三黃雞卵黃性腹膜炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

曹 剛 陳林文 張文波 李 歡 高 蕊 周亞南 戚 偉 朱芝秀

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌330045

卵黃性腹膜炎是產(chǎn)蛋雞的一種常見疾病，其危害性呈現(xiàn)越來越嚴(yán)重的趨勢[1-3]。因長期濫用同種抗生素，造成了細(xì)菌的普遍耐藥性[4-5]，尋找高敏藥物交叉使用迫在眉睫[6]。2019年12月中旬，九江某養(yǎng)雞場8 000 只蛋雞產(chǎn)蛋率下降20%。采集死亡雞的肝臟和液化的卵黃，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，旨在找到高敏藥物防治該病。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗(yàn)動物。病死雞：江西九江某養(yǎng)雞場；試驗(yàn)小白鼠：（20 g 左右）購自南昌大學(xué)動物試驗(yàn)中心。

2）藥品及試劑。麥康凱培養(yǎng)基、ss 瓊脂培養(yǎng)基、ss 瓊脂斜面、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏染色試劑、藥敏試紙、微量發(fā)酵管：購自杭州天和微生物有限公司。

3）主要儀器。電熱恒溫培養(yǎng)箱：購自上海躍進(jìn)科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡：購自重慶光學(xué)儀器廠；電熱壓力蒸汽滅菌器：購自上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺：購自蘇凈集團(tuán)安泰公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1）病理解剖。將死亡雞進(jìn)行病理解剖，觀察各器官的病理變化并取樣。

2）病原菌的分離培養(yǎng)。將死亡雞肝臟、卵黃無菌操作，分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、ss 瓊脂培養(yǎng)基及ss 瓊脂斜面，觀察記錄菌落形態(tài)變化，挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢并進(jìn)行純培養(yǎng)。

3）分離菌的生化特性。將分離菌接種于葡萄糖、靛基質(zhì)、硫化氫等微量生化反應(yīng)管中，置滅菌平皿內(nèi)37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察記錄細(xì)菌的生長特性及指示劑的變化，操作方法按照微量生化反應(yīng)管說明書進(jìn)行。

4）分離菌的藥敏試驗(yàn)。按照紙片法[7]，用無菌棉簽均勻涂抹分離菌于普通瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基水分完全吸收后，按梅花狀貼藥敏試紙，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，測量其抑菌圈直徑。

5）分離菌致病性試驗(yàn)。將性狀一致的小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組（5 只/組），試驗(yàn)組分別腹腔注射分離菌培養(yǎng)液（0.5 mL/只），對照組腹腔注射0.85%生理鹽水（0.5 mL/只），觀察小白鼠的發(fā)病情況，將死亡小鼠剖檢分菌，染色鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖結(jié)果

肝臟點(diǎn)狀出血；心冠脂肪出血；卵泡破裂和液化。

2.2 分離菌培養(yǎng)特性

得到L-d-1、L-d-2、L-d-3、L-s-1 和L-s-2共5 株分離菌。麥康凱培養(yǎng)基：L-d-1、L-d-2 和Ld-3 呈紅色不透明（圖1），L-s-1 和L-s-2 呈無色透明（圖2）；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：L-d-1、L-d-2 和L-d-3呈金屬光澤（圖3），L-s-1 和L-s-2 為無色透明（圖4）；ss 培養(yǎng)基：L-d-1、L-d-2 和L-d-3 呈粉紅色（圖5），L-s-1 和L-s-2 呈黑色單個菌落（圖6）；三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基：L-d-1、L-d-2 和L-d-3 斜面呈黃色（圖7），L-s-1 和L-s-2 斜面變黃，穿刺處出現(xiàn)黑色沉淀，試管底部有氣泡（圖8）。5 株分離菌革蘭氏染色鏡檢，均為G-短桿菌，兩端鈍圓，散在或成對出現(xiàn)（圖9）。

2.3 分離菌生化特性

1）糖發(fā)酵試驗(yàn)：L-s-1 和L-s-2 不發(fā)酵乳糖及蔗糖，L-d-1、L-d-2 和L-d-3 發(fā)酵大部分糖類。

2）硫化氫試驗(yàn)：L-s-1 和L-s-2 產(chǎn)生黑色沉淀，L-d-1、L-d-2 和L-d-3 沒有變化。

3）枸櫞酸鹽試驗(yàn)：L-s-1 和L-s-2 由綠變藍(lán)色，L-d-1、L-d-2 和L-d-3 沒有變化（表1）。

2.4 分離菌藥敏試驗(yàn)

分離菌對青霉素類、四環(huán)素類等藥物產(chǎn)生耐藥，對氨基糖苷類、頭孢菌素類等藥物敏感（表2）。

2.5 分離菌致病性試驗(yàn)

死亡小鼠沒有明顯外傷，觸摸無硬塊。對其由腹部向頸部進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)有腹水；對病死鼠取樣分菌，分離到原病原菌（表3）。

3 討 論

3.1 分離菌的種屬

圖1 紅色不透明菌落

圖2 麥康凱透明菌落

圖3 金屬光澤

圖4 伊紅美藍(lán)透明菌落

圖5 粉紅色菌落

圖6 黑色單個菌落

圖7 黃色斜面

圖8 產(chǎn)生黑色沉淀

圖9 G-短桿菌

根據(jù)臨床解剖特征、分離菌培養(yǎng)和生化特性，比對《伯杰氏細(xì)菌分離鑒定手冊》[8]，得知L-s-1 和L-s-2 生化特性與沙門氏菌一致，確定為沙門氏菌；L-d-1、L-d-2、L-d-3 生化特性與大腸桿菌一致，確定為大腸桿菌；大腸桿菌與沙門氏菌混合感染引起卵黃性腹膜炎。

3.2 分離菌的生化特性

L-s-1、L-s-2 的生化特性與武志強(qiáng)[9]、黃世娟等[10]報(bào)道中的糖類、蛋白胨水、枸櫞酸鹽等生化試驗(yàn)結(jié)果均一致，而在硫化氫、尿素的結(jié)果上存在差異，可能是菌株不同造成；L-d-1、L-d-2、L-d-3 生化鑒定結(jié)果與李娟娟等[11]試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.3 分離菌的耐藥性

分離菌的耐藥性與林安等[12]報(bào)道中的頭孢唑啉、慶大霉素等的試驗(yàn)結(jié)果一致，與阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素等的試驗(yàn)結(jié)果存在差異。這可能由于用藥習(xí)慣、地域差異導(dǎo)致。

表1 病原菌生化特性

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

表3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌對多種藥物產(chǎn)生耐藥，因此必須在藥敏試驗(yàn)后對癥治療，避免盲目治療加重?fù)p失[13]。在實(shí)際治療中，要選擇合理的給藥方式，輪換或交替使用不同的高敏藥物[14]，而乳酸菌、枯草芽孢桿菌等益生菌作為抗生素的替代品越來越受到重視[15]，可輔助治療，防止病原菌過快產(chǎn)生耐藥性。

3.4 分離菌的致病性

動物試驗(yàn)結(jié)果說明，大腸桿菌致病性大于沙門氏菌，單一的沙門氏菌致病性弱，只有與大腸桿菌混合感染才引發(fā)卵黃性腹膜炎，導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降。

3.5 分離菌的防治

平時要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做到舍內(nèi)徹底消毒，改善飼養(yǎng)環(huán)境，定期用藥物預(yù)防。飼料中添加適量維生素，提高雞的抗病能力[16-17]，做到及時發(fā)現(xiàn)問題，尋找解決方案，避免進(jìn)一步擴(kuò)大損失。