有氧運動與膳食干預(yù)經(jīng)miR-7/PDX-1/GLUT2-GCK對胰島功能的影響

王孝強(qiáng)，李 荀，曾凡星，李英杰

目前，糖尿病的發(fā)病率急劇升高，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計，在2017年全球糖尿病患者已達(dá)4.51 億，同時預(yù)計到2045年全球患病人數(shù)高達(dá)6.93億[1]。胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)。大量人體研究已證實，改善以運動和膳食為主的生活方式可以有效預(yù)防胰島素抵抗的發(fā)生和發(fā)展，并進(jìn)一步預(yù)防2型糖尿病的發(fā)病。

長期有氧運動可以促進(jìn)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[2-3]，除了因為長期有氧運動可以提高外周胰島素靶器官對胰島素的敏感性，改善全身胰島素效應(yīng)外，也與胰島β細(xì)胞的數(shù)量和功能改善有關(guān)[4]。miRNA-7（miR-7）由23個堿基組成，是胰島中表達(dá)最為豐富的miRNA[5]。已有研究證實[6-7]，miR-7可負(fù)向調(diào)控胰島β細(xì)胞功能，是葡萄糖刺激胰島素分泌（GSIS）的負(fù)調(diào)控因子。胰腺十二指腸同源框因子-1（PDX-1）是miR-7的靶基因，可以維持成熟胰島β細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，miR-7 可通過下調(diào)PDX-1 信號通路來調(diào)控β 細(xì)胞功能[8]。PDX-1對葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUT2）和葡萄糖激酶（gucokinase，GCK）具有轉(zhuǎn)錄控制作用[9-10]，兩者是胰島β細(xì)胞分泌胰島素功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，被稱為“葡萄糖感受器”。由此，我們提出疑問，長期有氧運動干預(yù)改善胰島β 細(xì)胞功能，其影響機(jī)制是否與miR-7/PDX-1/GLUT2-GCK 有關(guān)？據(jù)此，本研究旨在觀察長期有氧運動干預(yù)結(jié)合膳食干預(yù)對胰島素抵抗大鼠胰島miR-7/PDX-1/GLUT2-GCK以及分泌功能蛋白內(nèi)向整流鉀通道（KIR6.2）、突觸小體相關(guān)蛋白25（SNAP25）的影響，以探討miR-7在長期有氧運動與膳食干預(yù)在改善胰島功能中的作用，進(jìn)一步闡明長期有氧運動與膳食干預(yù)改善IR的中心機(jī)制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

7 周齡SPF 級雄性Sprague-Dawley 大鼠（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）100只，體重（228.7±8.9）g，于北京體育大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行飼養(yǎng)和訓(xùn)練，室內(nèi)溫度為20～24 ℃，相對濕度為45%～55%，間隔12 h循環(huán)照明，自由飲水、進(jìn)食。

1.2 實驗分組及干預(yù)方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)飲食組（n=20）和高脂飲食組（n=80）。標(biāo)準(zhǔn)飲食組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組采用高脂飼料（D12492；Fat 59.9%kcal，carbohydrate 20.1%kcal，Protein 20.0%kcal）喂養(yǎng) 10 周，以建立 IR 模型[11]。造模期間，每周日早8:00 監(jiān)測大鼠體重，造模第10 周時，剪尾取血測定空腹血糖（FBG）和空腹胰島素（FINS）。FBG 采用強(qiáng)生穩(wěn)豪倍易型血糖儀及配套試紙測定，F(xiàn)INS 采用大鼠胰島素ELISA 試劑盒（Mercodia公司）測定，通過穩(wěn)態(tài)模型評估法計算胰島素抵抗指數(shù)[Homa-IR=FPG（mmol/L）×FINS（μU/mL）/22.5]和胰島素敏感指數(shù)[Homa-ISI=l/（FPG×FINS）]，以確定IR模型建立成功[11]。

造模成功后，選取40 只IR 大鼠隨機(jī)分為4 組：高脂飲食安靜組（IRHC）、高脂飲食運動組（IRHE）、標(biāo)準(zhǔn)飲食安靜組（IRNC）和標(biāo)準(zhǔn)飲食運動組（IRNE）；標(biāo)準(zhǔn)飲食組大鼠隨機(jī)分為2組：運動組（NE）和安靜組（NC）。每組各10只。所有大鼠進(jìn)行跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練（跑臺速度由10 m/min 遞增至18 m/min，每次持續(xù)時間由20 min 遞增至60 min，跑臺坡度0%，共計5 天），休息2 他后，運動大鼠進(jìn)行中等強(qiáng)度跑臺運動[12]，跑臺速度為20 m/min，坡度0%，每次持續(xù)時間60 min，每周5天，運動8周。

1.3 組織取樣及處理

于第8 周末次運動后24 h 取材。取材前空腹12 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉。腹主動脈取血，常規(guī)處理后取血清。取胰島[13-14]，于-80 ℃保存，用于qRT-PCR 及Western blot測定。

1.4 空腹C肽測定

使用大鼠空腹C 肽ELISA 試劑盒（Mercodia 公司）測定，測定方法按說明書進(jìn)行操作。

1.5 qRT-PCR測定

采用實時熒光定量PCR方法對miR-7進(jìn)行測定。

（1）總RNA 提?。喝?00 mg 胰島，置于研缽內(nèi)在液氮環(huán)境下研磨成粉，采用miRcute miRNA 提取分離試劑盒（TIANGEN，DP501）。（2）總RNA濃度和純度測定：采用酶標(biāo)儀測定總RNA的濃度和純度。（3）RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取1μg總RNA，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（Thermo Scientific，USA），按照說明書步驟進(jìn)行操作。mRNA 采用Oligo（dT）18primer；miR-7及其對應(yīng)的內(nèi)參U6應(yīng)用特異性莖環(huán)引物，miR- 7：5’- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACA-3’；U6：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。（4）熒光定量PCR反應(yīng)：先將cDNA 稀釋10 倍。采用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Life Technologies Co.，USA）進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增反應(yīng)，按照說明書步驟操作。miR-7擴(kuò)增引物為Forward 5’-GCCGCCTGGAAGACTAGTGATTT-3’，Reverse 5’-ATCCAGTGCAGGGT CCGAGG-3’；U6 擴(kuò)增引物為Forward 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，Reverse 5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。（5）結(jié)果處理：基因表達(dá)量用2-△△CT法計算[15]，其中△△CT=（CT實驗組待測基因-CT實驗組參照基因）-（CT對照組待測基因-CT對照組參照基因）。

1.6 蛋白表達(dá)測定

采用Western Blot 方法測定PDX-1、GLUT2、GCK、KIR6.2、SNAP25 和 β-actin 蛋白表達(dá)。取約 100 mg 胰尾，研磨成粉，置于1 mLRIPA裂解液（含有蛋白酶抑制劑及PMSF）中，提取組織蛋白，并進(jìn)行蛋白濃度測定（BCA 法）。將樣品中加入5×loading buffer，充分混勻，100 ℃水浴中煮沸15 min。將樣本分別加入SDS-PAGE凝膠中，每孔20 μg樣本。采用恒壓電泳，濃縮膠90 V，30 min；分離膠120 V，60～90 min。在冰浴環(huán)境中將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，封閉，用一抗 PDX-1、GLUT2、GCK、KIR6.2、SNAP25、β-actin（Santa curz）4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，采用適宜濃度的相應(yīng)二抗（Merck Millipore 公司）室溫孵育1 h；TBST 洗膜后，與Super ECL 發(fā)光液（Thermo Scientific）反應(yīng)，使用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)及Image Lab 5.1 軟件進(jìn)行成像和分析。各待測蛋白的相對表達(dá)量為各組的蛋白表達(dá)量與安靜對照組的比值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，統(tǒng)計分析用SPSS16.0 軟件分析。造模期間，標(biāo)準(zhǔn)飲食組和高脂飲食組各指標(biāo)比較采用獨立樣本T檢驗。對干預(yù)后各組間體重比較采用協(xié)方差分析，對干預(yù)后各組間指標(biāo)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 方法。IRHC 組、IRHE 組、IRNC 組與 IRNE 組有氧運動和膳食的主效應(yīng)及兩者的交互作用分析采用雙因素單變量方差分析。P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有非常顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 IR模型的建立

與標(biāo)準(zhǔn)飲食組相比，高脂飲食組大鼠體重、空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)顯著升高，分別升高了13.4%（P＜0.01）、18.3%（P＜0.01）、31.9%（P＜0.01）和78.7%（P＜0.01）；胰島素敏感指數(shù)顯著下降，下降了14.6%（P＜0.01）（見表1）。

表1 造模10w結(jié)束時各組監(jiān)測指標(biāo)的變化Table1 The change of Monitoring Index in Each Group at the End of Modeling

2.2 大鼠體重的變化

經(jīng)過8周運動與膳食干預(yù)后，與NC組相比，NE組體重減少17.9%（P＜0.01）。與 IRHC 組大鼠相比，IRHE 組、IRNC 組和IRNE 組體重均顯著下降，分別下降20.0%（P＜0.01）、9.5%（P＜0.01）和23.8%（P＜0.01）。IRNE 組與IRHE 組相比下降了4.7%（P＜0.05），與IRNC 組相比下降了15.8%（P＜0.01）。IRHC 組、IRHE 組、IRNC 組與 IRNE 組 4 組進(jìn)行雙因素方差分析顯示，運動和膳食干預(yù)對體重均具有顯著性影響（P＜0.01，P＜0.01），運動和膳食干預(yù)對體重未呈現(xiàn)出顯著性交互作用（見圖1）。

圖1 各組大鼠體重的變化Figure1 The Change of Body Weight of Rat in Each Group

2.3 空腹C肽的變化

經(jīng)過8周運動與膳食干預(yù)后，與NC組相比，NE組大鼠空腹C 肽下降了26.7%（P＜0.05），IRHC 組升高了104.8%（P＜0.01）。與 IRHC 組相比，IRHE 組、IRNC 組和 IRNE 組大鼠空腹 C 肽均顯著下降，分別減少了42.6%（P＜0.01）、33.0%（P＜0.01）和55.1%（P＜0.01）。IRNE 組與IRHE 組相比下降了21.8%（P＜0.05），與IRNC 組相比下降了32.9%（P＜0.01）。IRHC 組、IRHE 組、IRNC組與IRNE組4組進(jìn)行雙因素方差分析顯示，運動和膳食干預(yù)對空腹C肽均具有顯著影響（P＜0.01，P＜0.01），且運動和膳食干預(yù)未呈現(xiàn)出顯著交互作用（P=0.059）（見圖2）。

2.4 miR-7的變化

經(jīng)過8 周運動與膳食干預(yù)后，與NC 組大鼠相比，NE 組miR-7 相對表達(dá)量升高了 39.6%（P＜0.05），IRHC 組下降了51.9%（P＜0.01）。與IRHC組相比，IRNC組、IRNE組miR-7相對表達(dá)量均顯著升高，分別增加了69.9%（P＜0.05）和161.4%（P＜0.01）；IRHE 組增加了 49.3%，但無顯著性差異。IRNE 組與IRHE 組增加了75.0%（P＜0.01），與IRNC 組相比增加了53.8%（P＜0.05）。IRHC組、IRHE組、IRNC組與IRNE組4組進(jìn)行雙因素方差分析顯示，運動和膳食因素對miR-7 相對表達(dá)量有顯著影響，且兩者不存在交互作用（見圖3）。

圖3 各組大鼠miR-7相對表達(dá)量的變化Figure3 The Change of miR-7 Expression of Rat in Each Group

2.5 PDX-1的變化

經(jīng)過8 周運動與膳食干預(yù)后，與NC 組大鼠相比，NE 組PDX-1蛋白相對表達(dá)量升高了33.0%（P=0.21），IRHC組升高了96.7%（P＜0.01）。與IRHC 組大鼠相比，IRNC 組、IRNE 組PDX-1 蛋白相對表達(dá)量均顯著下降，分別下降35.3%（P＜0.05）和48.7%（P＜0.01）；IRHE組下降了11.0%，但無顯著性差異。IRNE組與IRHE 組相比下降了42.4%（P＜0.05），與IRNC 組相比下降了 20.8%，但無顯著性差異。IRHC 組、IRHE 組、IRNC 組與IRNE組4組進(jìn)行雙因素方差分析顯示，膳食因素對PDX-1蛋白具有顯著影響（P＜0.01），而運動因素未呈現(xiàn)出顯著影響，且運動和膳食未呈現(xiàn)出顯著交互作用（見圖4）。

圖4 各組大鼠PDX-1蛋白表達(dá)及相對表達(dá)量的變化Figure4 The Change of PDX-1 Expression of Rat in Each Group

2.6 GLUT2、GCK的變化

與NC 組大鼠相比，NE 組GLUT2 蛋白相對表達(dá)量升高了29.1%（P=0.058）；IRHC 組下降了36.6%（P＜0.05）。與IRHC 組大鼠相比，IRNC 組GLUT2 蛋白相對表達(dá)量升高了65.3%（P＜0.05）；IRHE組、IRNE組分別升高了8.2%、42.1%（P=0.08），但無顯著差異。IRNE組與IRHE組相比升高31.7%，與IRNC組相比下降 13.6%，均無顯著性差異。IRHC 組、IRHE 組、IRNC 組與IRNE 組4 組進(jìn)行雙因素方差分析顯示，膳食因素對GLUT2 蛋白具有顯著性影響（P＜0.05），而運動因素未呈現(xiàn)出顯著性影響，且運動和膳食未呈現(xiàn)出顯著性交互作用（見圖5）。

與NC 組大鼠相比，NE 組GCK 蛋白相對表達(dá)量升高了8.9%，但無顯著性差異；IRHC 組下降了50.4%（P＜0.01）。與IRHC組大鼠相比，IRNC組、IRNE組GCK蛋白相對表達(dá)量均顯著升高，分別升高了76.0%（P＜0.05）和67.3%（P＜0.05）；IRHE組升高12.9%，但無顯著性差異。IRNE 組與IRHE 組相比增加48.2%（P=0.070），與IRNC 組相比無顯著差異。IRHC 組、IRHE組、IRNC組與IRNE組4組進(jìn)行雙因素方差分析顯示，膳食因素對GCK蛋白具有顯著性影響（P＜0.05），而運動因素未呈現(xiàn)出顯著性影響，且運動和膳食未呈現(xiàn)出顯著性交互作用（見圖5）。

圖5 各組大鼠GLUT2、GCK蛋白表達(dá)量的變化Figure5 The Change of GLUT2 and GCK Expression of Rat in Each Group

2.7 KIR6.2、SNAP25的變化

經(jīng)過8 周運動與膳食干預(yù)后，與NC 組相比，NE 組KIR6.2蛋白相對表達(dá)量升高27.3%（P=0.180）；IRHC 組下降36.6%（P＜0.05）。與 IRHC 組相比，IRNC 組、IRNE 組 KIR6.2 蛋白相對表達(dá)量均顯著升高，分別升高111.0%（P＜0.01）和72.0%（P＜0.05）；IRHE 組升高9.4%，但無顯著性差異。IRNE 組與IRHE組相比增加 57.8%（P＜0.05），與 IRNC 組相比下降 18.4%。IRHC 組、IRHE 組、IRNC 組與 IRNE 組 4 組進(jìn)行雙因素方差分析顯示，膳食因素對KIR6.2 蛋白具有顯著影響（P＜0.01），而運動因素未呈現(xiàn)出顯著影響，且運動和膳食未呈現(xiàn)出顯著交互作用（見圖6）。

與NC組相比，IRHC組SNAP25蛋白相對表達(dá)量顯著升高，增加了137.9%（P＜0.01）；NE 組升高了29.7%，但無顯著性差異。與 IRHC 組相比，IRNC 組、IRNE 組 SNAP25 蛋白相對表達(dá)量分別下降 40.2%（P＜0.01）和 58.4%（P＜0.01）；IRHE 組降低5.8%，但無顯著性差異。IRNE 組與IRHE 組相比下降55.8%（P＜0.01），與 IRNC 組相比下降 30.4%（P=0.055）。IRHC 組、IRHE 組、IRNC 組與 IRNE 組 4 組進(jìn)行雙因素方差分析顯示，膳食因素對SNAP25 蛋白具有顯著影響（P＜0.01），而運動因素未呈現(xiàn)出顯著影響，且運動和膳食未呈現(xiàn)出顯著交互作用（見圖6）。

圖6 各組大鼠KIR6.2、SNAP25蛋白表達(dá)量的變化Figure6 The change of KIR6.2 and SNAP25 expression of rat in each group

3 討 論

3.1 有氧運動與膳食干預(yù)對miR-7的影響

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，通過靶向降解mRNA或者抑制蛋白翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[16]。miRNA-7由23個堿基組成，主要在腦、脾臟、胰腺中高表達(dá)，是胰島中表達(dá)最為豐富的miRNA[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，miR-7可調(diào)控胰島β細(xì)胞功能，是葡萄糖刺激胰島素分泌的負(fù)調(diào)控因子。M.LATREILLE等[6]通過基因技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，敲除Mir7a2 基因小鼠可導(dǎo)致β細(xì)胞胰島素分泌增加，糖耐量改善，而在胰島β細(xì)胞miR-7a 過表達(dá)，胰島素分泌功能受損，β 細(xì)胞去分化，最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生；同時，通過MIN6細(xì)胞培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)，沉默miR-7a引起GSIS 增加，而過表達(dá)miR-7a 導(dǎo)致基礎(chǔ)胰島素分泌及GSIS 減少。研究者進(jìn)一步的在體研究發(fā)現(xiàn)，ob/ob 肥胖小鼠miR-7a 水平下降，db/db糖尿病小鼠miR-7a表現(xiàn)為先下降后增加。此外，研究者對小鼠體進(jìn)行高脂膳食喂養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在高脂膳食6周后，小鼠體重增加，血糖穩(wěn)定，空腹C肽水平增加，胰島功能處于代償期，此時胰島miR-7 水平下降約50%；隨時間延長，小鼠代謝機(jī)能下降，在高脂膳食10周后，血糖升高，空腹C肽水平較6周時顯著下降，胰島功能開始失代償，此時胰島miR-7 水平顯著上升。由此表明，miR-7對肥胖及糖尿病狀態(tài)下胰島β細(xì)胞機(jī)能適應(yīng)至關(guān)重要。本研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠進(jìn)行高脂膳食16 周后，體重增加，空腹C肽含量顯著升高，表明胰島功能處于代償階段，此時miR-7 表達(dá)量顯著下降，與前期研究結(jié)果一致。對胰島素抵抗大鼠進(jìn)行為期8 周的有氧運動及膳食干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，大鼠體重下降，空腹C 肽下降，表明有氧運動或/和膳食干預(yù)可改善胰島素抵抗大鼠高負(fù)荷的胰島功能，且膳食干預(yù)的效果要優(yōu)于運動干預(yù)；同時研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動或/和膳食干預(yù)后miR-7 表達(dá)量均有增加，兩者同時干預(yù)時增加最為明顯（與IRHC 組比較，增加161.4%），且膳食干預(yù)效果（與IRHC 組比較，增加69.9%）比運動干預(yù)（與IRHC 組比較，增加49.3%）更為明顯，由此也可解釋胰島素抵抗大鼠胰島細(xì)胞功能改善的原因。

3.2 有氧運動與膳食干預(yù)對PDX-1的影響

研究發(fā)現(xiàn)[8]，PDX-1是miR-7的靶基因之一。PDX-1在成熟胰島β細(xì)胞特異表達(dá)，是一種β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，通過翻譯后修飾調(diào)控β細(xì)胞生成、分化和凋亡，維持成熟胰島β細(xì)胞的正常形態(tài)和功能[17-18]。當(dāng)對正常成年小鼠阻斷PDX-1 表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)胰島素分泌能力下降、葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損[19]；當(dāng)對小鼠進(jìn)行PDX-1基因敲除（PDX-1+/-）后，發(fā)現(xiàn)小鼠糖耐量降低，并且胰島細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常、凋亡增加和數(shù)量減少[20]；經(jīng)過5 個月的高脂膳食喂養(yǎng)后，PDX-1+/-小鼠出現(xiàn)糖尿病癥狀[21]。提示，PDX-1 對于維持胰島細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過18 周的高脂膳食喂養(yǎng)后，大鼠空腹C 肽含量顯著升高，胰島PDX-1蛋白表達(dá)顯著增加，由此提示，高脂膳食干預(yù)通過調(diào)控PDX-1 表達(dá)以增加胰島素分泌。對胰島素抵抗大鼠進(jìn)行8 周的有氧運動干預(yù)后，PDX-1 蛋白表達(dá)有所下降（與IRHC 組比較，下降11.0），8 周的膳食干預(yù)使PDX-1 蛋白表達(dá)則顯著下降（與IRHC 組比較，下降35.3%）。表明，在2 種干預(yù)方式中，膳食因素是影響PDX-1蛋白表達(dá)的主要原因。兩者聯(lián)合干預(yù)時，PDX-1的蛋白表達(dá)下降更為明顯（與IRHC組比較，下降48.7%），其變化主要是由于膳食因素引起的。結(jié)合miR-7 的變化，表明有氧運動與膳食干預(yù)對胰島素抵抗大鼠胰島細(xì)胞功能改善可能是通過改善miR-7 的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控PDX-1來實現(xiàn)的。

3.3 有氧運動與膳食干預(yù)對GLUT2、GCK的影響

在成熟胰島β 細(xì)胞中，PDX-1 對重要的葡萄糖傳感調(diào)節(jié)因子如GLUT2 和GCK 具有轉(zhuǎn)錄控制作用[9-10]。GLUT2 是胰島β細(xì)胞主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，GCK是葡萄糖刺激β細(xì)胞胰島素分泌過程的限速酶，兩者被稱為“葡萄糖感受器”，是胰島β細(xì)胞分泌胰島素的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。在生理情況下，細(xì)胞膜上GLUT2將葡萄糖轉(zhuǎn)運至β 細(xì)胞內(nèi)，且轉(zhuǎn)運量與血糖濃度呈正比，隨即GCK將葡萄糖磷酸化成6-磷酸葡萄糖，隨后進(jìn)一步氧化代謝生成ATP，ATP/ADP 比值增加，誘導(dǎo)細(xì)胞膜上ATP 敏感的K+/ATP通道關(guān)閉，隨之鈣通道開放，細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度改變，引起胰島素的胞吐。因此，GLUT2和GCK同為細(xì)胞內(nèi)葡萄糖感應(yīng)器，共同作用以維持糖平衡。

研究發(fā)現(xiàn)[22]，大鼠高脂飲食8 周后，胰島β 細(xì)胞中GLUT2、GCK 蛋白表達(dá)顯著下降，表現(xiàn)出GSIS 受損及胰島素抵抗癥狀。本研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠高脂飲食18周后，空腹C肽顯著增加，胰島β 細(xì)胞中GLUT2、GCK 蛋白表達(dá)顯著下降。當(dāng)IR 大鼠進(jìn)行有氧運動8 周后，胰島β 細(xì)胞中GLUT2、GCK 蛋白表達(dá)有所增加（與IRHC 組比較，分別增加8.2%和12.9%）；當(dāng)膳食干預(yù)8周后，GLUT2、GCK 蛋白表達(dá)顯著增加（與IRHC 組比較，分別增加65.3%和76.0%）。表明，膳食因素是影響胰島β 細(xì)胞GLUT2、GCK 表達(dá)的主要因素。結(jié)合PDX-1 及miR-7 的變化，提示有氧運動與膳食干預(yù)可能是通過改善miR-7 的表達(dá)，進(jìn)而影響PDX-1的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控GLUT2和GCK信號，以改善胰島素抵抗大鼠胰島功能。

3.4 有氧運動與膳食干預(yù)對KIR6.2、SNAP25的影響

ATP敏感的K+/ATP通道是調(diào)控胰島β細(xì)胞分泌胰島素的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其中，KIR6.2是構(gòu)成該通道的亞基，起到重要的調(diào)控作用。當(dāng)血液中葡萄糖含量增加時，葡萄糖進(jìn)入β細(xì)胞，進(jìn)行氧化分解產(chǎn)生ATP，ATP與KIR6.2結(jié)合，誘導(dǎo)K+/ATP通道關(guān)閉，隨之鈣通道開放，引起胰島素的胞吐。研究發(fā)現(xiàn)，將胰島β細(xì)胞特異性敲除KIR6.2基因后發(fā)現(xiàn)，新生小鼠出現(xiàn)低血糖和高胰島素血癥，且胰島β 細(xì)胞發(fā)生凋亡，在出生4 周后胰島素分泌減少，血糖水平顯著升高[23]；而將胰島β細(xì)胞特異性過表達(dá)KIR6.2基因后發(fā)現(xiàn)，新生小鼠胰島β細(xì)胞形態(tài)及胰島素合成均正常，但表現(xiàn)出高血糖和低胰島素血癥，提示KIR6.2過表達(dá)對胰島素的外分泌過程起到抑制作用[24]。SNAP25在胰島β細(xì)胞中表達(dá)，屬于SNARE 蛋白超家族的成員之一，在胰島素分泌過程中發(fā)揮調(diào)控作用。對MIN6 細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)[25]，SNAP25 表達(dá)上調(diào)后，其基礎(chǔ)分泌能力也顯著增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠高脂飲食8周后，胰島β細(xì)胞KIR6.2表達(dá)顯著下降，SNAP25表達(dá)顯著升高，提示高脂膳食抑制胰島β細(xì)胞KIR6.2 表達(dá)、促進(jìn)SNAP25 表達(dá)，通過增加胰島素胞吐以抵消胰島素抵抗癥狀。對胰島素抵抗大鼠進(jìn)行8 周的膳食干預(yù)后，KIR6.2 表達(dá)顯著升高，SNAP25 表達(dá)下降，而8 周的運動干預(yù)對KIR6.2、SNAP25 表達(dá)無顯著影響。本研究同時對正常大鼠進(jìn)行8 周有氧運動干預(yù)，發(fā)現(xiàn)KIR6.2 及SNAP25 也未出現(xiàn)顯著性變化，這與M.TSUCHIYA 等[26]研究結(jié)果一致。其發(fā)現(xiàn)，正常大鼠進(jìn)行為期9周的中等強(qiáng)度有氧運動也并未改變胰島β細(xì)胞KIR6.2和SNAP25表達(dá)，并且胰腺重量及其胰島素含量也未有顯著變化。由此表明，運動干預(yù)對KIR6.2、SNAP25蛋白影響較小，而膳食干預(yù)對KIR6.2、SNAP25信號的影響更大。兩者聯(lián)合干預(yù)時，KIR6.2 表達(dá)顯著升高、SNAP25 表達(dá)顯著下降，其主要原因也是由于膳食的改善。表明，膳食干預(yù)通過上調(diào)胰島細(xì)胞KIR6.2蛋白、抑制SNAP25蛋白以增加胰島素的胞吐來改善胰島素抵抗大鼠胰島素分泌功能的。

4 結(jié) 論

長期有氧運動和/或膳食干預(yù)可降低胰島素抵抗大鼠空腹C肽含量，改善胰島分泌功能，其機(jī)制可能是通過下調(diào)miR-7表達(dá)，進(jìn)而改善PDX-1表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控GLUT2、GCK信號，并改善胰島β細(xì)胞胞吐功能來實現(xiàn)的。