殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的制備及免疫效果評價

何亞鵬，時曉，李博，魏凱，杜迎春

（北京市水生野生動植物救護(hù)中心，北京 102100）

殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida,As）屬于氣單胞菌屬，形態(tài)為短桿菌，革蘭氏染色陰性，其在淡水與海水環(huán)境中廣泛存在，之前研究認(rèn)為其不能在37℃生長，是嗜冷無動力型氣單胞菌，但近期的一些山羊和人類的病例表明其可能為人-畜-魚共患病原菌。目前已發(fā)現(xiàn)多個亞種，即典型亞種1種（殺鮭亞種），不典型亞種4種（無色亞種、殺日本鮭亞種、產(chǎn)果膠亞種及史氏亞種）。該菌最早由德國發(fā)現(xiàn)，歐洲、美洲、亞洲和非洲均有分布，是世界性的咸淡水養(yǎng)殖動物病原菌，主要引起16種鮭鱒魚類如各類大馬哈魚、細(xì)鱗鮭、大西洋鮭、虹鱒和河鱒等鮭鱒魚癤瘡病及潰瘍病，死亡率高；其宿主范圍也在不斷擴大，有引起金魚、鯉魚等鯉科魚類的潰瘍病和紅皮炎的報道，最近研究發(fā)現(xiàn)還可感染七鰓鰻科和鮨科魚類，如果任其流行蔓延不僅會危害我國鮭鱒魚、鯉科魚類等養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，還會進(jìn)一步威脅珍稀鮭鱒魚物種的生存，影響其救護(hù)和繁育工作的開展。針對我國冷水魚養(yǎng)殖和救護(hù)中癤瘡病及潰瘍病常發(fā)且危害嚴(yán)重的現(xiàn)狀，該研究制備殺鮭氣單胞菌滅活疫苗，進(jìn)行免疫效果評價試驗，取得了較好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

試驗用的細(xì)鱗鮭采集自本單位養(yǎng)殖區(qū)，由實驗室暫養(yǎng)。細(xì)鱗鮭體長為12 cm左右，體質(zhì)量為10 g左右，魚體體色正常、體表無損傷。試驗前放于室內(nèi)試驗箱中暫養(yǎng)2周，水溫控制在14℃左右，每天投喂2次商品化冷水魚飼料。

1.2 菌種來源

殺鮭氣單胞菌由北京市水生野生動植物救護(hù)中心分離自患疥瘡病魚并保存[1]。

1.3 滅活疫苗的制備

取凍存的的殺鮭氣單胞菌，接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)18 h后，觀察菌落正常。挑取單菌落接種于5 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中25℃、200 mg/L震蕩培養(yǎng)24 h。向已制備好的菌液中加入適量甲醛（終濃度為0.3%），37℃恒溫滅活48 h，涂板檢驗無活菌后，菌液離心收集菌體，用PBS洗滌菌體4次，洗去菌體中殘留的甲醛，最后將菌體用無菌PBS稀釋，分別加入適量不同佐劑，即制得殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗。采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌濃度為2.0×108CFU/mL，取弗氏佐劑與等量滅活菌懸液分別吸入2個注射器內(nèi)，排凈空氣，2個注射器之間以三通連接器相連，然后交替推動針管，進(jìn)行疫苗乳化，直至形成粘稠的乳劑，即為弗氏佐劑疫苗[2]。

1.4 免疫接種和血液采集

將細(xì)鱗鮭分為A、B、C三組，將濃度為1.0×108CFU/mL的弗氏佐劑疫苗、不加佐劑全菌滅活疫苗及PBS，采用腹腔注射方式分別進(jìn)行免疫細(xì)鱗鮭，A組為弗氏佐劑疫苗，B組為不加佐劑全菌滅活疫苗，C組為PBS，每尾200 μl，觀察1周內(nèi)魚的健康狀況及存活情況，進(jìn)行疫苗的安全性檢驗。確定疫苗安全后，同樣的方法將試驗魚分別免疫，于第1 d和注射后第7、14、21、28和 35 d 采血。每組隨機取 5 尾，尾柄靜/動脈采血，收集血清備用。

1.5 抗體效價測定

采用傳統(tǒng)的試管凝集法檢測血清抗體水平，觀察細(xì)菌的凝集程度，計算每組的平均值，作為結(jié)果[3]。

1.6 免疫保護(hù)率測定

進(jìn)行免疫28 d后，各組魚隨機取30尾，腹腔注射0.1 mL殺鮭氣單胞菌活菌液（1.0×108CFU/mL）進(jìn)行攻毒試驗，觀察記錄12 d內(nèi)的死亡情況。根據(jù)公式計算免疫保護(hù)率（Relative percent survival,RPS）∶RPS=[1－（免疫組死亡率/對照組病死率）]×100%[4]。

2 結(jié)果

2.1 抗體效價檢測結(jié)果

方法1.5中試管凝集法測得試驗組的抗體效價呈上升趨勢，弗氏佐劑組血清平均抗體效價在第1～28 d逐步上升，在28 d達(dá)到峰值，為1∶460.8，之后緩慢下降；不加佐劑組血清平均抗體效價于免疫后呈上升趨勢，在21 d達(dá)到峰值，為1∶281.6，之后緩慢下降；對照組無變化。

2.2 免疫保護(hù)率檢測結(jié)果

免疫28 d后，各免疫組和對照組細(xì)鱗鮭的累計死亡數(shù)見圖2。統(tǒng)計攻毒10 d后，弗氏佐劑組、不加佐劑組和對照組細(xì)鱗鮭的病死率分別為為13.3%、20%和76.7%，根據(jù)公式計算得出弗氏佐劑組和不加佐劑組的相對免疫保護(hù)率分別為82.7%和73.9%（表 2）。

表1 各免疫組魚血清凝集抗體效價的檢測

圖1 活菌攻毒后各組的累計死亡數(shù)

表2 活菌攻毒后各組的病死率和免疫保護(hù)力

3 討論

殺鮭氣單胞菌廣泛存在于水體環(huán)境中，該病原引起的疥瘡病和潰瘍病每年都會對相關(guān)行業(yè)造成很大損失，對冷水魚養(yǎng)殖行業(yè)和珍稀水生動物保護(hù)有較大的威脅。魚類疫苗發(fā)展較畜牧獸醫(yī)業(yè)晚，在生產(chǎn)中應(yīng)用的較多的仍是滅活疫苗。該殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的制備試驗利用甲醛制備殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗，試驗發(fā)現(xiàn)最低終濃度為0.3%甲醛可以將菌液完全滅活；免疫后弗氏佐劑組及不加佐劑組細(xì)鱗鮭的血清平均抗體效價于免疫后呈上升趨勢，弗氏佐劑組的抗體效價更高。隨后進(jìn)行免疫保護(hù)實驗，結(jié)果表明弗氏佐劑全菌滅活疫苗保護(hù)效果可達(dá)到82.7%，弗氏佐劑疫苗可以緩慢的釋放抗原，能夠使細(xì)鱗鮭產(chǎn)生較持久的免疫力，該試驗為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用殺鮭氣單胞菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。