大黃治療慢性腎衰竭的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制

李林， 孫曉靜， 孫治中， 陳曦霞， 張玲， 曾笑晴， 湯水福， 程德金

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，廣東廣州 510400；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006）

流行病學(xué)顯示，慢性腎臟病的發(fā)病率約為10.8%[1]。慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是在各種慢性腎臟病基礎(chǔ)上緩慢出現(xiàn)腎功能進行性減退直至衰竭的一種臨床綜合征，屬于中醫(yī)學(xué)“溺毒”“癃閉”“關(guān)格”“腎勞”“虛勞”等病證的范疇。目前，西醫(yī)治療慢性腎衰竭主要以治療原發(fā)病及并發(fā)癥為主，對于進行至終末期腎病的患者，一般采用腎臟替代療法。中醫(yī)藥在治療慢性腎衰竭方面有明顯的優(yōu)勢，中藥大黃在治療慢性腎衰竭方面尤為突出[2-3]。然而，目前對于單味中藥大黃治療慢性腎衰竭的具體機制尚不明確，因此，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從分子水平預(yù)測大黃治療慢性腎衰竭的作用機制，以期為下一步深入研究提供參考和指導(dǎo)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分的獲取以“大黃”為檢索詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索其化學(xué)成分，將口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩查出符合條件的活性成分，點擊其成分的詳細信息，保存活性成分的2D結(jié)構(gòu)。

1.2 預(yù)測大黃相關(guān)靶點從Pubchem 數(shù)據(jù)庫中檢索篩選出大黃的活性成分，找出它們對應(yīng)的smile號，保存為SDF文件，上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），基于反向分子對接原理，依據(jù)各成分的2D/3D結(jié)構(gòu)進行靶點預(yù)測，得到大黃的預(yù)測靶點。

1.3 慢性腎衰竭相關(guān)靶點的獲取及與大黃預(yù)測靶點的映射以“chronic renal failure”為檢索詞，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取慢性腎衰竭相關(guān)靶點。將大黃的預(yù)測靶點與慢性腎衰竭相關(guān)靶點進行映射，得到大黃治療慢性腎衰竭的預(yù)測靶點。

1. 4 蛋白與蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過String 數(shù)據(jù)庫設(shè)定物種為“Homo snpiens”獲取全部蛋白—蛋白相關(guān)作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件，生成背景網(wǎng)絡(luò)。在背景數(shù)據(jù)庫選中上述映射得到的大黃作用于慢性腎衰竭的靶點，并找到與其直接相連的節(jié)點，作為大黃治療慢性腎衰竭的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1. 5 Hub 網(wǎng)絡(luò)的提取通過Cytoscape 3.6.0 軟件Tools 模塊中的NetworkAnalyzer-Network Analysis-Analyze Network 進行網(wǎng)絡(luò)分析獲取相關(guān)拓撲參數(shù)，選取節(jié)點連接度（degree）的二倍中位數(shù)、節(jié)點介度（betweenness）和節(jié)點緊密度（closeness）的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，提取出Hub網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體論（GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析應(yīng)用Cytoscape 3.6.0 軟件中ClueGO 插件， 選擇生物進程（Biological Process），對Hub網(wǎng)絡(luò)中的靶標(biāo)進行GO富集分析。通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站對上述分析結(jié)果進行KEGG通路分析并進行篩選，得到顯著富集（P ＜0.01）的通路，并按照gene數(shù)從大到小排序。結(jié)合文獻檢索，篩選出治療慢性腎衰竭的可能通路，找到其通路上的相關(guān)靶標(biāo)，結(jié)合大黃的活性成分，構(gòu)建出“大黃活性成分—慢性腎衰竭靶標(biāo)—KEGG通路”的網(wǎng)絡(luò)圖。選取gene 數(shù)排名前20 的通路，使用OmicShare 網(wǎng)站（http：//www.omicshare.com/tools/）繪 制 通 路 氣 泡圖。

2 結(jié)果

2.1 大黃活性成分本研究將OB ≥30%、DL ≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩選出活性化合物16種，化合物名稱、相關(guān)參數(shù)及化學(xué)結(jié)構(gòu)式見表1。

2.2 大黃預(yù)測靶點以及活性成分—慢性腎衰竭靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建從SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中篩選出16 種活性化合物對應(yīng)的240 個靶點，再依據(jù)成分的2D/3D結(jié)構(gòu)進行靶點預(yù)測，篩選出122個靶點作為大黃的預(yù)測靶點。將所得的大黃預(yù)測靶點與GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取的6 329 個慢性腎衰竭相關(guān)靶點相映射，最后篩選出大黃可能與慢性腎衰竭相關(guān)的靶點93 個。在Cytoscape 3.6.0 軟件中導(dǎo)入大黃的活性成分與慢性腎衰竭相關(guān)的靶點，構(gòu)建大黃活性成分—慢性腎衰竭靶點網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。

表1 大黃活性成分Table 1 The data of the active components of Radix Et Rhizoma Rhei

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將93 個大黃可能與慢性腎衰竭相關(guān)的靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫蛋白—蛋白相關(guān)作用關(guān)系，通過Cytoscape 3.6.0 軟件，形成大黃治療慢性腎衰竭的PPI 網(wǎng)絡(luò)。見圖2。圖中節(jié)點大小是按degree值的大小形成，degree值越大，節(jié)點越大。

圖1 大黃活性成分—慢性腎衰竭靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Radix Et Rhizoma Rhei active components-CRF targets network

圖2 大黃治療慢性腎衰竭的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of Radix Et Rhizoma Rhei treatment for CRF

2.4 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取及Hub中的靶標(biāo)選取degree的二倍中位數(shù)、betweenness 和closeness 的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，通過Cytoscape 3.6.0 軟件得到Hub中的靶標(biāo)，即大黃治療慢性腎衰竭的關(guān)鍵靶點，提取出Hub 網(wǎng)絡(luò)。見圖3。圖3 中黃色示大黃和慢性腎衰竭相關(guān)的靶點，紅色示大黃和慢性腎衰竭相關(guān)的靶點在人類基因庫中直接相關(guān)的靶點。關(guān)鍵靶點共30 個，按照degree 值從大到小排序分別為：SRC、ESR1、CSNK2A1、FYN、AR、CASP3、GRB2、 TP53、 LCK、 LYN、 STAT3、 MAPK1、PIK3R1、 CREBBP、 EP300、 SHC1、 EGFR、PRKCA、SMAD3、STAT1、PTPN11、BCL2、PLCG1、NR3C1、ABL1、JUN、CSNK2A2、MAPK3、AKT1、RELA。

2.5 GO富集分析應(yīng)用Cytoscape 3.6.0中ClueGO插件，進行GO 富集中的BP 分析，得到11 個功能組別（見圖4）以及其占比餅狀圖（見圖5）。

2. 6 KEGG 通路分析通過KEGG 通路分析得到122條通路，結(jié)合文獻檢索，篩選出治療慢性腎衰竭的可能通路為20 條，繪制通路氣泡圖。見圖6。分別為磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）—蘇氨酸激酶（Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、Ras信號通路、Foxo信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、胰島素信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路、Toll 樣受體信號通路、Janus 激酶（JAK）—信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）信號通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號通路、Wnt 信號路、Hippo 信號通路、P53 信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、Notch 信號通路、醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收通路。

3 討論

慢性腎衰竭的共同病理表現(xiàn)為腎臟纖維化，腎臟纖維化的持續(xù)發(fā)展最終將導(dǎo)致腎衰竭，因此，有效緩解腎纖維化就能有效延緩慢性腎衰竭的進展。

圖3 Hub網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Hub network

圖4 GO富集分析功能組別圖Figure 4 Functional group diagram of GO enrichment analysis

圖5 GO富集分析功能組別占比餅狀圖Figure 5 Pie chart of functional group proportion by GO enrichment analysis

3.1 靶點預(yù)測預(yù)測結(jié)果表明，大黃治療慢性腎衰竭的關(guān)鍵靶點有30個，按degree值（從大到小排序）具體為SRC、ESR1、CSNK2A1、FYN、AR、CASP3、 GRB2、 TP53、 LCK、 LYN、 STAT3、MAPK1、PIK3R1、 CREBBP、 EP300、 SHC1、EGFR、 PRKCA、 SMAD3、 STAT1、 PTPN11、BCL2、PLCG1、NR3C1、ABL1、JUN、CSNK2A2、MAPK3、AKT1、RELA。

其中包括促進腎纖維化和抑制腎纖維化的靶點，如SRC 為促進腎纖維化靶點。SRC 屬于非受體細胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶家族，在細胞中廣泛存在，當(dāng)其在Tyr416 位點磷酸化而活化后可以進一步激活TGF-β1、STAT3、EGFR 促纖維化的信號通路，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生及加重過程中有重要意義。研究表明，通過PP1抑制SRC活化后可通過抑制內(nèi)吞而使MMP-2活性提高，而MMP-2活性提高后可促進細胞外基質(zhì)的降解，有助于腎間質(zhì)纖維化的逆轉(zhuǎn)。因此，本研究進一步支持SRC 作為腎間質(zhì)纖維化治療潛在靶點的可能性[4]。

圖6 大黃治療慢性腎衰竭前20條富集通路氣泡圖Figure 6 Bubble diagram of the top 20 of pathway enrichment

而大部分靶點通路可以延緩腎纖維化，改善腎功能。如STAT3、STAT1 可通過調(diào)控JAK1、JAK2、STAT3的基因達到改善腎功能目的[5]。

3.2 大黃治療慢性腎衰竭的預(yù)測通路預(yù)測通路共20 個，分別為PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Ras信號通路、Foxo信號通路、TNF信號通路、胰島素信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路、VEGF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、Jak-ATAT 信號通路、cAMP 信號通路、Wnt 信號路、Hippo 信號通路、P53 信號通路、TGF-β 信號通路、AMPK 信號通路、mTOR 信號通路、Notch信號通路、醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收通路。

腎纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展為慢性腎衰竭的共同途徑。目前，關(guān)于腎纖維化相關(guān)研究的信號通路包括TGF-β1/Smad 通路、血小板衍生生長因子（PDGF）/PDGF 受體（PDGFR）信號通路、Wnt/β-catenin通路和MAPK相關(guān)信號通路等[6]。

既往研究表明，大黃的最主要活性成分為大黃酸、大黃素。通過對梗阻性腎病模型的研究得到證實，大黃酸可以不同程度抑制腎間質(zhì)纖維化，保護殘余腎功能，延緩腎功能進展，同時，可以下調(diào)α-SAM 和TGF-β1 的表達[7]。TGF-β1 是一種重要的細胞因子，它通過控制細胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解而促使腎臟的纖維化加劇[8]。此外，大黃酸可下調(diào)氧化損傷標(biāo)志物的表達，從而延緩腎臟纖維化[9]。大黃素能降低糖尿病腎病大鼠腎組織中纖連蛋白的表達，阻止p38 MAPK 通路的激活[10]，下調(diào)腎臟內(nèi)TNF-α 與白細胞介素（IL）-6 的表達，抑制腎小球上皮細胞的增生，下調(diào)Toll 樣受體4 的表達，緩解腎臟的炎癥狀態(tài)[11]，阻斷NRK-49F細胞激活p38/ERK1/2 信號通路，抑制細胞外基質(zhì)的形成[12]，從而延緩腎臟纖維化。

綜上所述，大黃對慢性腎衰竭的治療作用體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路的特點，其機制主要與調(diào)控腎纖維化相關(guān)通路有關(guān)，為后續(xù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。