（1，3）-β-D葡聚糖檢測聯(lián)合其他微生物學(xué)檢測在侵襲性真菌病診斷中的相關(guān)性分析

楊金，朱均昊，李莉，章強(qiáng)強(qiáng)

侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD），是指真菌侵入人體組織、血液，并在其中生長繁殖導(dǎo)致組織損害、器官功能障礙和炎性反應(yīng)的病理和病理生理改變。隨著廣譜抗菌藥物、

皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，IFD發(fā)病率呈明顯上升趨勢。對IFD的早期高效診斷有利于改善疾病的轉(zhuǎn)歸。傳統(tǒng)的真菌感染檢測方法主要有真菌形態(tài)學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等，但這些方法本身具有各自的局限性，檢測耗時(shí)久、靈敏度低等并易造成漏診，常無法滿足臨床早期診斷要求。近年來，真菌血清學(xué)檢查（1，3）-β-D葡聚糖檢測（G試驗(yàn)）以其無創(chuàng)、快捷、靈敏等優(yōu)勢在真菌早期診斷中發(fā)揮重要作用。本研究對復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院高度懷疑IFD患者的血清標(biāo)本作G試驗(yàn)檢測，以患者臨床診斷結(jié)果為依據(jù)，并與傳統(tǒng)真菌涂片、培養(yǎng)方法及隱球菌莢膜抗原檢測結(jié)果加以比較，探究G試驗(yàn)聯(lián)合真菌涂片、真菌培養(yǎng)及隱球菌莢膜抗原檢測等微生物學(xué)檢測在IFD診斷中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例來源

收集2018年2－12月我院普外科、胸外科、泌尿外科、感染科、血液科、腎內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、呼吸科等8個(gè)科室高度懷疑IFD住院患者，住院期間進(jìn)行G試驗(yàn)，以及血液、無菌體液、組織置換液和合格痰標(biāo)本進(jìn)行真菌涂片、真菌培養(yǎng)。

1.2 IFD判定

本研究以歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國國立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組（EORTC/MSG）共識(shí)組于2008年修訂并發(fā)表的IFD定義的國際共識(shí)為診斷標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，將診斷結(jié)果分為：確診、擬診和疑似。本研究采用回顧性研究方法，查閱病史，綜合分析患者臨床癥狀和體征、影像學(xué)及微生物學(xué)檢測結(jié)果、藥物使用情況及療效，作出相應(yīng)診斷結(jié)果。診斷結(jié)果以確診或擬診IFD為真陽性，非IFD為真陰性。

1.3 研究方法

1.3.1 G試驗(yàn)采用IGL 800全自動(dòng)真菌/細(xì)菌動(dòng)態(tài)檢測儀和天津喜諾生物有限公司（GC180424）真菌G試驗(yàn)試劑盒，進(jìn)行動(dòng)態(tài)光度法檢測。

1.3.2 真菌學(xué)檢查包括真菌涂片和真菌培養(yǎng)及鑒定。標(biāo)本為合格痰、支氣管肺泡灌洗液、血、腦脊液、腹水和組織置換液。痰真菌培養(yǎng)陽性病例需同時(shí)符合真菌涂片陽性方納入統(tǒng)計(jì)。采用科瑪嘉沙保弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基、API20C AUX及ID32C或基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF MS）（江蘇天瑞儀器公司）進(jìn)行分離、鑒定。

1.3.3 隱球菌莢膜抗原檢測采用美國Immuno-Mycologics公司生產(chǎn)的隱球菌莢膜抗原試劑盒，對樣本進(jìn)行隱球菌莢膜抗原定量和定性檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

檢測結(jié)果以確診或擬診IFD為真陽性，非IFD為真陰性。采用SPSS 17.0軟件，組間計(jì)量資料比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算單項(xiàng)檢測方法和聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。

2 結(jié)果

2.1 病例分布

選取在2018年2－12月我院上述8個(gè)科室住院期間同時(shí)進(jìn)行G試驗(yàn)、真菌涂片和真菌培養(yǎng)的患者共942例，其中184例另行隱球菌莢膜抗原檢測。按病原菌進(jìn)行區(qū)分：侵襲性念珠菌病確診62例，疑似127例；侵襲性曲霉病確診11例，擬診33例，疑似27例；侵襲性隱球菌病確診35例；地方性真菌病確診7例，其中確診馬爾尼菲籃狀菌病5 例，莢膜組織胞漿菌病和著色真菌病各1例。非感染640例。

2.2 G試驗(yàn)檢測結(jié)果

G試驗(yàn)結(jié)果以100 ng/L為陽性臨界值。以確診或擬診IFD為真陽性（隱球菌除外），非IFD診斷為真陰性。942例患者中，除去疑似IFD 154例及確診侵襲性隱球菌病35例，余下753例中，G試驗(yàn)陽性334，陰性419例。G試驗(yàn)與臨床診斷比較見表 1。四格表分析，G試驗(yàn)靈敏度為92.9%，特異度為59.0%；陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為31.4%和98.1%。見表2。

2.3 涂片、培養(yǎng)等真菌學(xué)檢測結(jié)果

在上述的753例中，真菌涂片陽性87例，陰性666例；真菌培養(yǎng)陽性133例，其中真陽性88例。真菌學(xué)檢查與臨床診斷比較見表1，真菌學(xué)檢查靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值見表2，真菌培養(yǎng)結(jié)果及相應(yīng)G試驗(yàn)陽性結(jié)果見表3。

2.4 聯(lián)合檢測結(jié)果

將G試驗(yàn)、真菌涂片及真菌培養(yǎng)三項(xiàng)試驗(yàn)聯(lián)合進(jìn)行檢測，三項(xiàng)中至少有兩項(xiàng)結(jié)果陽性則為聯(lián)合檢測陽性，余為聯(lián)合檢測陰性。聯(lián)合檢測結(jié)果與臨床診斷的比較見表1，聯(lián)合檢測靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值見表2。

表1 G 試驗(yàn)和真菌學(xué)檢查及聯(lián)合檢測結(jié)果Table 1 Results of G-test，mycological examinations and combined panel test

表2不同檢測方法用于診斷IFD時(shí)靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值比較Table 2 Sensitivity，specifcity，positive predictive value and negative predictive value compared between different laboratory assays in diagnosis of invasive fungal diseases（%）

表3真菌培養(yǎng)真陽性菌種分布情況及相應(yīng)G 試驗(yàn)陽性株數(shù)Table 3 Distribution of fungal species by specimen type and the corresponding positive number detected by G-test

2.5 G試驗(yàn)與隱球菌莢膜抗原檢測

在184例進(jìn)行隱球菌莢膜抗原檢測標(biāo)本中，35例確診隱球菌病，隱球菌莢膜抗原檢測均為陽性（定量滴度從1∶10～1∶1 256）；其余診斷為非IFD，隱球菌莢膜抗原檢測均為陰性。35例隱球菌病中，G試驗(yàn)陽性27例；149例非隱球菌病中，G試驗(yàn)陰性121例。G試驗(yàn)對隱球菌病靈敏度為77.1%，特異度為81.2%；陽性預(yù)測值為49.1%，陰性預(yù)測值為93.8%。

3 討論

隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑和各種導(dǎo)管插管等治療手段應(yīng)用及造血干細(xì)胞和實(shí)體器官移植的開展，自身免疫性疾病、艾滋病、惡性腫瘤及糖尿病等基礎(chǔ)疾病發(fā)病率的增加以及人口老齡化等因素，IFD發(fā)病率和死亡率逐年升高。同時(shí)，近年來發(fā)現(xiàn)IFD不僅在免疫缺陷患者中常見，在免疫正常患者如慢性阻塞性肺疾病患者中發(fā)病率也出現(xiàn)上升[3]。

（1，3）-β-D葡聚糖是一種廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中的多糖成分（接合菌和隱球菌除外）[4]，可通過特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子，激發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成凝固蛋白后利用比色法或比濁法進(jìn)行定量檢測，故命名為G試驗(yàn)[5]。侵襲性真菌感染時(shí)真菌被吞噬處理后，持續(xù)釋放（1，3）-β-D葡聚糖，此時(shí)檢測血液或體液中（1，3）-β-D葡聚糖抗原含量會(huì)顯著增高[6]。淺部真菌感染或定植時(shí)，（1，3）-β-D葡聚糖未被釋放，故其血清檢測為陰性。研究提示（1，3）-β-D葡聚糖對侵襲性真菌感染診斷有重要價(jià)值[7]，并且憑其方便快捷、耗時(shí)短的優(yōu)勢，在深部真菌感染早期診斷中起著重要作 用。

本研究結(jié)果顯示，對于除隱球菌感染外的其他IFD，G試驗(yàn)靈敏度為92.9%，顯著高于直接涂片和真菌培養(yǎng)；特異度為59.0%，明顯低于真菌學(xué)檢測方法；G試驗(yàn)陽性預(yù)測值為31.4%，陰性預(yù)測值較好，為98.1%。以上數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。G試驗(yàn)陽性預(yù)測值較差，存在假陽性的因素常見于使用葡聚糖的靜脈制劑或紗布等醫(yī)用材料，使用纖維素膜進(jìn)行透析，服用多糖類抗腫瘤藥物、菌菇類食物或輸注免疫球蛋白等血液制品，鏈球菌菌血癥，標(biāo)本脂血，黃疸及污染等[9-10]。G試驗(yàn)陽性結(jié)果對于IFD雖然不具特異性，但能夠提示侵襲性真菌感染的可能性。而造成G試驗(yàn)假陰性可能與以下原因有關(guān)：①患者存在吞噬細(xì)胞功能缺陷，如粒細(xì)胞缺乏癥等，真菌進(jìn)入血液但是沒有被吞噬細(xì)胞處理，（1，3）-β-D葡聚糖未被釋放出來或釋放很少；②血液中（1，3）-β-D葡聚糖被免疫系統(tǒng)清除或自然降解；③（1，3）-β-D葡聚糖可能與相應(yīng)抗體形成免疫復(fù)合物，而不能被檢出；④標(biāo)本室溫放置時(shí)間過長或凍存后標(biāo)本中（1，3）-β-D葡聚糖自然降解；⑤臨床上為了減少IFD發(fā)病率，在診斷之初預(yù)防性使用某些抗真菌藥物，抑制（1，3）-β-D葡聚糖釋放；⑥局灶性曲霉病及近平滑念珠菌引起的侵襲性感染G試驗(yàn)靈敏度較低或呈陰性結(jié)果。本研究中，真菌直接涂片法特異度較高，且直接涂片法可為臨床提供最為直接的診斷依據(jù)，具有檢測快速的優(yōu)勢，但其靈敏度較低，標(biāo)本質(zhì)量及檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平直接影響檢驗(yàn)結(jié)果。而真菌培養(yǎng)作為診斷深部真菌感染的重要方法，能對培養(yǎng)出的真菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，為臨床合理使用抗真菌藥物提供有效證據(jù)，但培養(yǎng)周期較長，具有滯后性[11]，陽性預(yù)測值也較低，亦無法滿足臨床需求。

早期診斷對于侵襲性真菌感染治療成敗起著重要作用。將G試驗(yàn)、真菌涂片鏡檢與真菌培養(yǎng)聯(lián)合檢測一定程度上彌補(bǔ)了單獨(dú)檢測的各自不足。本實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合檢測診斷IFD靈敏度可達(dá)97.3%；陰性預(yù)測值達(dá)99.5%，即當(dāng)三種檢測方法檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性時(shí)，提示患者感染IFD的可能性非常小，有助于排除IFD診斷，降低漏診率和誤診率。聯(lián)合檢測的特異度及陽性預(yù)測值較單獨(dú)G試驗(yàn)對應(yīng)指標(biāo)也有很大提高，對于指導(dǎo)臨床盡早抗真菌治療更有說服力。因此，臨床上將三種方法聯(lián)合使用，既可具有G試驗(yàn)簡便、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，又具有直接涂片法及真菌培養(yǎng)法能區(qū)分真菌種屬的優(yōu)勢，為臨床提供直接診斷依據(jù)。

對于隱球菌病檢測常采用隱球菌莢膜抗原檢測，該法簡便、快速，能有效診斷隱球菌感染，且具有良好的靈敏度和特異度，雖然本試驗(yàn)中隱球菌莢膜抗原檢測靈敏度和特異度均達(dá)到100%，但在臨床使用中不可避免存在假陽性和假陰性。一方面，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)病、類風(fēng)濕因子、抗酸桿菌均與新型隱球菌莢膜多糖抗原存在交叉抗原，引起假陽性；另一方面，高水平隱球菌抗原所致的鉤帶現(xiàn)象和體內(nèi)未知非特異性蛋白對隱球菌抗原的掩蓋效應(yīng)，可引起假陰性[12]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為隱球菌細(xì)胞壁外莢膜致使（1，3）-β-D葡聚糖難以釋放，因此G試驗(yàn)通常不適用于隱球菌檢測。但根據(jù)本研究結(jié)果，G試驗(yàn)診斷隱球菌感染靈敏度達(dá)到77.1%，說明部分隱球菌感染患者血清（1，3）-β-D葡聚糖也有升高并能被G試驗(yàn)檢測出；同時(shí)本試驗(yàn)中G試驗(yàn)對隱球菌病陰性預(yù)測值較好，這與以往結(jié)論出現(xiàn)偏差，一方面可能為本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量采集有限所致，另一方面隱球菌感染可能與（1，3）-β-D葡聚糖釋放仍存在一定聯(lián)系。

綜上所述，G試驗(yàn)雖然無創(chuàng)快捷，有助于臨床早期快速判斷，但結(jié)果受干擾因素較多，影響其特異度及陽性預(yù)測值；真菌涂片方便簡單，但陽性檢出率取決于標(biāo)本的采集與質(zhì)量，以及檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平；真菌培養(yǎng)可以確定感染的菌種，有助于抗真菌藥物的選擇，合格標(biāo)本培養(yǎng)陽性具有重要意義。隱球菌莢膜抗原檢測雖然靈敏度、特異度均良好，但仍會(huì)存在少量假陽性的弊端。臨床將G試驗(yàn)與真菌學(xué)檢測方法聯(lián)合使用，揚(yáng)長避短，能為臨床及時(shí)準(zhǔn)確診斷提供有力支撐，提高患者治愈率和生存率。