巖藻多糖對染鉛大鼠體內(nèi)鉛及礦物質(zhì)元素含量的影響

高文靜1,2,逄 高3,郭瑩瑩2,*,王聯(lián)珠2,*,江艷華2,劉占濤

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島 266071; 3.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034; 4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東青島 266021)

鉛(Lead,Pb)是一種普遍存在的環(huán)境污染物,因其具有非生物降解性,可在環(huán)境和生物系統(tǒng)中持久存在和不斷蓄積[1]。鉛主要通過消化道和呼吸道進(jìn)入體內(nèi)并長期儲存,損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng),造血系統(tǒng)、肝臟和腎臟等,造成機體功能障礙[2]。目前,鉛中毒治療方式主要是利用螯合劑來促進(jìn)體內(nèi)鉛排出,臨床上常用的螯合劑如二巰基丁二酸(dimercaptosuccinic acid,DMSA)、依地酸(disodium edetate,EDTA)、青霉胺(penicillamine,DPA)等[3],研究發(fā)現(xiàn)螯合劑在排鉛的同時,其他人體必需元素也隨之排出[4]。此外,螯合劑主要用于急性鉛中毒,并不能完全修復(fù)鉛毒性造成的組織損傷,用量大時還可引起臟器損傷[5],不適用于長期低鉛暴露人群。因此,尋找安全有效防治鉛中毒的排鉛物質(zhì)具有重要研究意義。

巖藻多糖(Fucoidan)是一種獨特的結(jié)合有硫酸基團的水溶性多糖,又稱巖藻聚糖硫酸酯,褐藻糖膠,主要存在于褐藻中[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖具有抗凝、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等良好的生物活性[7-9],有望將其開發(fā)成新型藥物和營養(yǎng)保健食品。有研究表明,巖藻多糖對鉛中毒大鼠體內(nèi)的鉛有較好促排效果[10],但是,關(guān)于巖藻多糖對鉛毒性損傷機體內(nèi)礦物質(zhì)元素含量影響方面的研究還未見報道。因此,本研究利用巖藻多糖對鉛中毒大鼠進(jìn)行灌胃治療,探討其排鉛效果及對染鉛大鼠體內(nèi)礦物質(zhì)元素含量的影響,為后續(xù)開發(fā)巖藻多糖作為一種天然、安全、有效的鉛拮抗劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級健康SD大鼠 60只,雌雄各半,200～220 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證編號:SCXK(京)2-14-0004;巖藻多糖(純度≥98.3%) 山東潔晶集團股份有限公司;醋酸鉛(色譜純) 上海沃凱生物技術(shù)有限公司;濃硝酸(優(yōu)級純) 上海泰坦科技股份有限公司;高氯酸(優(yōu)級純) 天津市鑫源化工有限公司;二巰基丁二酸(DMSA,純度98%) 北京百靈威科技有限公司;實驗用水 均為超純水。

Optima 5300 DV全譜直讀等離子體發(fā)射光譜儀 美國鉑金艾爾默股份有限公司;DigBlock ED 54消化爐 北京萊伯泰科有限公司;Neofuge 15 R臺式高速冷凍離心機 上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;Vortex KB3漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;CPA 1003P電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;POSEZDON-R70超純水機 廈門銳思揭水純化技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖藻多糖急性毒性試驗 采用最大給藥量法[11],選擇健康SD大鼠20只,200～220 g,雌雄各半。試驗前以巖藻多糖最大給藥濃度(0.30 g/mL)及大鼠可承受的最大體積(1 mL/100 g)灌胃SD大鼠,稱取12 g巖藻多糖受試物,以蒸餾水為溶劑配成濃度為0.60 g/mL的混懸液,一次灌胃給予實驗動物,連續(xù)14 d,給藥后4 h內(nèi),每1 h觀察大鼠死亡情況,行為活動,精神狀態(tài)等,并記錄大鼠的毒性反應(yīng)、死亡情況。

1.2.2 動物分組及給藥方法 將SD大鼠飼養(yǎng)于SPF級實驗室,動物房溫度:22～26 ℃,濕度:40%～70%,人工晝夜:12 h/12 h;適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機分為:空白對照組、模型組、陽性藥物組(DMSA組)、巖藻多糖低、中、高劑量組,共6組,每組10只。

空白對照組灌胃自來水,以消除其余各組灌胃應(yīng)激反應(yīng)造成的影響。除空白對照組外,其余各組每日灌胃醋酸鉛溶液,劑量為5 mg/kg(以Pb2+計),連續(xù)灌胃4周,建立鉛中毒模型。第5周起,巖藻多糖低、中、高劑量組每日給予巖藻多糖混懸液灌胃,劑量分別為50、100、200 mg/kg;DMSA組灌胃DMSA溶液,每日灌胃劑量為25 mg/kg,連續(xù)灌胃3 d,停4 d,連續(xù)治療4周(同臨床);模型組及空白對照組灌胃等量自來水。各試驗組灌胃量均為0.5 mL/100 g。每周稱量大鼠體重,并根據(jù)體重調(diào)整灌胃劑量。

1.2.3 臟器系數(shù)測定 于末次給予動物受試樣品24 h(禁食不禁水)后,稱重,腹主動脈取血,用于全血中鉛、鈣、鋅、銅及鐵元素含量分析。處死大鼠后,快速分離股骨、肝臟、腎臟、腦各組織,稱重,計算臟器系數(shù)。

式(1)

1.2.4 鉛含量及鈣、鋅、銅、鐵元素流失率的測定 采用原子吸收光譜法檢測各組大鼠血液及各臟器中鉛含量[12]。電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)[13]檢測各組大鼠血液及各臟器中鈣、鋅、銅及鐵元素含量,并計算礦物質(zhì)元素流失率。

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻多糖急性毒性試驗

巖藻多糖最大給藥量3 g/kg下,灌胃給予受試物后,大鼠均未出現(xiàn)明顯中毒癥狀,14 d內(nèi)動物無死亡(表1),根據(jù)國際上公認(rèn)的食品安全毒理學(xué)評價程序[14]及急性毒性分類標(biāo)準(zhǔn),該巖藻多糖受試物樣品屬低毒或?qū)嶋H無毒物質(zhì)。

表1 急性毒性試驗結(jié)果Table 1 Results of acute toxicity test

2.2 大鼠臟器系數(shù)變化

由表2可知,與空白對照組對比,模型組大鼠肝臟、腎臟臟器系數(shù)極顯著升高(P<0.01),可能是鉛毒性造成染鉛大鼠肝臟、腎臟充血,腫脹。模型組大鼠腦組織臟器系數(shù)相較于空白對照組雖有所升高,但差異性不顯著(P>0.05),不具有統(tǒng)計意義。與模型組對比,高劑量巖藻多糖組肝臟、腎臟臟器系數(shù)顯著降低(P<0.05),表明高劑量巖藻多糖的攝入在一定程度上能緩解鉛毒性對肝臟、腎臟造成的毒性損傷。

表2 大鼠臟器系數(shù)(n=10)Table 2 Organ coefficient of rats(n=10)

表3 大鼠血液及各臟器中鉛含量((n=10)Table 3 Contents of lead in blood and organs of rats((n=10)

2.3 巖藻多糖對鉛中毒大鼠血液及各臟器鉛含量的影響

血液和器官中鉛含量的高低是判斷模型動物是否鉛中毒的主要指標(biāo)之一[15]。骨骼是鉛的儲存庫,體內(nèi)90%的鉛都沉積在骨骼[16],肝臟、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認(rèn)為是鉛產(chǎn)生毒害作用的主要靶器官,因而本研究以血液及股骨、肝臟、腎臟、腦組織為主要研究部位進(jìn)行探討。

由表3可知,與空白對照組相比,除腦組織外,模型組大鼠血液及各臟器中鉛含量極顯著升高(P<0.01),表明經(jīng)過為期一個月鉛染毒之后,鉛在大鼠體內(nèi)蓄積,分布規(guī)律為:股骨>腎臟>肝臟>血>腦,這與Lin等研究結(jié)果一致[17-18],同時說明本實驗造模成功。與模型組對比,各劑量巖藻多糖組大鼠各臟器中鉛含量均有所降低,其中中、高劑量巖藻多糖組大鼠肝臟、腎臟中鉛含量極顯著下降(P<0.01),表明巖藻多糖對染鉛大鼠有明顯的鉛促排效果,且各劑量巖藻多糖組大鼠股骨、肝臟、腦組織數(shù)據(jù)表明,其劑量與排鉛效果之間呈正相關(guān)性。與模型組對比,DMSA組大鼠血、肝臟、腎臟中鉛含量極顯著降低(P<0.01),表明DMSA具有較好排鉛效果,這與巖藻多糖排鉛效果一致,但DMSA對腎臟中鉛元素促排效果優(yōu)于各劑量巖藻多糖。

2.4 巖藻多糖對鉛染毒大鼠血液及各臟器中鈣、鋅、銅和鐵元素流失率的影響

鉛毒性造成的損害主要是由于它能在結(jié)合位點取代Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+等二價陽離子,破壞機體各種代謝途徑,導(dǎo)致細(xì)胞功能失常,并干擾細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)折疊、凋亡、酶調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等重要生物過程[19-20],因此,監(jiān)測生物體內(nèi)重要基本元素含量變化對評估鉛毒害造成的機體損傷具有重要意義。本研究通過檢測血液及靶器官中鈣、鋅、銅、鐵四種礦物質(zhì)元素含量,并計算元素流失率,以探討巖藻多糖對鉛染毒大鼠體內(nèi)四種礦物質(zhì)元素穩(wěn)態(tài)失衡的調(diào)節(jié)作用。

由圖1、圖2可知,與空白對照組對比,模型組大鼠骨、肝臟、腎臟、腦組織中銅元素及肝臟、腎臟中鋅元素流失嚴(yán)重,差異極顯著(P<0.01),表明鉛毒性造成大鼠機體內(nèi)鈣、鋅礦物質(zhì)元素穩(wěn)態(tài)失衡;與空白對照組對比,DMSA組大鼠肝臟、腎臟鈣元素與血、肝臟鋅元素流失嚴(yán)重,差異顯著(P<0.05),分別流失30.03%、28.72%和44.99%、26.41%,表明DMSA雖有排鉛效果但會造成機體臟器鈣、鋅元素不同程度的流失;與空白對照組對比,中、高劑量巖藻多糖組大鼠骨鈣、腦組織鋅元素流失較為嚴(yán)重,差異顯著(P<0.05),除骨中鈣元素和腎臟、腦組織鋅元素外,高劑量巖藻多糖組大鼠血液及各臟器中鈣、鋅元素含量與空白對照組對比無顯著差異,表明巖藻多糖可有效改善鉛中毒造成的大鼠血液及各臟器中鈣、鋅元素失衡,且其劑量越高對血液、股骨、肝臟及腦組織中鈣、鋅元素保護效果越好。

圖1 大鼠血液及各臟器中鈣元素流失率(n=10)Fig.1 Loss ratio of calcium in bloodand organs of rats(n=10)注:*與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;下同。

圖2 大鼠血液及各臟器中鋅元素流失率(n=10)Fig.2 Loss ratio of zinc in blood and organs of rats(n=10)

由圖3、圖4可知,與空白對照組對比,模型組大鼠血、腎臟銅元素及骨、肝臟、腎臟鐵元素含量極顯著降低(P<0.01),分別下降23.56%、58.72%和45.05%、45.75%、42.39%,說明鉛中毒會造成大鼠血液及臟器中銅、鐵元素嚴(yán)重流失。DMSA組大鼠除血鐵元素外其余各臟器部位元素含量與空白對照組比較均有所降低,其中以腎臟、腦組織中銅元素流失率最為嚴(yán)重,其含量與空白對照組對比差異極顯著(P<0.01),此外,骨中銅元素及腎臟、腦組織中鐵元素同樣流失嚴(yán)重,與空白對照組對比差異極顯著(P<0.01)。與空白對照組對比,模型組大鼠腎臟中銅元素上升9.14%,差異不顯著(P>0.05),表明鉛毒性未對大鼠腎銅穩(wěn)態(tài)造成不良影響,但鉛暴露后DMSA的攝入使得大鼠腎臟銅元素流失嚴(yán)重,下降54.46%。與空白對照組對比,各劑量巖藻多糖組大鼠肝臟、腎臟、腦組織中銅元素含量無明顯差異(P>0.05),不具有統(tǒng)計意義,各劑量巖藻多糖組大鼠各臟器中鐵元素流失率表現(xiàn)出不同程度降低。表明巖藻多糖可有效改善大鼠鉛中毒造成臟器中銅元素流失,對大鼠體內(nèi)各臟器銅元素穩(wěn)態(tài)平衡起到較好的保護作用,且其劑量越高對鉛中毒大鼠銅、鐵元素的保護效果越好。

圖3 大鼠血液及各臟器中銅元素流失率(n=10)Fig.3 Loss ratio of copper in blood and organs of rats(n=10)

圖4 大鼠血液及各臟器中鐵元素流失率(n=10)Fig.4 Loss ratio of iron in blood and organs of rats(n=10)

3 討論與結(jié)論

醋酸鉛灌胃劑量的選擇主要基于模擬低水平亞慢性鉛暴露模式,根據(jù)每日膳食暴露量與聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)規(guī)定鉛每日允許攝入量(allowable daily intake,ADI)值7 μg/kg及參考Sadykov等[21]醋酸鉛染毒劑量,選取5 mg/kg(以Pb2+計)為本研究染毒劑量。

本研究采用巖藻多糖作為解毒劑對鉛中毒大鼠進(jìn)行治療,參照巖藻多糖急性毒性實驗及Kim等[22]內(nèi)容確立巖藻多糖對大鼠無可見有害作用水平值(NOAEL),選用50、100、200 mg/kg為巖藻多糖劑量。巖藻多糖給藥治療后,染鉛大鼠各臟器中鉛含量均明顯下降,表明各劑量巖藻多糖均具有較好的鉛促排效果。王進(jìn)等[23]研究了巖藻多糖對鉛染毒大鼠生殖系統(tǒng)的影響,結(jié)果表明巖藻多糖能使附睪、睪丸指數(shù)降低情況得到改善(P<0.05),對生殖系統(tǒng)有保護作用,而本研究探究了巖藻多糖對鉛染毒大鼠主要靶器官(骨、肝、腎、腦)鉛清除效果,進(jìn)一步證明巖藻多糖是一種具有較好排鉛效果的天然提取物。DMSA組血液、腎臟、腦組織中銅元素含量與空白對照組對比差異極其顯著(P<0.01),尤其是腎臟中銅元素流失嚴(yán)重,可能是DMSA螯合了部分銅離子的緣故,表明DMSA雖有排鉛效果,可緩解鉛毒性造成損傷,但會造成機體血液及各臟器中礦物質(zhì)元素流失,損傷大鼠臟器,危害機體健康,這與Bradberry等[24]研究中DMSA對腎臟中鉛元素具有較高的清除率但會對腎臟造成損傷該結(jié)果一致。

鈣、鋅、銅、鐵作為二價陽離子,與鉛離子在體內(nèi)存在共同的靶位點和金屬酶,在機體吸收及代謝過程中存在相互競爭、拮抗的作用,影響彼此之間活性作用[25],鉛離子之所以相對于其他金屬離子有較強的替代能力,主要與鉛的離子特性有關(guān)[26]。Ghering等研究表明Pb2+的離子半徑、電負(fù)性均大于Ca2+、Zn2+,使其能夠以更強的親和力與蛋白質(zhì)位點結(jié)合[27]。Zakrgynska-Fontaine等[28-29]研究表明體內(nèi)鈣與鉛呈負(fù)相關(guān)性,過量鉛元素會影響銅、鋅和鐵的吸收,缺鐵和缺鈣又會促進(jìn)胃腸道對鉛的吸收,最終導(dǎo)致元素代謝失衡。Flora等研究表明鉛離子可通過取代Zn2+、Cu2+、Fe2+等抗氧化酶金屬結(jié)合位點,與酶的巰基基團結(jié)合,使酶失活,進(jìn)而誘導(dǎo)機體氧化應(yīng)激[30-31]。除腎臟中銅元素外,本研究模型組大鼠血液及各臟器中鈣、鋅、銅、鐵元素含量明顯低于空白對照組,推測是由于鉛離子通過競爭抗氧化酶金屬結(jié)合位點在機體內(nèi)蓄積,從而造成了機體損傷和各元素穩(wěn)態(tài)失衡。

巖藻多糖作為陰離子多糖可與陽離子聚合物發(fā)生交聯(lián)作用[32],Davis等[33]探討了褐藻作為金屬吸附劑的結(jié)合機制,巖藻多糖分子含有羧基、硫酸基等酸性官能團,能夠與Hg2+、Cr2+、Pb2+等二價重金屬發(fā)生螯合作用,是一種有效的生物吸附材料。Becker等[34]研究表明巖藻多糖可通過與鐵、鋅等重金屬形成金屬復(fù)合物從而抑制腸腔對重金屬的吸收。Ferreira等[35]研究表明巖藻多糖中硫酸基作為陽離子印記基質(zhì)對Pb具有很高的吸附性能和結(jié)合強度。本研究結(jié)果表明巖藻多糖對染鉛大鼠具有較好的促排效果,能有效改善染鉛所致大鼠體內(nèi)礦物質(zhì)元素流失,推測可能是巖藻多糖含有的羧基、硫酸基等官能團具有比巰基基團更強的鉛離子結(jié)合能力,使巖藻多糖競爭性螯合鉛離子,而后經(jīng)機體代謝排出體外,從而達(dá)到明顯的促排效果。目前關(guān)于巖藻多糖在生物體內(nèi)的鉛促排機理尚未明確,還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,本研究探討了巖藻多糖對鉛中毒大鼠體內(nèi)鉛及礦物質(zhì)元素鈣、鋅、銅、鐵含量的影響,結(jié)果表明巖藻多糖對鉛中毒大鼠體內(nèi)蓄積的鉛有較好的促排作用,同時還可有效緩解鉛毒性造成的體內(nèi)礦物質(zhì)元素穩(wěn)態(tài)失衡。該研究有望將巖藻多糖開發(fā)為一種促排鉛保健功能食品,不僅可以充分利用我國豐富的褐藻資源,加大褐藻資源開發(fā)利用的深度和附加值,而且為巖藻多糖功能活性的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。