1例蛋雞腺病毒感染的診斷及對SPF雞的致病性

史榮華 周揚(yáng) 顏彩霞

摘要：2018年11月，山東省某蛋雞場80日齡左右雞群出現(xiàn)采食下降、精神沉郁、消瘦等癥狀，日死亡率達(dá)1%，臨床剖檢病變主要為心包積液、肝臟有出血點(diǎn)、腎臟腫大等。為明確患病蛋雞死亡原因及確定病原，無菌采取病死雞肝臟、腎臟等，并展開病毒分離、PCR檢測等實(shí)驗(yàn)室診斷，結(jié)果表明，病料接種雞胚，胚體有明顯出血癥狀，肝臟有出血點(diǎn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與已發(fā)表的血清4型禽腺病毒Hexom基因同源性為99%。上述結(jié)果表明，該分離株為血清4型禽腺病毒。將分離到的腺病毒對2周齡SPF雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)研究其致病性，每日觀察雞的精神狀態(tài)，記錄死亡情況，發(fā)現(xiàn)胸肌接種0.3 mL/羽的病毒劑量對SPF雞的致死率高達(dá)100%，死亡時間在72～144 h;對死亡雞剖檢均可見明顯的心包積液，肝臟出血壞死;組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞核內(nèi)形成嗜堿性包涵體。

關(guān)鍵詞：蛋雞;腺病毒;診斷;致病性

中圖分類號：S858.31?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0156-04

禽腺病毒（fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3個群，其中Ⅰ群禽腺病毒（fowl adenovirus group Ⅰ，F(xiàn)AdV-Ⅰ）具有共同的群抗原，依據(jù)其分子結(jié)構(gòu)特征分為5個群（A～E）、12個血清型[1-2]。FAV急性感染主要表現(xiàn)為包涵體肝炎、心包積液及肌胃糜爛等癥狀[3]。該病多發(fā)于肉雞、肉雜雞，近期也開始感染產(chǎn)蛋雞的育成雞，并且育成雞發(fā)病死亡率還比較高。2018年11月山東某蛋雞場發(fā)生的疑似禽腺病毒感染雞群，臨床表現(xiàn)為心臟包膜中有淡黃色液體，肝臟表面有出血點(diǎn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室病毒分離與鑒定為血清4型禽腺病毒感染。分離到的病毒對SPF雞的臨床致死率很高，表現(xiàn)癥狀典型。

1 材料與方法

1.1 病料信息

病料來源于山東省某蛋雞場，80日齡海蘭蛋雞，剖檢疑似禽腺病毒感染，無菌采集具有典型病變的肝、脾、腎等組織用于病毒分離。

1.2 試驗(yàn)材料

SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，由國藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)室孵化及飼養(yǎng)。

DNA提取純化試劑盒購自上海凱杰公司，2×Easy TaqSuperMix，普通瓊脂糖凝膠購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DL 2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，根據(jù)GenBank中Ⅰ群禽腺病毒的Hexom基因序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)合成引物，F(xiàn)：5′-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3′;R：5′-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3′，引物由華大基因公司合成，其他試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.3 病毒分離

采集病死雞肝、脾、腎等病變組織，按1 ∶ 5加入含適當(dāng)濃度抗生素的滅菌8.5%生理鹽水，充分研磨，反復(fù)凍融3次后，離心取上清[4]，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，卵黃囊接種5個7 d胚齡的SPF雞胚，置37 ℃溫箱孵育。照胚1次/12 h，將24 h內(nèi)死亡雞胚棄去，24 h后死亡雞胚收取尿囊液并觀察胚體是否病變，7 d后存活的雞胚，置于4 ℃凍死，收取尿囊液并觀察胚體是否病變。

1.4 血凝試驗(yàn)

取30 μL收集的尿囊液用生理鹽水在血凝板中先進(jìn)行倍比稀釋211，隨后每孔加入30 μL 1%雞紅細(xì)胞;置于37 ℃ 反應(yīng)10 min。若樣品孔出現(xiàn)雞紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，則判定為有血凝性;反之則為血凝陰性。

1.5 PCR檢測

采用DNA提取試劑盒抽提雞胚尿囊液中的DNA，置-20 ℃?zhèn)溆?。以提取的病毒DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：DNA模板2.0 μL，2×Easy Taq Super Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳處理后，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照鑒定，陽性樣品送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測定，并將測定序列與GenBank上已發(fā)表FAdV核苷酸序列進(jìn)行同源性比對。

1.6 對SPF雞的致病性試驗(yàn)

2周齡SPF雞以0.3 mL/只的劑量胸肌接種該分離病毒，每日觀察雞的精神狀況、采食量、發(fā)病情況，記錄死亡時間，計(jì)算死亡率，死亡雞剖檢記錄眼觀病變，連續(xù)觀察10 d。

1.6.1 發(fā)病SPF雞病理組織學(xué)檢測 取病死雞的肝臟等組織用福爾馬林固定，按文獻(xiàn)[5]方法制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，染色后進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。

2 結(jié)果

2.1 病雞剖檢癥狀

對現(xiàn)場病死雞進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，主要表現(xiàn)為包心，內(nèi)含黃色積液（圖1-A），肝臟表面有大量出血點(diǎn)（圖1-B）。

2.2 病毒分離

SPF雞胚在接種病料后，144 h內(nèi)全部死亡，血凝試驗(yàn)結(jié)果表明，收獲的尿囊液沒有血凝性，排除了流感和新城疫病毒感染的可能。接種病料死亡的雞胚出現(xiàn)明顯病變，主要表現(xiàn)為胚體出血，肝臟呈黃色，有明顯的出血點(diǎn)（圖2）。

2.3 PCR鑒定和序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出的目的條帶與預(yù)期設(shè)定的腺病毒陽性對照的條帶相符，大小約為500 bp（圖3）。測序結(jié)果表明，此病毒分離株的基因序列與GenBank已發(fā)表4型FAdV序列同源性達(dá)99%，從而確定為血清4型FAdV。

2.4 對SPF雞的致病性試驗(yàn)結(jié)果

SPF雞攻毒后，前3 d無明顯癥狀，4 d時開始出現(xiàn)采食量下降，精神沉郁，144 h內(nèi)全部死亡，剖檢主要表現(xiàn)為包心，內(nèi)有淡黃色清亮液體（圖4-A）;肝臟發(fā)黃、表面有散在出血點(diǎn)（圖4-B），腎臟腫大（圖4-C）。

2.4.1 發(fā)病SPF組織病理學(xué)檢測 組織病理學(xué)顯示，肝細(xì)胞內(nèi)可見嗜堿性包涵體（圖5-A、圖5-B）。

3 討論

Ⅰ群禽腺病毒（fowl adenovirus，F(xiàn)AdV-Ⅰ）廣泛存在于多種禽類的消化道和呼吸道中，一般不表現(xiàn)臨床癥狀，但在一定條件下作為繼發(fā)病原引起雞群發(fā)病和死亡[6]。2014—2016年該病在我國發(fā)病

范圍廣泛，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失[2]。FAdV-Ⅰ主要侵害3～8周齡的肉雞、蛋雞青年雞、黃雞及麻雞，病死率最高可達(dá)80%，臨床主要表現(xiàn)為心包積水綜合征（HPS）和包涵體肝炎（IBH）。FAdV既可通過種蛋垂直傳播又可通過病雞水平傳播，但以垂直傳播為主[7]。Ⅰ群禽腺病毒分12個血清型，其中在蛋雞、蛋種雞上4型和8b型禽腺病毒流行最為廣泛，4型主要表現(xiàn)為心包積水綜合征，而8b型則主要表現(xiàn)為包涵體肝炎[8]。臨床病例顯示，一些免疫抑制病如傳染性法氏囊?。↖BDV）和傳染性貧血病

（CAV）等混合感染是禽腺病毒感染后發(fā)病率和死亡率加劇的一個重要因素[9]。

本試驗(yàn)從山東省某蛋雞場采集病料，根據(jù)臨床解剖病變，病毒分離、血凝試驗(yàn)、PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物序列分析，最終確診該病例為禽4型腺病毒感染，用分離的毒株對SPF雛雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，致死率達(dá)到100%，且均能發(fā)生與自然感染的剖檢病雞一致的病理變化，均可見肝臟發(fā)黃，有散在的出血點(diǎn)，心包內(nèi)有淡黃色清亮液體，腎臟腫大。表明該分離的FAdV 4型毒株具有很強(qiáng)的致病性。

針對此種腺病毒感染，一方面疫苗預(yù)防是有效的方法，另一方面加強(qiáng)養(yǎng)禽場生物安全是預(yù)防和控制該病發(fā)生的關(guān)鍵。Ⅰ群禽腺病毒的12個血清型交叉保護(hù)性較差，因此在防控上必須選用與流行株匹配的疫苗株和卵黃抗體才能有效遏制疫情的蔓延[10]。一旦雞群發(fā)病無特效藥物，可通過做好雞舍衛(wèi)生消毒工作，防止病毒的水平感染，補(bǔ)充微量元素和維生素及魚肝油等以增強(qiáng)體質(zhì)提高抗病能力，同時添加適量抗生素防止繼發(fā)感染。死亡率逐漸增大的雞群可以緊急注射特異性高免血清或卵黃抗體。因該病目前無明確的致病機(jī)制，建議使用疫苗進(jìn)行防控，選擇合適血清型滅活疫苗給健康雞群進(jìn)行免疫預(yù)防，能達(dá)到95%以上的保護(hù)效果。其中在蛋雞上，7～10日齡和40日齡左右進(jìn)行滅活疫苗的接種，可很好控制該病的發(fā)生。該雞場發(fā)病后選擇緊急注射腺病毒卵黃抗體并適當(dāng)添加抗生素進(jìn)行治療，加強(qiáng)雞舍通風(fēng)消毒，死亡率下降顯著，1周后雞群穩(wěn)定，幾乎未見死亡病雞，雞群恢復(fù)健康后再選擇滅活疫苗進(jìn)行接種。本試驗(yàn)診斷為該雞場下一步蛋雞飼養(yǎng)的禽腺病毒感染預(yù)防和治療工作起到一定參考作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]周薇帆，陳田田，劉建勛，等. 1株Ⅰ群血清4型禽腺病毒對SPF雞的致病性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2018，38（9）：1666-1669.

[2]史榮華，顏彩霞，張建軍，等. 一例禽腺病毒感染的病例診斷[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（30）：86-88.

[3]梁廣成，高 巍，謝 泉，等. 一株高致病性血清4型禽腺病毒的分離與鑒定[J]. 中國家禽，2016，38（19）：25-28.

[4]楊 振，董昌海，李甜甜，等. 四株Ⅰ群禽腺病毒的分離與鑒定[J]. 中國家禽，2017，39（19）：73-76.

[5]馬樹興. 禽傳染病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[6]楚電峰，劉文亭，馮嫣芳，等. Ⅰ群禽腺病毒疫苗研究進(jìn)展[J]. 中國家禽，2017，39（12）：44-47.

[7]Muhammad K S，張賢群. 預(yù)防心包積水綜合征所造成的損失[J]. 國外畜牧學(xué)（豬與禽），2010，30（5）：29-31.

[8]塞 弗. 禽病學(xué)[M]. 11版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[9]陳 玲，張 兵，宋亞芬，等. 禽腺病毒的分離鑒定及LMH細(xì)胞適應(yīng)毒的生物學(xué)特性研究[J]. 中國獸藥雜志，2018，52（6）：1-6.

[10]于洪濤，趙 麗，呂日輝. Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體效價與雞攻毒保護(hù)相關(guān)性試驗(yàn)[J]. 營養(yǎng)與疾病，2018（2）：45-47.胡 波，魏后軍，范志宇，等. 兔流行性腹脹病樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（6）：160-163.