TRAb 水平在統(tǒng)計學(xué)無明顯線性相關(guān)(r=-0.292，P=0.117)。

3 討論

Graves 病屬于自身免疫性甲狀腺疾病(AITD) 最主要的一種，除此之外還包括慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎和產(chǎn)后甲狀腺炎。AITD 的確切發(fā)病機制仍不清楚。有研究表明，它是B 細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性內(nèi)分泌自身免疫性疾病的一種，是由免疫耐受性喪失和對甲狀腺組織的自身免疫攻擊引起的[3]。越來越多的研究指出AITD 是一種多基因疾病，是各種易感基因和環(huán)境因素相互作用，共同影響著甲狀腺的細(xì)胞和體液的免疫反應(yīng)[4,5]。

A20 是TNFAIP3 基因最重要的抗炎作用編碼蛋白，是由790個氨基酸殘基組成的泛素修飾酶其結(jié)構(gòu)包含一個N 端卵巢腫瘤(OTU) 去泛素化酶(DUB) 域和七個C 端ZnF 基序。特殊結(jié)構(gòu)可限制多個細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)。觸發(fā)免疫細(xì)胞活化的最佳表征分子途徑是經(jīng)典的核因子-κB(NF-κB) 信號傳導(dǎo)途徑，該途徑導(dǎo)致眾多促炎性基因和細(xì)胞存活基因的轉(zhuǎn)錄。包括TNF，IL-1，LPS，T 細(xì)胞和B 細(xì)胞受體抗原等[2]。NF-κB 信號級聯(lián)受到泛素化的顯性調(diào)節(jié)，該過程可產(chǎn)生一系列翻譯后修飾，將蛋白質(zhì)導(dǎo)向不同的生物命運[6]。泛素修飾酶A20 已成為一種強大且異常復(fù)雜的泛素依賴性信號調(diào)節(jié)劑。A20 受到NF-κB 依賴性信號的誘導(dǎo)，進而限制了NF-κB 途徑中幾種分子的信號傳導(dǎo)的持續(xù)時間和強度[7]。

與健康組織相比，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[8]，強直性脊柱炎[9]，Behcet 病，成人Stills 病，炎癥性腸病以及牛皮癬等疾病中，外周血單個核細(xì)胞(PBMC) 的TNFAIP3mRNA 表達(dá)降低[10,11]。這一點在小鼠TNFAIP3 特異性表型模型上表明，A20 表達(dá)降低或缺失也可引起小鼠自發(fā)性炎癥和自身免疫性疾病。這種相關(guān)性表明增加A20 的表達(dá)和/或功能有可能是一種有前途的治療策略有利于患者獲得個體化治療[8]。

本研究結(jié)果表明，與健康健康者比較，甲亢患者組外周血PBMC 中鋅指蛋白A20mRNA 表達(dá)水平量低，這與以往在炎癥及其他自身炎癥疾病中實驗研究結(jié)論一致。可能表明低水平的A20，負(fù)反饋使核因子κB 通路活性增加。甲亢組患者A20mRNA表達(dá)水平與其甲狀腺自身抗體TRAb 水平呈負(fù)相關(guān)，但此研究因樣本量原因，無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究表明TNFAIP3 基因可能是GD 的遺傳易感性因子[5]。與本研究結(jié)論在蛋白表達(dá)一致，說明A20 的低水平表達(dá)可能與甲亢發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，A20 基因可能在甲亢Graves 病患者免疫應(yīng)答中起到重要作用。A20 與TRAb 有相關(guān)性，表達(dá)減少或降低參與了甲亢的發(fā)生發(fā)展。A20mRNA 的水平可能是甲亢患者預(yù)后的潛在預(yù)測指標(biāo)及潛在治療靶點。為進一步研究提供基礎(chǔ)資料。由于本研究樣本量較少，對TRAb 與A20 相關(guān)性研究，未達(dá)到預(yù)期結(jié)果，具有局限性。未對患者進一步炎癥因子，基因多樣性方面進行深入研究，具體機制尚有待進一步探討。進一步深入研究，可能為以后甲亢患者增加個體化治療方面獲益。