3種不同倍性黑麥類作物種子形態(tài)比較和葉表皮顯微觀察

姚 銳， 高 慧， 郭世陽， 郭振清， 付金鋒， 林小虎

(河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院， 河北 秦皇島 066004)

黑麥是小麥的近緣植物，具有普通小麥所欠缺的抗病蟲性(銹病、白粉病、蚜蟲等)、抗逆性(耐寒、耐鹽堿、耐旱、耐貧瘠等)、抗倒伏、分蘗力強等優(yōu)良性狀[1]。在小麥育種中，黑麥作為改良小麥遺傳組成重要的基因庫，受到小麥遺傳育種研究者的廣泛關(guān)注，許多有益基因已向小麥中轉(zhuǎn)移并培育出新的種質(zhì)資源[2]。小黑麥的培育是由小麥屬和黑麥屬物種通過遠緣雜交、回交和組織培養(yǎng)的方法來獲得的異附加系、異代換系、異易位系，是黑麥中的有益基因向小麥轉(zhuǎn)移的橋梁，在生產(chǎn)上有直接利用價值的是六倍體小黑麥和八倍體小黑麥[3]。

目前，小黑麥的研究大都局限于種質(zhì)資源培育，鮮見從種子形態(tài)和葉表皮結(jié)構(gòu)角度鑒別不同黑麥類作物種質(zhì)資源的報道。很多植物由于親緣關(guān)系很近，看上去相似，但可能是不一樣的種類[4]。掃描電鏡作為一種可以得到試樣微觀形貌結(jié)構(gòu)的儀器，在植物形態(tài)學(xué)分析方面得到了廣泛應(yīng)用。林婷婷等[5]對瘤足蕨科及其近緣植物葉表皮微形態(tài)進行了觀察和比較，探討了其分類學(xué)意義。Lubna[6]和Syed Nasar Shah[7]利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對植物葉片表皮進行顯微形態(tài)學(xué)研究，認為不同屬間、不同種間葉片微形態(tài)的差異對植物分類和鑒定具有重要意義。王聰?shù)萚8]對大麥表皮蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)進行分析，掃描電鏡結(jié)果表明，葉片表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)均為片狀，而葉鞘和穗下莖表皮晶體蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)均為棒狀。因此，本研究從種子形態(tài)、葉表皮結(jié)構(gòu)角度對黑麥類作物進行分析，旨在為黑麥類作物的分類和鑒定提供微觀形態(tài)學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本次研究所用實驗材料二倍體黑麥(山農(nóng)SC 1556)為荊州黑麥；六倍體小黑麥(山農(nóng)HT 1638)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)自墨西哥玉米小麥改良中心引進并經(jīng)過多年種植、株系選擇；八倍體小黑麥(山農(nóng)OT 0202)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)亓增軍教授以荊州黑麥和普通小麥輝縣紅經(jīng)遠緣雜交獲得，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)引進并經(jīng)過株系選擇。上述材料均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院國家小麥改良中心泰安分中心王洪剛教授課題組提供，種植于河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院試驗農(nóng)場。

1.2 方 法

1.2.1細胞學(xué)鑒定

將3種黑麥類作物種子置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中室溫浸種待根長至1～2 cm時，剪取根尖放入EP管中，冰水浴36 h。用卡諾固定液(V乙醇∶V冰醋酸=3∶1)4 ℃固定2 d。

注：A為二倍體黑麥(2 n=14)，B為六倍體小黑麥(2 n=42)，C為八倍體小黑麥(2 n=56)；標尺為20 μm。圖2 不同倍性黑麥類作物有絲分裂染色體數(shù)目

取已固定的根尖移置于1 mol·L-1HCl溶液中60 ℃解離6 min，蒸餾水漂洗10 min，取出放置在載玻片上，用刀片將根尖前端2～3 mm(頂端分生組織)切下，滴加1滴改良卡寶品紅染液染色2 min，蓋上蓋玻片，用鑷子尖端重復(fù)輕敲蓋玻片，直至細胞分散。最后用濾紙吸去多余的染液。在顯微鏡(OLYMPUS BX 53)下觀察細胞的分裂相、 染色體計數(shù)并采集圖像。

1.2.2種子形態(tài)觀察

對3種黑麥類作物種子均隨機選擇30粒，簡單清潔除去表面灰塵后，置于體視顯微鏡(OLYMPUS SZX 16)下觀察種子形態(tài)、測量大小并拍照。

1.2.3葉片掃描電鏡觀察

2018年9月下旬將3種參試材料于試驗農(nóng)場進行盆栽播種，待3種材料長至3葉期時取材，將葉片剪成小塊，用雜交鑷依次擺放于粘有導(dǎo)電膠帶的掃描電鏡載物臺上，放置于場發(fā)射掃描式電子顯微鏡(日立SU 8010，工作電壓10 kV)下觀察葉表皮結(jié)構(gòu)并拍照[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同倍性黑麥類作物有絲分裂染色體計數(shù)

采用改良卡寶品紅壓片法對供試材料根尖細胞染色體數(shù)目進行分析。3種材料均統(tǒng)計50個細胞。其中，二倍體黑麥中有47個細胞染色體數(shù)目為14，2個細胞染色體數(shù)目為13，1個細胞染色體數(shù)目為12；六倍體小黑麥中有45個細胞染色體目為42，3個細胞染色體數(shù)目為41，2個細胞染色體數(shù)目為40；八倍體小黑麥中有45個細胞染色體數(shù)目為56，2個細胞染色體數(shù)目為55，3個細胞染色體數(shù)目為54(圖1)。依據(jù)李懋學(xué)等[9]制定的確定植物染色體數(shù)目的標準85%以上的細胞具有恒定一致的染色體數(shù)，即可認為是該植物的染色體數(shù)目，確定本實驗3種供試材料——黑麥(山農(nóng)SC 1556)、六倍體小黑麥(山農(nóng)HT 1638)、八倍體小黑麥(山農(nóng)OT 0202)染色體數(shù)目分別為14、42和56(圖2)。

圖1 3種不同倍性黑麥類作物染色體數(shù)目計數(shù)

2.2 不同倍性黑麥類作物種子形態(tài)

利用體視顯微鏡對3種黑麥類作物的種子分別進行拍照觀察并測量其大小。發(fā)現(xiàn)3種黑麥類作物種子顏色均為淺黃褐色；黑麥種子較為狹長，呈梭形(圖3 A)，種子種皮遍布致密的無規(guī)則凸起帶(圖3 D)；六倍體小黑麥種子呈規(guī)則的長棒狀，種子尾部有絨毛(圖3 B)，種皮同樣遍布致密的無規(guī)則凸起帶(圖3 E)；八倍體小黑麥種子呈規(guī)則的短棒狀，種子尾部有絨毛(圖3 C)，種皮兩端較為皺縮，中部較為光滑(圖3 F)。3種黑麥類作物種子大小有明顯的不同：二倍體黑麥種子長度平均為8.2 mm，寬度平均為2.5 mm；六倍體小黑麥種子長度平均為8.3 mm，寬度平均為3.0 mm；八倍體小黑麥種子長度平均為6.0 mm，寬度平均為2.8 mm(表1)。在種子長度方面，二倍體黑麥和八倍體小黑麥之間、六倍體小黑麥和八倍體小黑麥之間存在極顯著差異；在種子寬度方面，二倍體黑麥和六倍體小黑麥之間、二倍體黑麥和八倍體小黑麥之間、六倍體小黑麥和八倍體小黑麥之間均存在極顯著差異(圖4)。

注：A、D為二倍體黑麥，B、E為六倍體小黑麥，C、F為八倍體小黑麥；A、B、C標尺為1 mm，D標尺為200 μm，E、F標尺為500 μm。圖3 不同倍性黑麥類作物種子形態(tài)

注：A為種子長度差異性比較；B為種子寬度差異性比較。圖4 不同倍性黑麥類作物種子大小比較

表1 不同倍性黑麥類作物種子數(shù)據(jù)

材料倍性種子長度/μm種子寬度/μm二倍體黑麥2n=2x=148220.46752466.4640六倍體小黑麥2n=6x=428292.49272964.2077八倍體小黑麥2n=8x=565941.53132752.5390

2.3 不同倍性黑麥類作物葉表皮超微結(jié)構(gòu)觀察

對3種黑麥類作物葉表皮進行觀察，發(fā)現(xiàn)3種作物葉片表皮細胞均呈長條狀緊密排列，長軸與葉脈平行，氣孔器均略微下陷，均有彌漫分布的表皮毛(圖5 A,B,C)。 黑麥氣孔器外拱蓋呈脊狀凸起(圖5 D)，六倍體小黑麥、八倍體小黑麥氣孔器外拱蓋或呈脊狀突起或呈凹陷狀，三者氣孔器均呈橢圓形(圖5 E,F)。3種黑麥類作物葉片氣孔器大小有明顯的不同：二倍體黑麥氣孔器長度平均為43μm，寬度平均為21μm；六倍體小黑麥葉片氣孔器長度平均為62μm，寬度平均為21μm；八倍體小黑麥葉片氣孔器長度平均為78μm，寬度平均為26μm(表2)。在葉片氣孔器長度方面，二倍體黑麥和六倍體小黑麥之間、二倍體黑麥和八倍體小黑麥之間、六倍體小黑麥和八倍體小黑麥之間均存在極顯著差異；在葉片氣孔器寬度方面，二倍體黑麥和八倍體小黑麥之間存在顯著差異(圖6)。

表2 不同倍性黑麥類作物葉片氣孔器數(shù)據(jù)

材料倍性氣孔器長度/μm氣孔器寬度/μm二倍體黑麥2n=2x=1443.14020.980六倍體小黑麥2n=6x=4262.26021.380八倍體小黑麥2n=8x=5677.97025.710

注：A、D為二倍體黑麥；B、E為六倍體小黑麥；C、F為八倍體小黑麥；A、B、C比例尺為100 μm;D、E、F比例尺為800 μm圖5 不同倍性黑麥類作物葉表皮形態(tài)特征

注：A為氣孔器長度差異性比較；B為氣孔器寬度差異性比較。圖6 不同倍性黑麥類作物葉片氣孔器大小比較

3 討 論

本實驗對3種黑麥類作物進行根尖染色體計數(shù)，存在少部分細胞染色體數(shù)目與理論值不符的情況，可能是因為制片時人為因素導(dǎo)致染色體丟失或者染色體恰好重疊未分散開。利用體視鏡對3種黑麥類的種子進行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)種子大小存在顯著性差異，種子外形和種皮形貌存在明顯的不同。其中黑麥種子呈梭形，較為狹長，種皮遍布致密的無規(guī)則凸起帶；六倍體小黑麥相對黑麥而言較寬，種皮同樣遍布致密的無規(guī)則凸起帶；八倍體小黑麥較小，兩端的種皮較為皺縮，中部較為光滑；六倍體和八倍體小黑麥種子尾部有絨毛。利用掃描電鏡對3種黑麥類作物的葉片進行觀察，結(jié)果表明彼此表皮細胞結(jié)構(gòu)沒有明顯差異，但氣孔器有大小的顯著性的差別：黑麥和六倍體小黑麥葉片氣孔器的寬度相差不大，但六倍體小黑麥葉片氣孔器比黑麥葉片氣孔器長，八倍體小黑麥葉片氣孔器比上述二者更大，其在長度上的數(shù)值接近黑麥葉片氣孔器長度的一倍。由于所研究3種黑麥類作物種植環(huán)境相同，根據(jù)結(jié)果推測種子及葉片氣孔器的差異由其物種遺傳信息決定。王運濤、薛丹及劉培衛(wèi)[7,10-12]對其他植物進行了研究，得出了不同品種乃至不同屬間植物的種子形貌和葉表皮微結(jié)構(gòu)可以鑒別植物物種的相似結(jié)論。表明不同倍性黑麥類作物種子形貌和葉片氣孔器的差異可以作為不同倍性黑麥類作物間差異鑒定的依據(jù)之一。

植物表面微結(jié)構(gòu)豐富的多態(tài)性可以作為種間鑒別的參考依據(jù)[6,13]，因此很可能對于整個小麥族作物而言，種子及葉片表面微結(jié)構(gòu)可以反映不同物種麥類作物之間的差別。然而，由于本實驗研究的麥類作物種類較少，要得出嚴謹?shù)柠滎愖魑锱c其形態(tài)學(xué)微結(jié)構(gòu)差異的相關(guān)性結(jié)論，還需要對更多種的麥類作物進行全面的研究。