• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雞源益生菌對腸道病原菌的體外拮抗作用

    2020-05-21 03:33:29劉歡歡劉珍珠王玉榮
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2020年6期
    關鍵詞:共培養(yǎng)乳酸菌益生菌

    劉歡歡 劉珍珠 王玉榮

    摘要:為探究雞源益生菌對雞腸道病原菌的影響,從健康的土雞腸道內(nèi)分離并鑒定出6株乳酸菌(Lactobacillus plantarum)和1株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。以從腹瀉病雞腸道內(nèi)分離并鑒定的3株病原菌——大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella enterica)和志賀氏菌(Shigella sonnei)為指示菌,采用平板抑菌法挑選出1株抑菌活性強的乳酸菌;將這株乳酸菌和丁酸梭菌用比濁法測定48 h內(nèi)的生長曲線和pH值變化曲線;采用體外模擬腸道的方式,將2株益生菌分別與3株致病菌做體外拮抗試驗。結(jié)果顯示,乳酸菌R5和R6的抑菌能力最強,選取R5與丁酸梭菌D2研究其體外對致病菌的拮抗性能。體外拮抗研究表明,在72 h內(nèi)乳酸菌R5可將病原菌完全殺滅,而丁酸梭菌對3種致病菌也均有顯著抑菌作用。發(fā)現(xiàn)乳酸菌和丁酸梭菌在體外拮抗作用中均有顯著的抑菌作用,而乳酸菌R5的抑菌效果更好。本研究結(jié)果可為益生菌的應用提供理論依據(jù)。

    關鍵詞:益生菌;乳酸菌;丁酸梭菌;拮抗;腸道致病菌;共培養(yǎng)

    中圖分類號: S182? 文獻標志碼: A? 文章編號:1002-1302(2020)06-0151-05

    在禽類養(yǎng)殖行業(yè)中,抗生素一直是一種常用的飼料添加劑以防治禽類腸道疾病和促進生長,然而隨著抗生素的泛濫使用,也帶來了藥物殘留、病原微生物耐藥性增強和養(yǎng)殖環(huán)境惡化等負面影響[1]。益生菌以其成本低廉、效果好、綠色無害而備受青睞,可以減少抗生素施用甚至完全替代抗生素[2]。

    乳酸菌和丁酸梭菌是廣泛應用于禽類的益生菌,它們能夠通過多種機制對腸道屏障進行調(diào)節(jié)以抑制病原微生物在腸道內(nèi)定植和生長,有的還可以通過分泌抗菌物質(zhì)殺滅有害微生物,因此對細菌引起的腹瀉等疾病能起到良好的預防和治療作用[3]。

    本研究通過從無抗生素喂養(yǎng)的健康土雞腸道中分離出乳酸菌和丁酸梭菌,以從腹瀉病雞中分離的致病菌為指示菌,篩選出作用較強的益生菌,并研究體外共培養(yǎng)中對致病菌的殺滅作用,為益生菌的應用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種來源 益生菌分離自烏魯木齊南山某個體養(yǎng)殖戶無抗生素喂養(yǎng)的健康土雞;致病菌分離自某養(yǎng)殖場腹瀉的病雞。

    1.1.2 培養(yǎng)基 病原菌增菌培養(yǎng)基:NB和NA(固體);乳酸菌分離培養(yǎng)基:MRS瓊脂(添加0.75% CaCO3);乳酸菌增菌培養(yǎng)基:MRS肉湯;梭菌選擇培養(yǎng)基:TSN瓊脂;強化梭菌液體培養(yǎng)基:RCM培養(yǎng)基;大腸桿菌鑒別培養(yǎng)基:EMB瓊脂;沙門氏菌與志賀氏菌鑒別培養(yǎng)基:SS瓊脂;均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

    1.1.3 主要儀器設備 單人雙面凈化工作臺(SW-CJ-1F);恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-2102C);電熱恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250BF2);立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-75 SII);電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9070)。

    1.2 方法

    1.2.1 菌種分離

    1.2.1.1 致病菌的分離 將腹瀉病雞頸靜脈放血處死后,用無菌器械進行解剖,截取盲腸,取盲腸內(nèi)容物1 g,溶于9 mL 0.85%無菌生理鹽水,充分振蕩混勻后,取上清液1 mL依次稀釋至10-6,將10-5、10-6稀釋液取100 μL均勻涂布于SS平板和EMB平板,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h,EMB上挑選圓潤深紫色且有綠色金屬光環(huán)的菌落[4],SS平板挑取帶有黑點的透明菌落和透明或半透明的菌落[5],對菌落劃線純化后,進行生理生化檢測和16S rDNA鑒定。

    1.2.1.2 乳酸菌的分離 將土雞頸靜脈放血處死后,采用無菌器械對土雞進行解剖,剪下完整腸道,取盲腸內(nèi)容物1 g,稀釋方法同“1.2.1.1”節(jié),稀釋至10-7,取10-6、10-7的稀釋液100 μL均勻涂布于含有0.75% CaCO3的MRS平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,挑選有溶鈣圈且形態(tài)不一的菌落[6],劃線純化培養(yǎng)后,進行生理生化檢測和16S rDNA鑒定。

    1.2.1.3 丁酸梭菌的分離 取健康土雞腸道的小腸部分腸段,用無菌湯匙,刮取小腸黏液,溶于9 mL 0.85%無菌生理鹽水中,振蕩混勻后,于80 ℃水浴鍋中水浴10 min,以去除非芽孢細菌,稀釋方法同“1.2.1.1”節(jié),稀釋至10-3,取10-2和10-3稀釋液100 μL,均勻涂布于TSN平板[7],37 ℃厭氧培養(yǎng)至長出菌落,選取疑似丁酸梭菌的菌落,于RCM液體培養(yǎng)基內(nèi)富集培養(yǎng),選取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的菌液進行稀釋涂布純化,并進行生理生化檢測及16S rDNA的鑒定。

    1.2.2 平板打孔法抑菌試驗

    1.2.2.1 乳酸菌的抑菌試驗 將篩選到的乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)活化24 h,致病菌在普通液體培養(yǎng)基(NB)搖床培養(yǎng)16 h,取滅菌后的營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基冷卻至46 ℃左右,接入1%的致病菌,混勻后,無菌超凈工作臺下倒平板,待平板冷卻凝固后,用打孔器打孔,每個孔內(nèi)添加100 μL的乳酸菌菌液,常溫下靜置3 h后,置于37 ℃培養(yǎng)箱,過夜培養(yǎng)。測量每種乳酸菌的抑菌圈,選擇抑菌圈效果最明顯的菌株,用于后續(xù)共培養(yǎng)試驗。

    1.2.2.2 丁酸梭菌的抑菌試驗 將篩選到的丁酸梭菌接入RCM液體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基加滿至錐形瓶瓶口2~3 cm處,采用無菌石蠟-凡士林封口,靜置培養(yǎng)活化24 h,抑菌實驗方法同上。

    1.2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用IBM SPSS Statistics 22軟件分析,采用“x±s”表示。

    1.2.3 乳酸菌與丁酸梭菌生長性能和pH值的測定 將抑菌效果較好的乳酸菌與丁酸梭菌活化 24 h,分別接種于裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基和 10 mL RCM液體培養(yǎng)基試管各54支,RCM培養(yǎng)基接種完丁酸梭菌后,用滅菌的石蠟-凡士林封口,37 ℃ 靜置培養(yǎng),分別于0.0、0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、22.0、24.0、28.0、36.0、48.0 h時各取出3支,測定pH值和D600 nm值,采用Excel 2007軟件繪制生長曲線和pH值曲線。

    1.2.4 益生菌與致病菌的共培養(yǎng)試驗

    1.2.4.1 乳酸菌與致病菌的共培養(yǎng)試驗 將乳酸菌和致病菌活菌數(shù)目稀釋至同一數(shù)量級后,取裝有9 mL MRS液體培養(yǎng)基的無菌試管,以1/10接種量接入致病菌作為對照;另取裝有8 mL MRS液體培養(yǎng)基的無菌試管,其中3支以1 ∶ 1比例接入乳酸菌與致病菌各1 mL,每組3個重復,靜置培養(yǎng),每隔 24 h 取出致病菌純培養(yǎng)液,和致病菌與乳酸菌混合培養(yǎng)液,并用SS與EMB平板計數(shù),計算每支試管內(nèi)致病菌的活菌數(shù)。

    1.2.4.2 丁酸梭菌與致病菌的共培養(yǎng)試驗 丁酸梭菌與致病菌共培養(yǎng)的方法同“1.2.4.1”節(jié)。

    1.2.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用IBM SPSS Statistics 22軟件分析,并使用Excel 2007作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌種分離鑒定

    從健康土雞中分離出6株乳酸菌和1株丁酸梭菌,從腹瀉病雞腸道內(nèi)分離出3株致病菌。經(jīng)過生理生化檢測和16S rDNA分子鑒定后,3株致病菌分別為沙門氏菌、大腸桿菌和志賀氏菌;6株乳酸菌包括2株植物乳桿菌,1株糞腸球菌,1株乳酸片球菌,1株海氏腸球菌及1株腸膜明串球菌。16S rDNA鑒定結(jié)果及系統(tǒng)進化樹見表1和圖1。

    2.2 平板抑菌試驗

    6株乳酸菌和1株丁酸梭菌對大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的抑菌效果見表2。由表2可知,除R9菌株在大腸桿菌和沙門氏菌平板上無抑菌圈外,6株乳酸菌對3種致病菌均不同程度的抑菌效果;其中,R5和R6對3種致病菌的抑菌效果最好,具有顯著性差異(P<0.05)。而丁酸梭菌D2對3種致病菌的抑菌效果最弱,沒有明顯的抑菌圈。

    R9在大腸桿菌和沙門氏菌平板上沒有抑菌圈,但是對志賀氏菌卻有微弱的抑菌效果;R2菌株對3種致病菌都有抑菌能力,但是抑菌效果顯著弱于R3和R4(P<0.05);R3和R4之間的抑菌效果沒有明顯差異(P>0.05),它們對大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的抑菌效果較強;而R5和R6菌株對大腸桿菌和志賀氏菌的抑菌能力最強,具有顯著性差異(P<0.05),其中R5的抑菌圈直徑最大,分別達到8.33 mm和9.67 mm。

    對于大腸桿菌,抑菌效果最好的菌株為R5和R6,抑菌圈直徑分別為8.33 mm和8.00 mm;在沙門氏菌的抑菌試驗中,效果明顯較強的菌株為R3、R4、R5和R6,抑菌圈直徑分別為9.66、10.66、966、9.66 mm;對志賀氏菌抑制作用較強的菌株也是R5和R6,抑菌圈直徑分別為9.67、9.00 mm。因此,R5和R6針對3種致病菌的綜合效果更強于其他菌株。

    R5和R6菌株在培養(yǎng)過程中,因R5生長速率強于R6,因此取R5菌株用于后續(xù)共培養(yǎng)試驗。

    2.3 乳酸菌和丁酸梭菌的生長曲線、pH值曲線

    2.3.1 乳酸菌的生長曲線和pH值曲線 乳酸菌R5的生長曲線和pH值曲線見圖2。由圖2可知,0~2 h為該菌株的遲滯期,菌株的數(shù)目和pH值無變化,2 h后進入對數(shù)期,菌數(shù)目呈直線快速增長,由于菌數(shù)增多,產(chǎn)代謝物乳酸也越多,pH值隨之迅速下降,當pH值降低至3.8左右時,乳酸菌的生長由于酸抑制而停滯,在16 h后逐漸穩(wěn)定,到達穩(wěn)定期。

    2.3.2 丁酸梭菌的生長曲線和pH值曲線 丁酸梭菌D2的生長曲線和pH值曲線見圖3。由圖3可知,前4 h為丁酸梭菌的遲滯期,4 h后進入對數(shù)期,菌數(shù)快速增長,產(chǎn)生的酸性物質(zhì)越來越多,pH值快速下降至 4.7~4.8,菌數(shù)不再增長,12 h進入穩(wěn)定期。

    2.4 益生菌與致病菌共培養(yǎng)試驗

    2.4.1 乳酸菌分別與大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌體外共培養(yǎng)試驗 乳酸菌R5分別與大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的共培養(yǎng)體系中,大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的數(shù)量明顯下滑,與致病菌純培養(yǎng)對比極為明顯,具有極顯著差異(P<0.01);在 24 h 時,混合體系的致病菌已被乳酸菌R5抑殺了4個數(shù)量級;48 h時,大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌濃度已減少至100 CFU/mL左右;直至72 h,各混合體系中致病菌已被完全殺滅。從以上結(jié)果可發(fā)現(xiàn),乳酸菌R5分別和大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌 1 ∶ 1 共培養(yǎng),72 h內(nèi)可完全殺滅致病菌,體外抑菌作用很強(圖4)。

    2.4.2 丁酸梭菌分別與大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌體外共培養(yǎng)試驗 丁酸梭菌D2與大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌混合共培養(yǎng)時,D2雖然不能對大腸桿菌起到殺滅的作用,卻能明顯地抑制致病菌的生長速度。D2與大腸桿菌共培養(yǎng)24 h時,純培養(yǎng)對照組的大腸桿菌與混合體系中的大腸桿菌活菌數(shù)相差并不明顯,無顯著性差異(P>0.05);培養(yǎng) 48 h 時,2組中的大腸桿菌數(shù)已明顯相差2個數(shù)量級,差異極顯著(P<0.01);在72 h時,共培養(yǎng)體系中的大腸桿菌生長速度滯后于對照組(P<0.01)(圖5-a)。丁酸梭菌D2和沙門氏菌混合培養(yǎng)組與沙門氏菌單純對照組在72 h內(nèi)生長曲線相比,混合組的沙門氏菌生長明顯弱于對照組,2組沙門氏菌活菌數(shù)明顯相差1個數(shù)量級,在24、48 h均具有顯著性差異(P<0.05),而共培養(yǎng)72 h后,混合試驗組和對照組差異極顯著(P<0.01)(圖5-b)。D2與志賀氏菌共培養(yǎng)中,志賀氏菌的活菌數(shù)在平緩增長,生長趨勢明顯弱于志賀氏菌純培養(yǎng)對照組,在24、48、72 h均具有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明,丁酸梭菌的體外抑菌效果相比乳酸菌較弱,但對大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的生長趨勢,具有明顯的抑制作用。

    3 討論與結(jié)論

    乳酸菌和丁酸梭菌屬于動物腸道內(nèi)常見的益生菌,它們對于維持動物腸道微生態(tài)平衡、促進營養(yǎng)吸收和增強免疫系統(tǒng)能力都發(fā)揮著重要的作用。本研究中,從健康土雞腸道內(nèi)分離出的乳酸菌和丁酸梭菌對雞源性致病菌具有顯著的抑制作用。

    萬榮峰等的研究表明,3株乳酸菌分別與大腸桿菌體外共培養(yǎng),同時接菌時可在96 h內(nèi)殺滅所有大腸桿菌,提前接入乳酸菌后培養(yǎng)24 h,再接入病原菌,可在72 h內(nèi)將大腸桿菌完全殺滅[8]。陳丹等分

    離的干酪乳桿菌在與禽致病大腸桿菌體外拮抗研究中表明,96 h內(nèi)可完全殺滅致病菌,而在培養(yǎng) 24 h 前,混合組大腸桿菌的數(shù)目與對照組差異并不顯著[9]。本研究中,乳酸菌R5菌株與大腸桿菌 1 ∶ 1 同時接入,72 h時可殺滅所有大腸桿菌;混合組大腸桿菌在前24 h就呈現(xiàn)出極顯著差異(P<001),R5菌株對禽致病菌沙門氏菌和志賀氏菌的殺滅作用差異同樣極顯著(P<0.01),這說明本研究中分離的R5菌株在體外拮抗致病菌方面較強,具有進一步研究和應用的價值。

    謝樹貴等在酒窖底泥中分離出1株丁酸梭菌,對沙門氏菌和大腸桿菌共培養(yǎng)48 h后,均具有顯著的抑菌能力[10],而在本研究中,從腸道中分離的丁酸梭菌對大腸桿菌和沙門氏菌也有顯著的抑制作用,但相比于謝樹貴等分離的丁酸梭菌,抑菌效果一般,其原因可能是本試驗分離出的丁酸梭菌對酸抑制更為敏感。

    本研究中,從健康土雞腸道分離的乳酸菌和丁

    酸梭菌對致病菌均有一定的抑菌效果,其中乳酸菌72 h可完全殺滅致病菌,而丁酸梭菌則會通過阻礙致病菌的生長速度,抑制其快速生長,乳酸菌的抑菌效果明顯強于丁酸梭菌。

    后續(xù)研究需探討乳酸菌R5和D2抑菌作用機制和產(chǎn)酶特性研究。

    參考文獻:

    [1]潘淑勤,韓浩月,F(xiàn)ernando L,等. 抗生素的副作用及抗生素替代物[J]. 國外畜牧學(豬與禽),2018,38(1):43-45.

    [2]鄧澤元. 益生菌及其應用研究進展[J]. 乳業(yè)科學與技術,2018,41(1):26-32.

    [3]許 珂,魏 萍. 益生菌作用機制的研究進展[J]. 中國微生態(tài)?學雜志,2009,21(1):90-92.

    [4]米建華,于 波,王光寶. EMB瓊脂中伊紅美藍適宜配比的選擇[J]. 微生物學通報,1982,9(5):233-235.

    [5]楊更發(fā),魏蘭芬,許 激,等. 沙門氏菌-志賀氏菌培養(yǎng)基的質(zhì)量研究[J]. 預防醫(yī)學情報雜志,2000(1):54-55.

    [6]李明珠,李 輝,王 丹. 乳飲品中耐胃酸乳酸菌的分離鑒定與篩選[J]. 中國釀造,2014,33(9):42-44.

    [7]李圣杰,丁 軻,姜芳芳,等. 雞源高產(chǎn)淀粉酶丁酸梭菌的分離鑒定[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2015,42(11):3073-3079.

    [8]萬榮峰,江善祥. 3株乳酸菌體外拮抗致病性大腸桿菌試驗[J]. 畜牧與獸醫(yī),2007,39(3):50-52.

    [9]陳 丹,宋振輝,秦定紅,等. 一株干酪乳桿菌的分離鑒定及其對禽致病性大腸桿菌的拮抗作用[J]. 畜牧與獸醫(yī),2017,49(12):83-86.

    [10]謝樹貴,戴 青,趙述淼,等. 酒窖底泥中丁酸梭菌的分離及其特性研究[J]. 微生物學通報,2007,34(6):1047-1051.史榮華,周 揚,顏彩霞,等. 1例蛋雞腺病毒感染的診斷及對SPF雞的致病性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2020,48(6):156-159.

    猜你喜歡
    共培養(yǎng)乳酸菌益生菌
    禽用乳酸菌SR1的分離鑒定
    BMSCs-SCs共培養(yǎng)體系聯(lián)合異種神經(jīng)支架修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的研究
    益生元和益生菌促進豬生長和健康
    紫錐菊不定根懸浮共培養(yǎng)中咖啡酸衍生物積累研究
    益生菌別貪多
    幸福(2017年18期)2018-01-03 06:34:45
    神奇的小小腸道益生菌
    中國益生菌網(wǎng)
    乳酸菌成乳品市場新寵 年增速近40%
    角質(zhì)形成細胞和黑素細胞體外共培養(yǎng)體系的建立
    乳飲品中耐胃酸乳酸菌的分離鑒定與篩選
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:04
    一区二区日韩欧美中文字幕| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 十八禁高潮呻吟视频| 99热全是精品| av国产久精品久网站免费入址| 天堂8中文在线网| 精品第一国产精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产最新在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| a 毛片基地| 亚洲精品第二区| 水蜜桃什么品种好| 午夜激情av网站| 国产亚洲av高清不卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产在线一区二区三区精| 亚洲伊人色综图| 天天影视国产精品| 一区二区日韩欧美中文字幕| 黄片小视频在线播放| 久久久久精品人妻al黑| 欧美最新免费一区二区三区| 满18在线观看网站| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产熟女午夜一区二区三区| 成人国产麻豆网| 亚洲国产av新网站| 国产成人欧美在线观看 | 欧美成人精品欧美一级黄| 波多野结衣av一区二区av| 日本欧美视频一区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品一二三| 亚洲国产看品久久| 99久久人妻综合| 精品国产一区二区三区四区第35| 在线精品无人区一区二区三| 黄频高清免费视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 大香蕉久久成人网| 国产麻豆69| www.熟女人妻精品国产| 国产1区2区3区精品| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文字幕制服av| 久久久久久久大尺度免费视频| 高清在线视频一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区| 国产成人精品在线电影| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av中文av极速乱| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久综合国产亚洲精品| 超碰成人久久| 蜜桃国产av成人99| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 男女午夜视频在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产一卡二卡三卡精品 | bbb黄色大片| 亚洲综合色网址| 日韩成人av中文字幕在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 美女午夜性视频免费| 欧美最新免费一区二区三区| 18在线观看网站| 啦啦啦在线观看免费高清www| 色视频在线一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 另类精品久久| 国产深夜福利视频在线观看| 考比视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产黄频视频在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产欧美在线一区| 久久午夜综合久久蜜桃| 丝袜美足系列| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日本欧美视频一区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产欧美一区二区综合| 69精品国产乱码久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 在线观看免费高清a一片| av不卡在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 另类亚洲欧美激情| 五月开心婷婷网| 亚洲一区二区三区欧美精品| 色吧在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| www.自偷自拍.com| av视频免费观看在线观看| 国产在线免费精品| 国产福利在线免费观看视频| 日本wwww免费看| av天堂久久9| 久久久久精品性色| 国产精品蜜桃在线观看| 成年动漫av网址| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品自拍成人| 看非洲黑人一级黄片| 在线观看三级黄色| 日韩免费高清中文字幕av| 国产乱来视频区| 国产xxxxx性猛交| 99re6热这里在线精品视频| 看十八女毛片水多多多| 只有这里有精品99| 啦啦啦在线观看免费高清www| av卡一久久| 99久国产av精品国产电影| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成人免费观看视频高清| 国产精品一国产av| 欧美中文综合在线视频| 老司机亚洲免费影院| 中文字幕制服av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 91aial.com中文字幕在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 下体分泌物呈黄色| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 91精品三级在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 成人三级做爰电影| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 超碰成人久久| 老熟女久久久| 波野结衣二区三区在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日本wwww免费看| 多毛熟女@视频| 99九九在线精品视频| 麻豆乱淫一区二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 丝袜美腿诱惑在线| 日本午夜av视频| 狂野欧美激情性xxxx| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品国产色婷婷电影| 最近手机中文字幕大全| 久久人人97超碰香蕉20202| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产男女内射视频| 男女之事视频高清在线观看 | 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品国产三级专区第一集| 精品一区二区三区四区五区乱码 | av在线观看视频网站免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 高清不卡的av网站| 另类精品久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文欧美无线码| 午夜激情久久久久久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 丝袜喷水一区| 大香蕉久久网| 日韩伦理黄色片| 我的亚洲天堂| 亚洲精品第二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产免费福利视频在线观看| 极品人妻少妇av视频| 国产亚洲最大av| 99久国产av精品国产电影| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品99久久99久久久不卡 | 操出白浆在线播放| 黄色怎么调成土黄色| 成年人午夜在线观看视频| 国产野战对白在线观看| 大陆偷拍与自拍| 国产97色在线日韩免费| 毛片一级片免费看久久久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲第一青青草原| 国产伦人伦偷精品视频| 日本wwww免费看| 国产免费视频播放在线视频| 久久久久久久国产电影| 国产精品二区激情视频| 国产精品成人在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久热爱精品视频在线9| 午夜影院在线不卡| 大香蕉久久网| 日韩伦理黄色片| 日本爱情动作片www.在线观看| 蜜桃国产av成人99| 亚洲,欧美精品.| 男女边摸边吃奶| 欧美另类一区| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲国产精品999| 色精品久久人妻99蜜桃| 777米奇影视久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 乱人伦中国视频| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 热re99久久国产66热| 韩国精品一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 欧美日韩成人在线一区二区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 老司机在亚洲福利影院| 午夜福利一区二区在线看| 午夜日本视频在线| www.熟女人妻精品国产| 韩国av在线不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 男女下面插进去视频免费观看| 国产一区亚洲一区在线观看| www日本在线高清视频| 天天影视国产精品| 伊人亚洲综合成人网| av一本久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 男女无遮挡免费网站观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 不卡视频在线观看欧美| 国产 一区精品| 亚洲色图综合在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产亚洲欧美精品永久| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩电影二区| 中文天堂在线官网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 好男人视频免费观看在线| 国产精品久久久av美女十八| 天天添夜夜摸| 亚洲综合色网址| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美久久黑人一区二区| 一区二区三区激情视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久久久精品精品| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 最新在线观看一区二区三区 | 黑人猛操日本美女一级片| 国产乱来视频区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品一区二区在线观看99| 操出白浆在线播放| 精品国产国语对白av| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品视频女| 国产一区二区 视频在线| 亚洲在久久综合| 交换朋友夫妻互换小说| 国产亚洲最大av| 成年av动漫网址| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 在线看a的网站| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品第二区| 成年人免费黄色播放视频| 日韩伦理黄色片| 我要看黄色一级片免费的| 青春草视频在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲欧美激情在线| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩伦理黄色片| 婷婷色综合www| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成人毛片60女人毛片免费| 精品第一国产精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 色网站视频免费| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲三区欧美一区| 日本黄色日本黄色录像| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产片内射在线| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲国产欧美在线一区| 在线观看www视频免费| 亚洲成色77777| 精品久久久久久电影网| 五月天丁香电影| 蜜桃在线观看..| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 无限看片的www在线观看| 两个人免费观看高清视频| 免费观看a级毛片全部| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产 一区精品| 亚洲成人手机| 青春草视频在线免费观看| 午夜av观看不卡| xxxhd国产人妻xxx| 日日啪夜夜爽| 1024视频免费在线观看| 国产99久久九九免费精品| 丁香六月天网| 交换朋友夫妻互换小说| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av在线app专区| 51午夜福利影视在线观看| 国产一区二区 视频在线| 久久久久久人妻| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美在线一区亚洲| 中国国产av一级| 久久精品久久久久久久性| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品 欧美亚洲| 日韩一区二区三区影片| 久久久国产精品麻豆| 欧美中文综合在线视频| 免费看av在线观看网站| 香蕉丝袜av| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲国产成人一精品久久久| 天堂中文最新版在线下载| 天美传媒精品一区二区| 国产野战对白在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| a级片在线免费高清观看视频| 成人国产麻豆网| 日韩 亚洲 欧美在线| 黑丝袜美女国产一区| 91老司机精品| 秋霞伦理黄片| 少妇人妻 视频| 国产片特级美女逼逼视频| 黄色视频不卡| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久久久久精品精品| 搡老岳熟女国产| 美女主播在线视频| 好男人视频免费观看在线| 蜜桃在线观看..| 亚洲免费av在线视频| 一级a爱视频在线免费观看| 国产欧美亚洲国产| 亚洲成国产人片在线观看| 婷婷成人精品国产| 免费观看av网站的网址| 久久青草综合色| 一级爰片在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品久久久久成人av| 欧美日本中文国产一区发布| 午夜激情久久久久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 电影成人av| 国产av国产精品国产| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 99香蕉大伊视频| 最近的中文字幕免费完整| 丝袜美腿诱惑在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| avwww免费| 亚洲国产av影院在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 国产伦人伦偷精品视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 伊人久久国产一区二区| 国产极品天堂在线| 高清欧美精品videossex| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲精品乱久久久久久| 一级a爱视频在线免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产成人av激情在线播放| 天天影视国产精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 人成视频在线观看免费观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品免费视频内射| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品一区在线观看国产| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 日本欧美国产在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 性色av一级| 亚洲av日韩在线播放| 日日爽夜夜爽网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费高清在线观看日韩| 久久97久久精品| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99久久综合免费| 99国产精品免费福利视频| 精品一区在线观看国产| 国产日韩欧美亚洲二区| 又大又黄又爽视频免费| 性色av一级| 永久免费av网站大全| 人妻人人澡人人爽人人| www.av在线官网国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 青春草视频在线免费观看| 色吧在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 十八禁高潮呻吟视频| 香蕉国产在线看| 亚洲五月色婷婷综合| 满18在线观看网站| 丝袜美足系列| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 精品一区二区三卡| 日韩制服骚丝袜av| 久久人人爽人人片av| 免费观看人在逋| 在线观看免费高清a一片| 亚洲,欧美,日韩| www.精华液| 免费少妇av软件| 亚洲av男天堂| 欧美成人精品欧美一级黄| 麻豆av在线久日| 午夜91福利影院| 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品女同一区二区软件| 赤兔流量卡办理| 国产成人啪精品午夜网站| 一级爰片在线观看| 亚洲免费av在线视频| 18禁观看日本| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久久国产欧美日韩av| a 毛片基地| 看免费成人av毛片| 最近最新中文字幕免费大全7| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品av久久久久免费| 日日撸夜夜添| 国产乱来视频区| 亚洲七黄色美女视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 在线观看人妻少妇| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩欧美一区视频在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 9热在线视频观看99| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久影院123| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 91老司机精品| 久久久精品免费免费高清| 99热网站在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 午夜日本视频在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产成人精品福利久久| 女人精品久久久久毛片| 性色av一级| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲 欧美一区二区三区| 免费看不卡的av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在现免费观看毛片| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产精品国产三级国产专区5o| 中文字幕人妻丝袜制服| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久毛片免费看一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 考比视频在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲在久久综合| av一本久久久久| 国产在线一区二区三区精| 只有这里有精品99| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 大陆偷拍与自拍| 国产成人免费无遮挡视频| 国产午夜精品一二区理论片| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 丁香六月欧美| 宅男免费午夜| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲少妇的诱惑av| av福利片在线| 免费看av在线观看网站| 男女边摸边吃奶| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜福利在线免费观看网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲综合色网址| 搡老岳熟女国产| 亚洲成国产人片在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美激情高清一区二区三区 | videos熟女内射| 免费在线观看黄色视频的| 一区二区三区激情视频| 国产成人精品久久久久久| 精品国产国语对白av| videosex国产| av国产精品久久久久影院| 亚洲,欧美精品.| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲精品一二三| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲成人手机| 国产亚洲av高清不卡| 在线观看人妻少妇| 人妻一区二区av| 国产高清不卡午夜福利| 久久久国产精品麻豆| 欧美最新免费一区二区三区| 国产一区二区激情短视频 | 精品一区二区三区av网在线观看 | 天天操日日干夜夜撸| 亚洲精品国产av成人精品| 最近中文字幕2019免费版| 午夜日韩欧美国产| 亚洲成人av在线免费| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 色网站视频免费| 婷婷色综合www| 波野结衣二区三区在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久久国产一区二区| 久久狼人影院| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲成人一二三区av| 日本色播在线视频| 亚洲av综合色区一区| 只有这里有精品99| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久性视频一级片| 老司机影院成人| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品熟女久久久久浪| 精品福利永久在线观看| 在线 av 中文字幕| 一级片免费观看大全| 国产精品熟女久久久久浪| 国产成人精品无人区| 免费日韩欧美在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产亚洲av高清不卡| 国产黄频视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 精品国产一区二区久久| 日日啪夜夜爽| 精品一区二区免费观看| 亚洲成人免费av在线播放| 成年女人毛片免费观看观看9 | a级毛片在线看网站| 狂野欧美激情性bbbbbb|