圍產(chǎn)期李斯特菌感染6例的臨床及分子特征

賈忠蘭，葉長(zhǎng)蕓，許麗風(fēng)，王怡倩

李斯特菌為革蘭陽(yáng)性短桿菌，其中產(chǎn)單核細(xì) 胞李斯特菌（Listeri a monocytogenes）和伊氏李斯特菌（Li steria ivanovi i）具有致病性，能夠引起人類(lèi)和動(dòng)物李斯特菌感染。作為重要的食源性致病菌，產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌在全球范圍內(nèi)得到廣泛關(guān)注和深入研究。李斯特菌感染的發(fā)病率較其他食源性疾病低，但其病死率高[1]。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌可穿過(guò)宿主的腸道屏障、血腦屏障、胎盤(pán)屏障，引起血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和局灶感染。該菌的清除依賴(lài)于細(xì)胞免疫，孕婦由于妊娠期激素水平升高導(dǎo)致細(xì)胞免疫水平下降，是主要的易感人群之一[2-3]。孕婦感染李斯特菌可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎死宮內(nèi)等不良后果；通過(guò)母嬰感染的新生兒可引發(fā)血流感染、腦膜炎甚至死亡。國(guó)內(nèi)以李斯特菌感染散發(fā)病例報(bào)道為主[4-5]，病原菌的分子流行病學(xué)特征分析較少。

根據(jù)基因序列分型、菌體抗原和鞭毛抗原，產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌可分為4個(gè)家系、12個(gè)血清型：家系Ⅰ（1/2b、3b、7、4b、4d和4e）、家系Ⅱ（1/2a、3a、1/2c和3c）、家系Ⅲ和Ⅳ（4a和4c）。家系Ⅰ菌株與暴發(fā)或者散發(fā)的李斯特菌感染具有相關(guān)性，家系Ⅱ菌株多從食品或者相關(guān)環(huán)境中分離，家系Ⅲ和Ⅳ菌株常分離自反芻動(dòng)物。1/2a、1/2b和4b血清型菌株是引起李斯特菌感染的常見(jiàn)菌型[6]，占臨床李斯特菌感染病例分離株的95%以上[7]。另外，李斯特菌感染的致病性與其毒力基因密切相關(guān)，具有毒力基因hl y（溶血素）、i nl A（內(nèi)化素A）、actA（肌動(dòng)蛋白）、pl c B（磷脂酶C）和prfA（PrfA蛋白）的李斯特菌可通過(guò)血腦屏障和胎盤(pán)屏障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例定義圍產(chǎn)期李斯特菌感染病例定義為患者在圍產(chǎn)期具有產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌感染的臨床癥狀，從患者的臨床標(biāo)本中能夠分離到產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌[8]。

1.1.2 菌株來(lái)源2012年1月－2017年12月從北京市海淀區(qū)婦幼保健院臨床標(biāo)本中分離的菌株，標(biāo)本類(lèi)型涉及孕產(chǎn)婦的宮腔拭子、胎盤(pán)拭子和羊水，新生兒的咽拭子、皮膚拭子、耳拭子、血液、腦脊液和糞便。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)分型通過(guò)多重PCR對(duì)菌株進(jìn)行血清學(xué)分類(lèi)[9]，并采用日本Denka Seiken公司的血清抗體試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清型鑒定。

1.2.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分析按照美國(guó)CDC PulseNet的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，選用限制性核酸內(nèi)切酶Asc I和A paI酶對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行酶切，PFGE圖像用BioNumerics（Version 5.0）軟件進(jìn)行比對(duì)和聚類(lèi)分析。

1.2.3 多位點(diǎn)序列分型（MLST）參照法國(guó)巴斯德研究所的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html）操作流程，對(duì)7個(gè)管家基因（abcZ、b lgA、cat、dapE、d a t、l d h、l h k A）PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)分析，獲得菌株的序列型（sequence type，ST）。

1.2.4 毒力基因檢測(cè)根據(jù)參考文獻(xiàn) [7]合成引物，對(duì)分離菌株進(jìn)行6個(gè)毒力基因（pl c B、act A、hly、iap、prfA、inlA）的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

2012年1月－2017年12月本院6例產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌感染病例（孕婦及其胎兒/新生兒定義為1個(gè)病例），孕婦年齡28～35歲，孕周為29～39周，2例患妊娠糖尿病，其他4例孕早期孕檢正常。孕婦病程為1～3 d，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、胎心胎動(dòng)異常。4例新生兒均為早發(fā)型感染（≤7 d），3例新生兒為早產(chǎn)兒，4例出現(xiàn)胃腸炎、血流感染和腦膜炎等感染癥狀，1例出生后2 d治療無(wú)效死亡；2例胎死宮內(nèi)。胎盤(pán)病理有不同程度的炎癥表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為絨毛膜板下及絨毛膜炎癥、大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，其表現(xiàn)符合急性胎膜絨毛膜炎。

孕產(chǎn)婦初始經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療選用頭孢呋辛等，明確病原菌為產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌后，調(diào)整為青霉素、氨芐西林、美羅培南、左氧氟沙星等治療，6例孕婦產(chǎn)后抗菌藥物治療后預(yù)后良好。胎兒/新生兒預(yù)后不良，3例胎兒/新生兒死亡，3例新生兒經(jīng)抗菌藥物治療后痊愈出院。見(jiàn)表1。

2.2 產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的分子特征分析

6株產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分為3種血清型，4b型為主（4株）、1/2a型和1/2b型各1株。MLST結(jié)果以ST2為主（3株），ST1、ST5和ST91各1株。通過(guò)使用A s c I和A p a I酶的PFGE分析，6株產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分為5種PT型，其中LM2870和LM2872為相同型別。6株分離菌均檢測(cè)到毒力基因（plcB、actA、hly、iap、prfA、inlA）。見(jiàn)圖1。

3 討論

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是一種重要的食源性致病菌，人或動(dòng)物食用其污染的食品后會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的疾病，受?chē)?guó)內(nèi)外食品安全和公共衛(wèi)生相關(guān)部門(mén)的高度重視。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，圍產(chǎn)期人群發(fā)生李斯特菌感染的風(fēng)險(xiǎn)是非圍產(chǎn)期人群的18倍，16%～27%李斯特菌感染病例為孕婦[10]。2017年1月－2018年5月，南非發(fā)生有報(bào)道以來(lái)最嚴(yán)重的李斯特菌感染暴發(fā)事件，其中42%病例為孕婦及其新生兒[11]。英國(guó)圍產(chǎn)期李斯特菌感染占總侵襲性李斯特菌感染病例的12%[12]，美國(guó)占17%[13]，法國(guó)占17.7%[14]，以色列占35%[15]。我國(guó)李斯特菌感染多以散發(fā)病例報(bào)道為主。根據(jù)文獻(xiàn)綜述，1964－2011年李斯特菌感染中圍產(chǎn)期病例占52%[16]，2011－2016年占64.4%[17]。孕婦感染產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌后多表現(xiàn)為非特異性流感樣癥狀，孕婦產(chǎn)后預(yù)后良好，但其胎兒或新生兒感染后果嚴(yán)重，甚至死亡。本研究報(bào)道的病例孕婦臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛和胎心胎動(dòng)異常等，結(jié)束妊娠后經(jīng)抗菌藥物治療均預(yù)后良好。而胎兒/新生兒預(yù)后嚴(yán)重不良，2例胎死宮內(nèi)，1 例感染嚴(yán)重治療無(wú)效死亡，其余3例新生兒均患有不同程度的嚴(yán)重感染，包括肺炎、血流感染、腦膜炎。根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，妊娠期感染產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌后進(jìn)行敏感抗菌藥物治療，可以避免不良預(yù)后[18-19]。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌對(duì)頭孢菌素天然耐藥，文獻(xiàn)推薦一線抗生素氨芐西林≥6 g/d，二線抗生素紅霉素4 g/ d，靜脈滴注，療程14 d[10]。本研究6例感染孕婦首選抗生素均為頭孢菌素類(lèi)，明確病原后部分改用青霉素、氨芐西林或左氧氟沙星治療，經(jīng)治療預(yù)后良好。新生兒治療首選抗生素為氨芐西林、頭孢菌素類(lèi)和美羅培南，明確病原菌后均改用氨芐西林。除2例胎死宮內(nèi)外，1例癥狀嚴(yán)重患兒氨芐西林治療2 d后死亡，另外3例新生兒經(jīng)過(guò)治療痊愈出院。胎兒/新生兒感染的預(yù)后嚴(yán)重不良，本組6例中3例胎兒/新生兒死亡。孕晚期或者足月感染的患者根據(jù)臨床情況進(jìn)行剖宮產(chǎn)，及時(shí)正確的抗菌藥物治療可以減輕新生兒出生后的感染癥狀，降低新生兒的死亡率。因此，對(duì)孕婦進(jìn)行李斯特菌感染早期診斷和及時(shí)治療，對(duì)圍產(chǎn)期李斯特菌感染的控制非常重要。

表1 6例圍產(chǎn)期李斯特菌感染母嬰的臨床特征Table 1 Characteristics of 6 cases of maternal-neonatal listeriosis

表1（續(xù)）Table 1（continued）

圖1 6株產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌臨床分離株的PFGE 聚類(lèi)圖Figure 1 PFGE cluster for 6 strains of Listeria monocytogenes isolated from patients

李斯特菌感染主要通過(guò)食用被致病菌污染的食品引發(fā)，加強(qiáng)食源性李斯特菌感染的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)非常重要。血清學(xué)分型和分子分型是細(xì)菌性傳染病分子流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)的重要手段，對(duì)李斯特菌感染的追蹤溯源及預(yù)防控制具有非常重要的意義。經(jīng)過(guò)血清學(xué)分型，6例感染病例中4例為4b型菌株感染，相關(guān)病例胎兒/新生兒預(yù)后嚴(yán)重不良，其他2例為1/2a、1/2b型。根據(jù)Elinav等[15]和Girard等[20]報(bào)道，妊娠相關(guān)李斯特菌感染中4b型菌株感染分別占61%和79.5%。腦膜炎患兒的4b型菌株分離率和感染患者的病死率顯著高于其他血清型[21]。這些結(jié)果表明4b型菌株可能具有較強(qiáng)的毒力，易引起嚴(yán)重的不良預(yù)后。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道人源產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌血清型主要為1/2b、1/2a、4b型，但是血清型1/2b、1/2a占比較高[22-23]，與本研究以4b型為主存在差異，可能與本研究所涉及的患病人群不同有關(guān)，還可能與本研究病例數(shù)較少有關(guān)。根據(jù)MLST，6株產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌歸為4個(gè)ST型，以ST2為主（3株），文獻(xiàn)報(bào)道CC1（ST1）和CC2（ST2）克隆群屬于臨床菌株的優(yōu)勢(shì)克隆群[24]，且ST2、ST5和ST91菌株與胎盤(pán)感染相關(guān)[25]，本研究胎盤(pán)感染以ST2菌株為主，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究中共有5種PT型，其中病例2和病例4分離的菌株具有相同PT型（PT366），發(fā)病時(shí)間分別為2012年2月和2013年10月，沒(méi)有明顯時(shí)間聚集性，是否為相同感染來(lái)源需結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查和當(dāng)?shù)赝谑称肪陻?shù)據(jù)進(jìn)一步分析。

我國(guó)自2000年起開(kāi)展食品的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌監(jiān)測(cè)，食品污染率可高達(dá)30%[26]。孕婦對(duì)李斯特菌感染的整體知曉率較低[27-28]。問(wèn)卷調(diào)查發(fā)現(xiàn)80%的孕婦在懷孕期間食用過(guò)高風(fēng)險(xiǎn)食物，因此安全飲食對(duì)孕婦非常重要[12]。作為易感人群，孕婦在妊娠期間應(yīng)避免食用易被污染的高風(fēng)險(xiǎn)食品，同時(shí)也需加強(qiáng)食品衛(wèi)生監(jiān)管。法國(guó)通過(guò)加強(qiáng)食品安全監(jiān)管和孕婦飲食安全的宣教，從1984—2011年妊娠期李斯特菌感染的發(fā)病數(shù)大幅下降[20]。因此對(duì)于高危人群應(yīng)加強(qiáng)李斯特菌感染相關(guān)知識(shí)的宣傳，提高孕婦在妊娠期間安全飲食的意識(shí)，減少?lài)a(chǎn)期李斯特菌感染的發(fā)生，從而降低新生兒感染率和死亡率。