清肺透邪方對(duì)肺炎支原體肺炎小鼠Notch信號(hào)通路的影響

魏巍， 王雪峰， 吳振起， 岳志軍， 張秀英， 王子，張童， 李慶煥， 赫昊， 邱功瀚， 楊東睿

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽 110032；3.石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北石家莊 050599）

風(fēng)溫之邪首見于《溫病條辨》，其是因冬季氣候異常，應(yīng)寒反暖，或春季氣候晴燥，溫風(fēng)過暖，形成風(fēng)熱之邪而發(fā)生溫病。病邪從口鼻、皮毛侵犯肺衛(wèi)，若邪熱入里，則見邪熱壅肺、熱結(jié)胃腸及氣分熱盛證，亦可逆?zhèn)餍陌霠I(yíng)入血或損傷肝腎之陰[1]。導(dǎo)師王雪峰教授在臨床上發(fā)現(xiàn)肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）的發(fā)病特點(diǎn)、感邪途徑及病程與風(fēng)溫發(fā)病相似，病理變化及臨床表現(xiàn)過程與風(fēng)溫之邪致病過程相符，認(rèn)為其病機(jī)為風(fēng)溫之邪內(nèi)伏于肺，肺氣閉塞，肺失宣肅，肺絡(luò)受損，進(jìn)而確立了清肺透邪之法，擬清肺透邪方，取得明顯療效。在本課題組前期研究中證實(shí)，清肺透邪方可以有效調(diào)控MPP 小鼠Th17/Treg 細(xì)胞以及IL-17、IL-10 因子的表達(dá)，減輕其炎癥反應(yīng)[2]。

研究表明，MPP 與肺炎支原體呼吸道上皮的粘附、肺炎支原體的直接損傷或間接損傷、呼吸窘迫綜合征（CARDS）毒素等引起的細(xì)胞損傷、免疫功能損害機(jī)制密切相關(guān)。其中免疫發(fā)病機(jī)制與T淋巴細(xì)胞關(guān)系密切。Notch 信號(hào)通路是調(diào)控胚胎發(fā)育和多種成體組織器官體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞分化的重要信號(hào)途徑，同時(shí)參與多種免疫細(xì)胞功能的調(diào)控[3]，于哺乳動(dòng)物各類免疫細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，尤其在T淋巴細(xì)胞發(fā)育與分化中發(fā)揮重要作用。已有相關(guān)研究證實(shí)MPP 患兒外周血中Notch1 受體mRNA表達(dá)高于健康兒童[4]。本研究以Notch 通路為切入點(diǎn)，觀察MPP小鼠肺組織Notch受體的蛋白及基因表達(dá)，探討清肺透邪方的作用機(jī)制，為臨床治療MPP 提供新思路及理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)SPF級(jí)BALB/c小鼠144只，4 ～6 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（20±3）g，購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXX（遼）2015-0001。飼料及墊料均購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病毒實(shí)驗(yàn)室，室溫20 ～22 ℃，濕度（50 ± 2）%，12 h/12 h 明暗周期的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)。每日更換墊料，提供充足的水和飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備清肺透邪方由炙麻黃、石膏、炙桑白皮、黃芩、麥冬、虎杖、蘇子、炒杏仁、桔梗等中藥組成。中藥材均購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局，為江陰顆粒劑。每付中藥中加入溫水（80 ～90 ℃）77 mL 混勻，使藥物濃度達(dá)到0.975 g/mL。將阿奇霉素片（利普奇）研磨，用溫水將其濃度調(diào)整為2.6 mg/mL。

1.3 主要試劑胎牛血清、PPLO培養(yǎng)基（美國(guó)BD公司）；青霉素（華北制藥股份有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）蛋白上樣緩沖液（1×）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、超敏電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（上海碧云天公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore公司）；蛋白marker（美國(guó)Thermo 公司）；羊抗兔二抗（美國(guó)Earthox 公司）；Notch1 抗 體、Notch2 抗 體、Notch3 抗 體（美 國(guó)Abcam 公司）；TRIzol、SYBR?Premix EX TaqTMⅡ200 Rxns、RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time 100 Rxns，日本TaKaRa公司）。

1. 4 主要儀器及設(shè)備EG1150 石蠟包埋機(jī)、RM2135 精密轉(zhuǎn)輪切片機(jī)、CF16RX11 低溫高速離心機(jī)、LEIT20-MIL倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；BX50F4 系統(tǒng)生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；ZMN-6802 烘漂處理儀（常州市華利電子公司）；A110132酶標(biāo)儀、Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；FlourChem Q 蛋白印記成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple 公司）；DNA測(cè)序儀（美國(guó)ABI 公司）；DU-600 蛋白核酸分析儀（美國(guó)Bechman 公司）；PE-9600 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）；LCII實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）；EPS-300 電泳儀及天能凝膠分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1. 5 肺炎支原體毒株及培養(yǎng)肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科吳振起主任提供，凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒室。將解凍的肺炎支原體接種至PPLO培養(yǎng)基中，并在37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和氮的厭氧培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)液顏色由紅變黃時(shí)進(jìn)行連續(xù)傳代，取第3代。以培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時(shí)的最高稀釋度作為顏色改變單位（colour change unite，CCU），取菌液濃度1×107CCU/mL 備用。

1.6 MPP小鼠模型構(gòu)建方法先將小鼠放置于含乙醚的麻醉缸中，待小鼠麻醉后取出，然后左手抓住小鼠的耳頸部及背部皮膚，使其頭部上揚(yáng)腹部朝上，右手持微量加樣槍向小鼠鼻腔緩慢接種肺炎支原體菌株，劑量為100 μL/只，連續(xù)接種3 d，并觀察7 d，建立MPP小鼠模型。造模方法參考前期相關(guān)研究[5]。

1. 7 分組與給藥將144 只幼齡BALB/c 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為6組，分別為正常組，模型組，西藥組，中藥大、中、小劑量組，每組24只。造模結(jié)束后，西藥組小鼠給予阿奇霉素片（劑量為2.6 mg/mL）灌胃5 d，5 d后繼續(xù)灌胃等體積生理鹽水，中藥組大、中、小劑量組分別予清肺透邪方顆粒劑（劑量分別為1.950 0、0.975 0、0.487 5 g/mL）灌胃，正常組與模型組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃。均每次0.2 mL，每日1次灌胃。共灌胃14 d。

1.8 觀察指標(biāo)與方法

1. 8. 1 取材 各組實(shí)驗(yàn)小鼠分別于給藥后第3、7、10、14天斷頸處死取材，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6 只，處死前4 h 禁食禁水。用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精噴灑消毒小鼠后，在無菌操作臺(tái)上用眼科剪子沿前正中線剪開腹、胸部皮膚，使其胸腔充分暴露，取出整個(gè)肺組織。將取出的肺組織用無菌生理鹽水洗凈表面血跡，用濾紙吸干殘留水分，將小鼠右側(cè)肺葉放入40 g/L多聚甲醛標(biāo)本瓶中4 ℃冰箱保存，用于病理切片蘇木素—伊紅（HE）染色；左側(cè)肺葉放入EP 管中暫存于-80 ℃冰箱，用于PCR及蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)。

1. 8. 2 小鼠肺組織HE 染色與病理學(xué)評(píng)分 將40 g/L 多聚甲醛固定的肺組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。并采用組織病理學(xué)評(píng)分系統(tǒng)[6]來評(píng)價(jià)，每張切片通過5個(gè)分類評(píng)價(jià)系統(tǒng)（細(xì)支氣管/支氣管腔周圍浸潤(rùn)的數(shù)目、細(xì)支氣管/支氣管腔周圍浸潤(rùn)的程度、細(xì)支氣管/支氣管腔內(nèi)滲出的嚴(yán)重度、血管周圍浸潤(rùn)的頻度、實(shí)質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重度）合并后進(jìn)行評(píng)分。

1.8.3 Western Blot法檢測(cè)肺組織Notch1、Notch2、Notch3 蛋白表達(dá) 用總蛋白提取試劑提取總蛋白，離心取上清液，-20 ℃冰箱中保存。BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用蒸餾水調(diào)整到統(tǒng)一濃度，提取液中加入5×SDS 上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，蛋白上樣，10% SDS- PAGE 分離，轉(zhuǎn)膜30 min，2% BSA 室溫封閉2 h。一抗室溫孵育2 h，4 ℃過 夜，TBST 每 次10 min 洗 膜（3次），二抗室溫孵育1 h，TBST 每次10 min 洗膜（3次）。ECL 發(fā)光，應(yīng)用Fluor Chem Q 凝膠成像系統(tǒng)采像、數(shù)據(jù)分析。

1.8.4 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)肺組織Notch1、Notch2、Notch3 mRNA表達(dá) 取肺組織制備細(xì)胞懸液，用TRIzol 提取細(xì)胞總RNA，分析RNA 的純度及完整性。檢測(cè)RNA 質(zhì)量合格后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，加入待測(cè)指標(biāo)的引物，進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。各引物由北京六合華大基因合成。Notch1上游引物序列為5’-GAGGGTTTCAAAGTGTCAGA-3’，下游引物序列為5’-CTCAGGTCAGGGAGAACTAC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度213 bp。Notch2 上游引物序列為5’-GATGC AAATGCCCAGGAC-3’，下游引物序列為5’-TGG AGGGCAGATTTTCCA-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度261 bp。Notch3上游引物序列為5’-CTTGGGAAATCTGCCTTAC-3’，下游引物序列為5’-CCAAGTGATCTGTGATCTCC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度183 bp。GAPDH 上游引物序列為5’-GGCATTGTGGAAGGGCTCAT-3’，下游引物序列為5’-GGCAGCACCAGTGGATGCAG-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度181 bp。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示，各組病理評(píng)分比較采用秩和檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)不同組別的Notch 含量比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)比較正常組：一般情況好，毛發(fā)有光澤，無豎毛，活動(dòng)自如，進(jìn)食及排便正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。模型組：從造模第3天開始部分小鼠出現(xiàn)較為明顯的癥狀，主要表現(xiàn)為精神萎靡，活動(dòng)減少，豎毛無光澤，喜蜷縮，呼吸短促，進(jìn)食及排便減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)速度減慢。西藥組、中藥大、中劑量組：給藥3 d后，小鼠癥狀均有不同程度的改善，活動(dòng)增多，毛發(fā)光澤較前改善，呼吸平穩(wěn)，進(jìn)食及排便增加。中藥小劑量組一般狀態(tài)與模型組相比，變化不大。

2.2 各組小鼠肺組織病理變化比較圖1 結(jié)果顯示：模型組氣管管壁及周圍間質(zhì)充血，肺泡、肺泡囊、肺泡隔等結(jié)構(gòu)不完整，肺泡間隔增厚，周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張，符合肺炎表現(xiàn)，西藥組、中藥大、中劑量組肺部炎癥癥狀較輕，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，肺組織實(shí)變不明顯，輕度肺間質(zhì)水腫，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和少量分泌物。中藥小劑量組肺泡結(jié)構(gòu)較完整，中度肺組織淤血、水腫，在細(xì)支氣管和血管周邊見有中等量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)。

2.3 各組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分比較表1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠肺組織病理學(xué)總分顯著增高（P ＜0.01），中藥大、中、小劑量組和西藥組小鼠肺組織病理學(xué)總分顯著降低（P ＜0.05或P ＜0.01），且中藥大劑量組效果更明顯。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化比較（HE染色，×40）Figure 1 Comparison of the pathological features of lung tissues in mice of various groups（by HE staining，×40）

表1 各組小鼠肺組織病理評(píng)分比較Table 1 Comparison of the scores of pathological features of lung tissues in mice of various groups （±s，s/分）

表1 各組小鼠肺組織病理評(píng)分比較Table 1 Comparison of the scores of pathological features of lung tissues in mice of various groups （±s，s/分）

①P ＜0.05，②P ＜0.01，與正常組比較；③P ＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組西藥組中藥大劑量組中藥中劑量組中藥小劑量組N/只10 10 10 10 10 10細(xì)支氣管/支氣管腔周圍浸潤(rùn)的數(shù)目0.17±0.41 1.83±0.98②1.50±0.55②1.00±0.00②1.67±0.52②1.17±0.41②細(xì)支氣管/支氣管腔周圍浸潤(rùn)的程度0.17±0.41 1.50±0.55②1.33±0.52②1.00±0.00②1.50±0.55②1.50±0.55②細(xì)支氣管/支氣管腔內(nèi)滲出的嚴(yán)重度0.17±0.41 1.33±0.52②1.17±0.75①0.33±0.52③1.00±0.00②1.33±0.52②血管周圍浸潤(rùn)的頻度0.33±0.52 1.33±1.03 1.00±0.63 0.33±0.82 0.17±0.41③0.83±0.41實(shí)質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重度0.00±0.00 1.17±0.75②0.83±0.41①0.17±0.41③0.83±0.41①0.83±0.41①總分1.50±2.74 12.83±5.34②10.83±4.58②5.50±2.51①③10.17±1.47②11.33±3.27②

其中，模型組小鼠肺組織細(xì)支氣管/支氣管腔周圍浸潤(rùn)的數(shù)目、細(xì)支氣管/支氣管腔周圍浸潤(rùn)的程度、細(xì)支氣管/支氣管腔內(nèi)滲出的嚴(yán)重度、血管周圍浸潤(rùn)的頻度、實(shí)質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重度較正常組顯著增加（P ＜0.01），中藥大劑量組小鼠肺組織細(xì)支氣管/支氣管腔內(nèi)滲出的嚴(yán)重度與實(shí)質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重度較模型組顯著降低（P ＜0.05）。

2. 4 各組小鼠肺組織Notch1、Notch2、Notch3 的蛋白相對(duì)含量比較圖2 及表2 ～4 結(jié)果顯示：肺炎支原體感染后，與正常組比較，模型組小鼠肺組織中Notch1、Notch2 的蛋白相對(duì)含量明顯增高（P ＜0.05）。給藥第3、7、10、14天，與模型組比較，中藥大、中、小劑量組肺組織Notch1、Notch2的蛋白相對(duì)含量和西藥組Notch2 的蛋白相對(duì)含量均降低（P ＜0.05），其中中藥大劑量組效果最明顯。各組Notch3 蛋白相對(duì)含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。重復(fù)測(cè)量比較不同時(shí)間點(diǎn)Notch1 蛋白相對(duì)含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），且含量與病程長(zhǎng)短成正比。

圖2 各組小鼠肺組織Notch1、Notch2、Notch3的蛋白表達(dá)情況Figure 2 Comparison of the protein expression levels of Notch1，Notch2 and Notch3 in mouse lung tissues of various groups

2. 5 各組小鼠肺組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA 表達(dá)水平比較表5 ～7 結(jié)果顯示：肺炎支原體感染后，與正常組比較，模型組小鼠肺組織中Notch1、Notch2 mRNA 表達(dá)水平明顯增高（P ＜0.05）。給藥第3、7、10、14 天，與模型組比較，中藥大劑量組Notch1、Notch2 及中藥中劑量組和西藥組Notch1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05），其中中藥大劑量組效果最明顯。各組Notch3 mRNA 表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。Notch1、Notch2、Notch3 mRNA表達(dá)在重復(fù)測(cè)量比較中，不同時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

表2 各組小鼠肺組織Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of the relative protein expression level of Notch1 in mouse lung tissues of various groups （±s，p）

表2 各組小鼠肺組織Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of the relative protein expression level of Notch1 in mouse lung tissues of various groups （±s，p）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較；③P ＜0.05，與中藥大劑量組比較

組別正常組模型組西藥組中藥大劑量組中藥中劑量組中藥小劑量組N/只10 10 10 10 10 10給藥第3天0.43±0.15 1.52±0.05①0.79±0.08①③0.45±0.12②0.67±0.16①②1.02±0.11①②③給藥第7天0.61±0.14 1.54±0.21①0.83±0.16①③0.65±0.12②0.83±0.24①②0.98±0.38①②③給藥第10 天0.29±0.08 1.92±0.65①0.82±0.08①③0.97±0.29②0.80±0.15①②1.36±0.26①②③給藥第14天0.89±0.05 2.38±0.39①1.00±0.19①③0.92±0.41②1.19±0.55①②1.48±0.30①②③

表3 各組小鼠肺組織Notch2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of the relative protein expression level of Notch2 in mouse lung tissues of various groups （±s，p）

表3 各組小鼠肺組織Notch2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of the relative protein expression level of Notch2 in mouse lung tissues of various groups （±s，p）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較；③P ＜0.05，與中藥大劑量組比較

組別正常組模型組西藥組中藥大劑量組中藥中劑量組中藥小劑量組N/只10 10 10 10 10 10給藥第3天0.55±0.06 1.12±0.06①0.89±0.15①②③0.44±0.07②1.01±0.15①②③0.74±0.30①②③給藥第7天0.27±0.16 1.15±0.36①0.54±0.16①②③0.09±0.08②0.44±0.16①②③0.68±0.28①②③給藥第10 天0.47±0.17 1.57±0.30①0.78±0.29①②③0.42±0.12②0.69±0.30①②③0.93±0.20①②③給藥第14天0.46±0.07 1.61±0.24①0.89±0.28①②③0.72±0.19②1.09±0.39①②③1.03±0.32①②③

表4 各組小鼠肺組織Notch3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the relative protein expression level of Notch3 in mouse lung tissues of various groups （±s，p）

表4 各組小鼠肺組織Notch3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the relative protein expression level of Notch3 in mouse lung tissues of various groups （±s，p）

組別正常組模型組西藥組中藥大劑量組中藥中劑量組中藥小劑量組N/只10 10 10 10 10 10給藥第3天0.59±0.08 0.55±0.12 0.49±0.06 0.39±0.04 0.45±0.09 0.57±0.26給藥第7天0.72±0.18 0.72±0.16 0.72±0.22 0.78±0.26 0.54±0.21 0.74±0.17給藥第10 天0.82±0.12 0.89±0.08 0.81±0.17 0.83±0.31 0.58±0.19 0.66±0.11給藥第14天0.58±0.12 0.54±0.21 0.60±0.09 0.51±0.23 0.65±0.19 0.61±0.13

表5 各組小鼠肺組織Notch1 mRNA表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of the mRNA expression level of Notch1 in mouse lung tissues of various groups （±s）

表5 各組小鼠肺組織Notch1 mRNA表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of the mRNA expression level of Notch1 in mouse lung tissues of various groups （±s）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較；③P ＜0.05，與中藥大劑量組比較

組別正常組模型組西藥組中藥大劑量組中藥中劑量組中藥小劑量組N/只10 10 10 10 10 10給藥第3天1.25±0.83 5.76±2.48①2.74±1.90①②1.71±0.91②2.47±1.43①②4.26±2.41①③給藥第7天1.16±0.66 5.16±2.37①2.49±1.56①②1.46±1.61②2.87±1.64①②4.11±1.90①③給藥第10 天1.14±0.62 7.00±5.94①2.67±2.13①②1.20±0.76②2.68±1.01①②4.21±0.83①③給藥第14天1.04±0.31 5.98±5.10①2.50±1.36①②1.49±0.55②2.87±2.43①②4.00±1.73①③

表6 各組小鼠肺組織中Notch2 mRNA表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of the mRNA expression level of Notch2 in mouse lung tissues of various groups （±s）

表6 各組小鼠肺組織中Notch2 mRNA表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of the mRNA expression level of Notch2 in mouse lung tissues of various groups （±s）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組西藥組中藥大劑量組中藥中劑量組中藥小劑量組N/只10 10 10 10 10 10給藥第3天1.60±1.63 2.72±2.95①1.81±1.75 1.79±0.33②1.89±1.80 2.01±1.05給藥第7天1.21±0.87 2.85±3.01①1.61±2.85 1.43±1.75②1.79±0.71 2.11±1.80給藥第10 天1.28±1.02 2.57±2.74①1.64±1.94 1.47±1.36②1.61±1.74 1.81±1.53給藥第14天1.15±0.68 2.77±1.93①1.76±1.67 1.22±0.88②1.69±2.08 2.00±1.79

表7 各組小鼠肺組織中Notch3 mRNA表達(dá)水平比較Table 7 Comparison of the mRNA expression level of Notch3 in mouse lung tissues of various groups (±s)

表7 各組小鼠肺組織中Notch3 mRNA表達(dá)水平比較Table 7 Comparison of the mRNA expression level of Notch3 in mouse lung tissues of various groups (±s)

組別正常組模型組西藥組中藥大劑量組中藥中劑量組中藥小劑量組N/只10 10 10 10 10 10給藥第3天1.12±0.56 1.45±0.45 1.63±0.86 1.37±1.88 1.48±1.03 1.65±1.98給藥第7天1.10±0.51 1.82±1.83 1.47±0.76 1.35±1.55 1.63±1.39 1.18±0.79給藥第10 天1.26±0.95 1.59±0.27 1.57±0.56 1.29±0.73 1.46±0.53 1.42±0.73給藥第14天1.04±0.31 1.61±1.43 1.49±0.84 1.17±1.10 1.32±1.08 1.51±0.98

3 討論

肺炎支原體肺炎（MPP）是一種兒童常見的病程長(zhǎng)、病情重、易反復(fù)發(fā)作的肺部疾病，可以出現(xiàn)多系統(tǒng)的肺外并發(fā)癥，累及心血管、神經(jīng)、消化、血液、肌肉骨骼等多個(gè)系統(tǒng)[7]，使病程延長(zhǎng)，病情加重，甚至死亡。中醫(yī)學(xué)并無“肺炎支原體”之說，而是將其引起的MPP 納入“喘嗽”的范疇[8]，認(rèn)為其主要的病因病機(jī)為外邪侵襲肺衛(wèi)，肺失宣降，肺衛(wèi)郁閉，導(dǎo)致肺氣上逆，從而表現(xiàn)出發(fā)熱、咳嗽、氣促、喉間痰鳴等癥狀[9]。因其具有一定的流行性和傳染性，中醫(yī)又將其歸為“溫病”的范疇[10]。

王雪峰教授根據(jù)MPP 致病特點(diǎn)、感邪途徑、病程，以“清解肺熱，開閉透邪”為治則擬定清肺透邪方。該方以麻黃、石膏、桑白皮、黃芩共為君藥，桑白皮、黃芩、石膏清解肺胃之熱，麻黃開閉透邪，清中寓透，透中有清，使邪熱得出，風(fēng)溫之邪得解；以麥冬、虎杖共為臣藥，虎杖止咳化痰，活血化瘀，既入氣分又可入血分，兼有清氣涼血活血之長(zhǎng)，同時(shí)能利小便通腸腑，導(dǎo)濕熱痰火下趨，麥冬清肺生津，使肺熱清而不傷陰；杏仁、蘇子降氣共為佐藥，氣降則熱自消，桔梗載諸藥上行為使，一上一下，使肺氣通而咳喘止。本方清透與清潤(rùn)并用，透邪與通絡(luò)并舉，以清肺透邪為主，共同發(fā)揮止咳退熱的功效。

本研究成功地對(duì)肺炎支原體進(jìn)行傳代并構(gòu)建出MPP小鼠模型。結(jié)果顯示，模型組從造模第3天開始部分小鼠出現(xiàn)較為明顯的MPP 癥狀，經(jīng)藥物干預(yù)后，西藥組、中藥大劑量組、中藥中劑量組小鼠MPP 癥狀均有不同程度的改善，表明阿奇霉素、清肺透邪方對(duì)MPP 有明顯療效，且清肺透邪方療效呈時(shí)間、劑量依賴性。

Notch 信號(hào)通路主要包括4 種受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）和5 種 配 體（Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3、Delta4）[11]，主要在正常機(jī)體的細(xì)胞識(shí)別、凋亡、增殖和分化中起重要作用。目前，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞免疫及呼吸道疾病中也發(fā)揮了重要作用[12]，可影響免疫細(xì)胞的分化發(fā)育，主要針對(duì)T 淋巴細(xì)胞，參與抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[13-14]，調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th1/Th7 的平衡[12]。不同的Notch 信號(hào)傳導(dǎo)可能指導(dǎo)不同的Th 細(xì)胞增殖。Notch3 和Delta1/4 配體相互作用有助于向Th1的發(fā)育[15-17]，Notch1 受體和Notch2 受體在與Jagged配體作用后可誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞發(fā)育[18-20]。研究表明Notch1 直接與RORγt 和IL-17 啟動(dòng)子結(jié)合并調(diào)節(jié)Th17 分 化[21]。MPP 的 發(fā) 病 與Th1/Th2 失 衡、Treg/Th17失衡密切相關(guān)，而Notch通路對(duì)MPP的發(fā)病有重要意義[4，22]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織Notch1、Notch2蛋白及mRNA表達(dá)水平均較正常組不同程度地上調(diào)，中藥大、中劑量組和西藥組均可有效降低Notch1、Notch2蛋白及mRNA表達(dá)水平，且清肺透邪方療效呈時(shí)間、劑量依賴性。但Notch3 各組分布差異不顯著，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，清肺透邪方可抗肺炎支原體感染，其機(jī)制可能與抑制Notch 信號(hào)通路中Notch1、Notch2的表達(dá)從而調(diào)控免疫平衡有關(guān)。