骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-生物蛋白膠在關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)中的作用研究

余杰鋒，鄺立鵬，張 煒，姚澤明 [遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東 珠海 519100]

最近幾年，新研發(fā)的軟骨組織工程技術(shù)，對于軟骨兔關(guān)節(jié)細(xì)胞的缺損修復(fù)有了新的方案與想法，對于當(dāng)前這種技術(shù)成為軟骨缺損修復(fù)的重點(diǎn)研究對象，軟骨缺損后重新生成可能變成一種現(xiàn)實(shí)[1]。本研究擬通過兔自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)與自體提取生物蛋白膠復(fù)合后是否可以使兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損部分有效恢復(fù)，并觀察其遠(yuǎn)期的修復(fù)效果,這可能會使得修復(fù)軟骨組織細(xì)胞的來源變得更加方便，尋找合理的實(shí)驗(yàn)支架材料，并為軟骨組織工程技術(shù)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象：飼養(yǎng)材料與動物的選取：飼養(yǎng)48只普通級別的雌性或者雄性新西蘭兔，體重為1.4～1.5 kg,飼養(yǎng)時的溫度維持在25℃左右，保持濕度約為60%，能夠讓它們自由的活動與飲食，每只兔子都單獨(dú)在一個籠子里飼養(yǎng)，定時進(jìn)行殺菌和更換飼料水，清理完它們的排泄物，保持好飼養(yǎng)籠子的干燥。清潔對兔子的飼養(yǎng)以及所有的實(shí)驗(yàn)操作，受到了國家動物管理局的認(rèn)可，同時也并不違反倫理[2]。廣東省的一家動物實(shí)驗(yàn)中心配置了對實(shí)驗(yàn)兔子的常規(guī)飼養(yǎng)食物。

1.2方法

1.2.1BMSCs 提取、 純化和鑒定：用合理科學(xué)的方法將兔BMSCs分離出來，依據(jù)細(xì)胞形狀的改變情況和查看細(xì)胞表面的物質(zhì)進(jìn)行鑒定。對于體外培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行同樣的觀察與檢測，觀察其成軟骨、成骨、成脂的分化能力。

1.2.2兔自體血液的獲取及生物蛋白膠的制備：抽取兔動脈血后送第三方生物制劑公司進(jìn)行蛋白膠提取。

1.2.3兔BMSCs與蛋白膠復(fù)合的培養(yǎng)及觀察。

1.2.4兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損動物模型的分組:按隨機(jī)分配原則將飼養(yǎng)的48只新西蘭兔均分為4個小組,每組12只,每組有24個膝關(guān)節(jié)樣本,分別進(jìn)行4種不同的處理:1組將軟骨切除后再原位進(jìn)行回植;2組將BMSCs與關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合物修復(fù)軟骨缺損;3組單純用脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)修復(fù)缺損;4組為軟骨部分缺損處不做任何處理。以上各組動物按照嚴(yán)格無菌原則操作,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后3 d再用青霉素注射，避免被細(xì)菌感染,周期性的處理實(shí)驗(yàn)切口。

1.3術(shù)后觀察指標(biāo)

1.3.1術(shù)后觀察兔子的基本生活情況:每天檢查實(shí)驗(yàn)后兔子的走路情況、精神變化、身體姿勢、傷口恢復(fù)情況、飲食情況、走動情況[3-4]。

1.3.2大體標(biāo)本觀察:在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后的4周、8周、12周內(nèi)在每一小組中減少4只兔子。大體查看兔子包括關(guān)節(jié)面在內(nèi)的左股骨遠(yuǎn)段。用眼睛看軟骨缺損修復(fù)變化情況,包括軟骨缺損修復(fù)程度，修復(fù)組織是否是透明軟骨及其色澤，與周邊組織及軟骨下骨的整合度，有無裂縫及硬化，有無骨贅形成及滑膜反應(yīng)等并拍照。根據(jù)改良的Pineda法評分標(biāo)準(zhǔn)評分[5]。

1.3.3標(biāo)本組織學(xué)檢測：常規(guī)HE染色觀察修復(fù)組織的一般情況，用甲苯胺藍(lán)測來檢測糖胺多糖,用Ⅱ型膠原免疫組化染色來檢測Ⅱ型膠原。

1.3.4術(shù)后每天對其雙側(cè)膝關(guān)節(jié)活動度進(jìn)行對比測定。

2 結(jié)果

2.1各組術(shù)后觀察指標(biāo)情況：術(shù)后4周,1組原位回植軟骨基本存活,2組中軟骨缺損修復(fù)大體已經(jīng)完成,3組和4組能看到軟骨還有一些凹凸;2組軟骨修復(fù)后顯現(xiàn)黃色，且顏色很淺，HE染色可以看到一點(diǎn)幼稚軟骨細(xì)胞,且細(xì)胞排列很亂,周圍未見典型的陷窩樣結(jié)構(gòu),可以看到少許基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)后8周,3組軟骨細(xì)胞修復(fù)基本完成,4組還見小凹陷。2組缺損處修復(fù)組織較前增多,顏色呈淡黃色,表面較4周時光滑,彈性充足,與旁邊的軟骨組織分界仍舊存在。實(shí)驗(yàn)12周后1組缺損恢復(fù)效果達(dá)到與正常一樣,2組缺損恢復(fù)過程中出現(xiàn)了顏色變化,與正常軟骨組織的質(zhì)地表現(xiàn)一樣,HE染色后的軟骨細(xì)胞,有著異常的排列方式，軟骨表面有凹陷。3組、4組缺損區(qū)基本上都被纖維細(xì)胞所圍住,顏色呈現(xiàn)深灰白色,很軟的質(zhì)地,與旁邊的正常軟骨細(xì)胞有著清晰的邊界。

2.2各組各時間點(diǎn)組織切片Wakitani評分:定時通過Wakitani 評分表對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行組織學(xué)評分,1組、2組在每個時間的修復(fù)效果都比3組、4組更好,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表示其恢復(fù)效果差別很大;3組、4組這兩個小組對相同實(shí)驗(yàn)時間的兔子軟骨組織恢復(fù)效果進(jìn)行分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組在不同的時間內(nèi)與其他組的分析比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

組別時間 細(xì)胞形態(tài) 與周圍結(jié)合軟骨厚度基質(zhì)染色 總分 1組第28天1.1±0.81.3±0.11.0±0.11.3±0.36.1±1.4第56天0.8±0.10.5±0.10.4±0.80.6±0.63.4±0.4第84天0.3±0.30.6±0.30.3±0.50.3±0.31.1±1.72組第28天1.3±0.11.3±0.11.5±0.11.4±0.45.0±1.5第56天0.7±0.40.6±0.20.7±0.40.5±0.03.1±0.3第84天0.2±0.50.3±0.50.5±0.10.4±0.31.4±1.03組第28天2.1±0.31.3±0.41.6±0.41.9±0.58.0±1.9第56天1.7±0.51.1±0.11.3±0.11.7±0.65.1±0.7第84天1.3±0.60.8±0.61.4±0.01.1±0.73.2±1.84組第28天3.1±0.42.5±0.32.3±0.42.8±0.311±1.1第56天2.3±0.81.7±0.11.9±0.12.5±0.113.7±0.4第84天2.1±0.41.3±0.41.9±0.32.1±0.48.7±1.8

注：每組各時間點(diǎn)關(guān)節(jié)數(shù)量均為8個

3 討論

軟骨組織缺損是一種有著較高病發(fā)率的骨科疾病[6]。關(guān)節(jié)軟骨缺損分為兩種類別，分別是部分缺損和全層缺損[7]。關(guān)節(jié)軟骨部分缺損對下骨組織不會產(chǎn)生影響。本次研究對BMSCs進(jìn)行分析，研究復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)在修補(bǔ)兔關(guān)節(jié)軟骨部中的原理和作用機(jī)制,結(jié)果顯示可以生產(chǎn)軟骨樣組織修復(fù)缺損部位。而單獨(dú)應(yīng)用脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)修復(fù)缺損部位生成的為纖維組織。軟骨細(xì)胞在體內(nèi)可以由BMSCs誘導(dǎo)形成。隨著關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究越來越深入,將會被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)。組織工程技術(shù)對骨損傷修復(fù)提出重要方案和思路。