動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物和β-受體激動(dòng)劑殘留的色譜和質(zhì)譜檢測技術(shù)研究進(jìn)展

刁志祥，王旭堂，張培楊，王 波，謝愷舟*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）在治療和預(yù)防細(xì)菌和原蟲感染中發(fā)揮了重要作用，也因其具有促生長的作用而被添加在動(dòng)物飼料中[1]，但過量使用會(huì)在動(dòng)物源性食品中大量殘留，其致癌作用以及使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等嚴(yán)重威脅著人類健康[2-3]。SAs 包括磺胺胍（Sulfa guanidine，SG）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SMZ）、磺胺噻唑（Sul fathiazole，ST）、磺胺異噁唑（Sulfisoxazole,SIZ）、磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline，SQ）、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimoxine，SDM）等。

β-受體激動(dòng)劑（Beta-Agonists，BAAs）在畜牧生產(chǎn)中被廣泛用作生長促進(jìn)劑，具有增加動(dòng)物瘦肉量、提高飼料利用率、減少上市天數(shù)等優(yōu)點(diǎn)[4]。人類食用高β-受體激動(dòng)劑殘留的動(dòng)物組織會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫疼痛、惡心頭暈等癥狀，重則威脅生命。BAAs 主要包括鹽酸克倫特羅（Clenbuterol Hydrochloride，CLN）、萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（Salbutamol，STL）、馬布特羅（Mabuterol，MBT）、特布他林（Terbutaline，TBT）、齊帕特羅（Zipater，ZPT）等。

歐盟[5]、美國[6]和中國[7]對動(dòng)物源性食品中SAs和BAAs 最高殘留限量（Maximum Residue Limits，MRLs）均作出了規(guī)定（表1）。隨著色譜質(zhì)譜技術(shù)飛速發(fā)展，獸藥殘留檢測已具有較低的檢測限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantification，LOQ），但難以獲得較高的回收率，且多種藥物同時(shí)檢測的難度較大，因此今后的研究過程中還應(yīng)不斷開發(fā)新的色譜和質(zhì)譜檢測法和樣品前處理方法，以便盡可能快速、便捷檢測動(dòng)物性食品中藥物的殘留，減小分析復(fù)雜樣品基質(zhì)時(shí)基質(zhì)效應(yīng)的影響。本文綜述了2 種藥物的色譜質(zhì)譜檢測方法，以期為動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測新方法的建立提供理論基礎(chǔ)。

1 氣相色譜法

氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）是分析揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物的復(fù)雜混合物的一種成熟和高度可靠的技術(shù)[8]。無數(shù)相關(guān)的色譜柱化學(xué)、進(jìn)樣技術(shù)和檢測器提供了良好的選擇性和靈敏度，可以解決環(huán)境、能源、臨床、食品和藥物研究中的眾多問題。

Chiavarino 等[9]將9 種磺胺類藥物轉(zhuǎn)化為其N1甲基化衍生物，經(jīng)毛細(xì)管氣相色譜分離，再利用原子發(fā)射檢測器同時(shí)測定，最終得出原子發(fā)射檢測器作為GC 檢測方法的使用表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢，顯著提高了線性范圍且降低方法的LOD，可有效檢測生物基質(zhì)中磺胺類藥物殘留的分析。李明等[10]利用CLN 含有2 個(gè)電負(fù)性很強(qiáng)的氯原子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使用電子捕獲檢測器（Electron Capture Detector，ECD）進(jìn)行氣相色譜法分析，具有很高的靈敏度，平均回收率＞60%，滿足獸藥殘留分析的要求。由于氣相法檢測藥物需要衍生化（如重氮甲基化等）過程較為繁瑣且不易控制，故報(bào)道較少。

表1 歐盟、美國和中國規(guī)定的動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物和β-受體激動(dòng)劑的最高殘留限量 μg/kg

2 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spec trometry，GC-MS）目前在化學(xué)成分的通用檢測、定量分析和化學(xué)成分鑒定的能力方面有很大的性能寬度。GC-MS 法常因其具備高靈敏度、低假陽性率等特點(diǎn)，用作篩選后陽性樣品的確證。

GC-MS 法對于SAs 的測定既靈敏又具有選擇性，在分析前需要對非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定的藥物進(jìn)行衍生化處理，這增加了總體分析時(shí)間，并可能導(dǎo)致分析技術(shù)錯(cuò)誤。Reeves[11]以選定的離子監(jiān)測方式制備和分析甲基酰胺基三氟乙酰基衍生物，該方法可以在液相色譜系統(tǒng)收集后快速篩查可疑的SAs，減少檢測工作量，有效加標(biāo)回收率高于50%。Liu 等[12]同時(shí)測定豬肉樣品中的3 種BAAs，測得豬肉加標(biāo)樣品中CLN、STL 和RAC 的回收率為85.5%～93.9%，豬肉樣品的LOD 為0.022～0.091 μg/kg，該方法簡化了預(yù)處理程序，可同時(shí)提取多個(gè)樣品，提高了預(yù)處理效率。Ye 等[13]建立了豬肉中CLN 的GC-MS 快速分析方法，在優(yōu)化的條件下，LOD 為3.6 μg/kg，加標(biāo)回收率為97.4%～105.7%。GC-MS 法雖然可行，但是必須經(jīng)過復(fù)雜的前處理過程才能檢測，另外衍生化的過程中其產(chǎn)物很難控制，增加檢測難度，并不適合廣泛推廣使用。

3 液相色譜法

高效液相色譜法（High-Performance Liquid Chromato graphy，HPLC）具有更高的分離效率、靈敏度和分析速度。常用的檢測器有紫外檢測器（Ultraviolet Detector，UV）、熒光檢測器（Fluorescence Detector，F(xiàn)LD）、二極管陣列檢測器（Diode Array Detector，DAD）等。因打破了傳統(tǒng)液相色譜依靠重力使流動(dòng)相緩慢流過色譜柱，而用高壓輸液泵使流動(dòng)相流過色譜柱，這大大降低了固定相的粒度要求，提高分離效率。

Stoev 等[14]建立了HPLC-FLD 法定量測定10 種最常用SAs 及其衍生物的殘留量，加標(biāo)濃度為1、5、10 μg/kg 條件下，其平均回收率分別為64%、68% 和78%，SQ 的定量限為1 μg/kg，其余SAs 的定量限為0.5 μg/kg。Maudens 等[15]利用液-液萃取結(jié)合固相萃取，建立了HPLC-FLD 法同時(shí)測定蜂蜜中12 種SAs，LOD 和LOQ 分別在1～2 μg/L 和2～5 μg/kg，回收率在37%～67%。

Fredy 等[16]采用反相高效液相色譜-紫外檢測法測定牛肝臟中CLN 殘留濃度，采用C18 反相色譜柱，NaH2PO4：乙腈（85:15，V/V）為流動(dòng)相，試驗(yàn)得到牛肝臟樣品中加標(biāo)回收率為82.0%～111.7%，LOD 和LOQ 分別為0.20 μg/kg 和0.42 μg/kg。Yan 等[17]利用HPLC-UV 法檢測3 種β-受體激動(dòng)劑，在優(yōu)化的色譜條件下，3 種BAAs 在20 min 內(nèi)達(dá)到完全基線分離；線性范圍為0.2～50 μg/L，回收率在79.2%～91.9%。

不同樣品基質(zhì)中SAs 和BAAs 液相檢測方法比較見表2。液相色譜熒光檢測法具有較低的檢測限，但是該檢測方法只對熒光基團(tuán)有效，部分藥物必須要衍生化，以獲得檢測所需的熒光基團(tuán)。液相色譜紫外檢測法已成功應(yīng)用于豬肉、牛肉、雞肉等基質(zhì)中獲得了較好的分離度。總的來說，檢測SAs 和BAAs 殘留使用C18 色譜柱較多，而紫外檢測法擁有較低的檢測限，但在加標(biāo)樣品回收率方面略不及熒光檢測器，但二極管陣列檢測器同樣在回收率方面有較好的表現(xiàn)，它可以得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜，適合用于復(fù)雜樣品的定性定量分析。

4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLCMS）和超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UPLC-MS）作為監(jiān)測動(dòng)物性食品組織獸藥殘留的重要手段，以LC 作為進(jìn)樣和分離裝置，MS 作為檢測器來對基質(zhì)中的化學(xué)成分定性定量。經(jīng)色譜分離后的各組分會(huì)被電離成不同荷質(zhì)比的離子，經(jīng)電場作用分開，最終聚焦獲得質(zhì)譜圖。大多數(shù)藥物可以通過LC-MS 技術(shù)檢測，而MS 提供了檢測復(fù)雜組織提取物中目標(biāo)分析物所需的高特異性，該法兼具LC 的高分離能力和MS 的分析能力。

表2 不同樣品基質(zhì)中磺胺類藥物和β-受體激動(dòng)劑液相檢測方法的比較

Titus 等[34]采用支撐液膜凈化富集技術(shù)，結(jié)合HPLC-MS 同時(shí)測定加標(biāo)牛奶和牛肝、腎組織中的16種SAs 殘留，其中SDZ 等未能被有效捕獲，加標(biāo)樣品中SG 的回收率在77%～90%，SMM 的加標(biāo)回收率在55%～64%，該支撐液膜的高提取效率為這些化合物的殘留的測定提供了較好的選擇性和靈敏度。Verzegnassi等[35]建立了蜂蜜中10 種SAs 的反向HPLC-MS/MS 檢測法，為蜂蜜中10 種低濃度水平SAs 的定性確認(rèn)提供方法，所有藥物在50 μg/kg 的加標(biāo)水平下，平均回收率在44%～73%。

Sun 等[36]首次建立了免疫親和柱凈化，結(jié)合HPLCMS/MS 同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中RAC、氯霉素和玉米赤霉醇?xì)埩?，結(jié)果表明RAC 的加標(biāo)回收率為89.8%～99.0%，檢測限和定量限分別為0.009 μg/kg 和0.03 μg/kg，該方法具有較好的靈敏度且回收率高。Lin等[37]結(jié)合QuEChERS 技術(shù)，建立動(dòng)物肌肉和內(nèi)臟中β-受體激動(dòng)劑多殘留分析的HPLC-MS/MS 檢測新方法，結(jié)果證明加標(biāo)樣品中的平均回收率在70%～120%，LOQ為1 μg/kg，該方法簡單快速，回收率高，降低分析時(shí)間且溶劑用量低。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性和明確的識別能力結(jié)合起來，由表3 可知其在檢測SAs 和BAAs 殘留方面發(fā)揮了重要作用，應(yīng)用也最為廣泛，相比于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，液質(zhì)聯(lián)用對那些分子量大、極性強(qiáng)、難氣化、熱穩(wěn)定性差的目標(biāo)物具有較好的分離檢測和定性定量能力，能提供復(fù)雜組織提取物中目標(biāo)分析物所需的高特異性，解決目標(biāo)物共流出問題。隨著科技發(fā)展以及藥物分析的需求，分析技術(shù)的聯(lián)用已經(jīng)成為了分析化學(xué)發(fā)展的趨勢，聯(lián)用技術(shù)可以將不同技術(shù)的優(yōu)勢結(jié)合，使檢測結(jié)果更加的精準(zhǔn)。

表3 不同樣品基質(zhì)中磺胺類藥物和β-受體激動(dòng)劑殘留檢測液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法的比較

5 展 望

隨著生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對動(dòng)物食品安全越來越關(guān)注，這也就要求科研工作者們開發(fā)出更加準(zhǔn)確、高效、重復(fù)性好的檢測方法來降低動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測的檢測限和定量限，以保證人們身體健康和消除貿(mào)易壁壘。色譜質(zhì)譜檢測技術(shù)作為重要的化學(xué)分析法，在獸藥殘留分析中一直占據(jù)主導(dǎo)地位，現(xiàn)有的色譜質(zhì)譜檢測方法有很多，如GC-MS、HPLC-FLD、HPLCUV、HPLC-DAD、HPLC-MS/MS、UPLC-MS/MS 等。GC 和GC-MS 適用于低沸點(diǎn)、易揮發(fā)和熱穩(wěn)定性好的樣品，而GC 法檢測動(dòng)物源性食品中SAs 和BAAs 基本均須衍生化反應(yīng)，而衍生化過程繁瑣且不易控制，故使用較少。LC-MS/MS 法由于前處理方式、色譜柱、流動(dòng)相選擇與比例等不同，檢測水平存在差別，但總的來說此法回收率都處在較高水平，滿足檢測需要，且避免了氣相色譜法檢測時(shí)需要衍生化的步驟，但是也存在一些缺點(diǎn)，如儀器成本高和存在豐富的基質(zhì)效應(yīng)，這可能會(huì)影響方法的定量和選擇性能。今后的研究方向應(yīng)致力于開發(fā)集成化的全自動(dòng)前處理設(shè)備及色譜質(zhì)譜檢測設(shè)備聯(lián)用等方法，另外降低殘留檢測限和基質(zhì)效應(yīng)的干擾將成為今后研究的熱門方向。