大鼠頸動脈球囊損傷模型內(nèi)膜增生過程中連接蛋白的變化

潘樂門 陳帆風(fēng) 蘇翔 楊法鏡

血管內(nèi)皮損傷可誘導(dǎo)動脈內(nèi)膜增生，引起經(jīng)皮動脈腔內(nèi)治療術(shù)后的動脈再狹窄。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷時，血管平滑肌細(xì)胞可從中膜層向內(nèi)膜層遷移，并增殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成再狹窄性病變［1］。經(jīng)皮腔內(nèi)治療是針對動脈硬化狹窄疾病的重要治療方法，而腔內(nèi)治療面臨的主要問題在于如何保持術(shù)后的長期通暢率。據(jù)估計，近25%的動脈狹窄患者會在血管腔內(nèi)術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生再狹窄。內(nèi)膜增生導(dǎo)致的再狹窄問題，是影響動脈腔內(nèi)治療術(shù)后長期通暢率的重要因素［2］。因此，了解內(nèi)膜增生過程的機(jī)制對于控制術(shù)后再狹窄，改善腔內(nèi)手術(shù)效果非常重要。血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞之間的縫隙連接等細(xì)胞間通訊對血管壁的功能至關(guān)重要。在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中，在血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞之間的接觸點(diǎn)可以觀察到連接蛋白（connexin，Cx）表達(dá)的逐漸變化，并且在動脈粥樣硬化斑塊中可以檢測到連接蛋白表達(dá)模式的改變［3］。表明連接蛋白參與動脈粥樣硬化的發(fā)展，這種分子是否參與球囊損傷引起的內(nèi)膜增生和再狹窄的報道較少。在本研究中，通過球囊損傷后再狹窄模型來研究連接蛋白在內(nèi)膜增生過程中的作用，并初步探索其相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 模型建立 雄性SD大鼠（250±10）g購自北京生命之河實(shí)驗(yàn)動物有限公司，以標(biāo)準(zhǔn)的12h明暗循環(huán)進(jìn)行飼養(yǎng)。將48只大鼠隨機(jī)分為對照組（BI）和非損傷組（NI），每組各24只。對照組（BI）采用異氟醚麻醉大鼠，暴露左側(cè)頸總動脈，用近端和遠(yuǎn)端動脈夾暫時阻斷。將1.5mm球囊導(dǎo)管插入頸動脈并充氣至6atm，然后在短距離內(nèi)來回拉動3次，以產(chǎn)生內(nèi)皮損傷。非損傷組（NI）以假手術(shù)的大鼠為對照。皮下注射止痛藥和抗生素，恢復(fù)期常規(guī)監(jiān)測大鼠。

1.2 組織病理學(xué)評價 術(shù)后用4%多聚甲醛固定頸動脈，石蠟包埋，沿?fù)p傷段行連續(xù)切片（2μm），蘇木精-伊紅（H&E）染色檢測內(nèi)膜增生，利用NIH圖像處理系統(tǒng)獲得內(nèi)膜、中膜和管腔面積的定量。頸動脈切片進(jìn)行增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）染色。用微波加熱提取抗原，4%正常山羊血清加1%牛血清白蛋白（BSA）在PBS中進(jìn)行非特異性阻斷30min，然后用抗大鼠PCNA兔多克隆抗體（1∶100）孵育切片。二抗選用二氨基聯(lián)苯胺底物復(fù)合物酶標(biāo)染色進(jìn)行信號檢測。最后，用蘇木精對載玻片進(jìn)行復(fù)染和分析。

1.3 Western blot 頸動脈組織加入電泳緩沖液勻化，再經(jīng)電泳分離，轉(zhuǎn)膜固定后，加入1∶1000稀釋的Cx30、Cx37、Cx40、Cx43、ERK、Akt、（p）-ERK 和（p）-Akt的抗體在4℃孵育過夜，然后在室溫下加入二抗中進(jìn)一步孵育1h。用Image J軟件計算磷酸化與總蛋白表達(dá)的比率。

1.4 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)均用GraphPad Prism 6進(jìn)行定量分析，結(jié)果以（）表示，并采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，隨后進(jìn)行Tukey后檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連接蛋白的時間表達(dá) 在整個研究期間，BI和NI大鼠術(shù)后均保持健康，體重?zé)o明顯下降。兩組分別于術(shù)后6h、24h、7d、14d處死6只大鼠，進(jìn)行Cx30、Cx37、Cx40和Cx43的檢測。Western blot結(jié)果表明，隨著時間的推移，Cx37表達(dá)呈下降趨勢，Cx43表達(dá)呈上升趨勢，而Cx30和Cx40表達(dá)無顯著差異（見圖1）。結(jié)果表明，在四種連接蛋白中，只有Cx37和Cx43在球囊損傷后的整個過程中表達(dá)有明顯差異。

圖1 連接蛋白的時間表達(dá)情況。為Cx30、Cx37、Cx40和Cx43這四種連接蛋白在術(shù)后6h、24h、7d和14d等4個時間點(diǎn)的Western印跡分析

2.2 球囊損傷致新生內(nèi)膜形成 根據(jù)連接蛋白表達(dá)的結(jié)果，通過HE染色觀察術(shù)后第14天球囊損傷對新生內(nèi)膜形成的影響（每組6只）。在接受假手術(shù)的大鼠中未觀察到明顯的內(nèi)膜增生，而在BI組中發(fā)現(xiàn)顯著的內(nèi)膜增生（見圖2A）。定量形態(tài)計量學(xué)評估顯示，BI組的內(nèi)膜面積（見圖2B，P＜0.01）和內(nèi)膜-中膜（I/M）比值（見圖2E，P＜0.01）較NI組顯著增加，且BI組的管腔面積明顯低于NI組（見圖2D，P＜0.01），而兩組之間的內(nèi)外膜間的區(qū)域無顯著差異（見圖2C）。

圖2 球囊損傷促進(jìn)新生內(nèi)膜形成情況。（A）頸總動脈橫截面的典型H&E染色顯微照片。L：管腔；M：中膜；I：內(nèi)膜；N：新生內(nèi)膜。（B）內(nèi)膜面積的定量分析。（C）中膜面積的定量分析。（D）管腔面積的定量分析。（E）內(nèi)膜與中膜（I/M）比值的定量?！铩颬＜0．01

2.3 ERK和Akt表達(dá)上調(diào) ERK途徑和PI3K/Akt途徑被證實(shí)是新生內(nèi)膜形成的關(guān)鍵。在本研究中，總ERK、p-ERK、總Akt和p-Akt在BI大鼠中呈上調(diào)表達(dá)（見圖3A），與NI大鼠相比，Akt和ERK的磷酸化比率也呈上調(diào)表達(dá)（見圖3B，P＜0.01）。由此推測，Cx37和Cx43的表達(dá)可能通過ERK和Akt通路調(diào)節(jié)。

圖3 ERK和Akt的磷酸化水平。（A）Akt和ERK磷酸化水平的Western印跡分析，以β-肌動蛋白為對照。（B）Akt和ERK磷酸化水平的量化。通過比較Akt和ERK的磷酸化比率，可以發(fā)現(xiàn)球囊損傷組磷酸化水平顯著升高?！铩颬＜0．01。

3 討論

連接蛋白是縫隙連接的組成蛋白，而縫隙連接是一簇連接兩個細(xì)胞的通道，由連接蛋白體和半通道組成，分別來自于相連接的兩個細(xì)胞。這種細(xì)胞間的通道能夠促進(jìn)化學(xué)和電信號的傳播，對于血管的功能具有重要作用［4］。在21種已經(jīng)鑒定的連接蛋白中，血管內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)Cx37、Cx40和Cx43［5］。

在本研究中，Cx37和Cx43均參與了球囊損傷引起的內(nèi)膜增生，其機(jī)制可能與ERK和Akt通路的調(diào)節(jié)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明，機(jī)械損傷誘導(dǎo)的生長因子釋放可激活ERK級聯(lián)，使縫隙連接蛋白能參與組裝、分解、運(yùn)輸和降解的調(diào)節(jié)，以及縫隙連接通道的門控［6］。而Akt在內(nèi)膜增生過程中的作用則較少被討論。本研究提示ERK和Akt均參與調(diào)解內(nèi)膜增生，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

連接蛋白在不同組織中的不同表達(dá)模式表明，通過縫隙連接可能有分子運(yùn)動特異性。值得注意的是，Cx40/Cx43的表達(dá)率可以影響異質(zhì)/異型縫隙連接通道的特性。此外，連接蛋白的磷酸化可以調(diào)節(jié)連接通透性［7］。Cx37和Cx43的共表達(dá)、相互表達(dá)或磷酸化調(diào)節(jié)是否參與球囊損傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生尚需進(jìn)一步研究。

靜止的血管平滑肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行增殖和遷移是內(nèi)膜增生過程中的標(biāo)志性生物學(xué)事件，通常認(rèn)為這是由血管平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的縫隙連接通訊所調(diào)控的。因此，有必要深化對連接蛋白調(diào)控的研究。

雖然球囊損傷誘導(dǎo)內(nèi)膜增生的具體機(jī)制尚不清楚，但本研究提示ERK和Akt介導(dǎo)的下調(diào)Cx37和上調(diào)Cx43參與了這一過程。總之，球囊損傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生過程中，連接蛋白Cx37下調(diào)，Cx43上調(diào)，其機(jī)制可能與ERK和Akt的介導(dǎo)相關(guān)。