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    水楊酸鈉致耳鳴大鼠下丘GDNF的表達(dá)*

    2020-05-20 03:38:00周爽廖華王文靜楊琨汪雷楊希林
    聽力學(xué)及言語疾病雜志 2020年2期
    關(guān)鍵詞:水楊酸鈉多巴胺神經(jīng)元

    周爽 廖華 王文靜 楊琨 汪雷 楊希林

    研究顯示聽覺通路的任何部位,包括蝸神經(jīng)、聽神經(jīng)或中樞聽覺傳導(dǎo)通路等的異常均可導(dǎo)致耳鳴[1]。下丘作為一個(gè)中腦結(jié)構(gòu),將絕大多數(shù)呈遞的聽覺信息和物質(zhì)整合到聽覺皮層,也參與到耳鳴的發(fā)生發(fā)展及持續(xù)過程中[2]。下丘內(nèi)多巴胺水平的顯著性降低可能與水楊酸鈉所誘導(dǎo)的耳鳴產(chǎn)生有關(guān)。既往有學(xué)者研究顯示,噪聲刺激下耳蝸內(nèi)多巴胺含量降低;還有研究顯示長時(shí)間強(qiáng)噪聲暴露下大鼠腦內(nèi)多巴胺的含量也是降低的[3,4]。新近研究表明多巴胺能通路可能參與了耳鳴情感調(diào)控,多巴胺能藥物能提高丘腦感覺信號(hào)放電,同時(shí)耳蝸內(nèi)多巴胺有抑制作用,可能參與早期耳鳴形成[5]。

    膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF) 是神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一種,也是一種蛋白質(zhì),GDNF是中腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育、存活和維持的重要生長因子,它對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和其他神經(jīng)元亞群有很強(qiáng)的存活作用[6]。此外,GDNF對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移和分化是必不可少的,如海馬神經(jīng)元軸突生長、海馬和皮層神經(jīng)元突觸的形成等;GDNF 在全身各種組織中均有表達(dá),在腦組織中廣泛分布,通過其受體復(fù)合物介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)[7]。RET是一種原癌基因,當(dāng)其與細(xì)胞外信號(hào)分子家族的GDNF結(jié)合時(shí),可引起RET蛋白受體磷酸化并使RET進(jìn)入激活狀態(tài),致其下游信號(hào)通路激活。GDNF可通過與其受體RET結(jié)合后,激活PI3激酶/Akt(PI3K/Akt)途徑,從而有效調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化與遷移[8]。然而下丘內(nèi)GDNF及其介導(dǎo)的信號(hào)通路是否參與耳鳴發(fā)生發(fā)展過程尚未見報(bào)道。本研究擬探討GDNF及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在慢性水楊酸鈉注射致耳鳴大鼠下丘中的作用及可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠(維通利華公司,北京)24只,體重180~250 g,耳郭反應(yīng)靈敏,無強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為4組:急性組(AS組,水楊酸鈉200 mg/kg腹腔單次注射)、慢性組(SS組,水楊酸鈉200 mg/kg腹腔注射,每天2次、兩次注射時(shí)間間隔大于8小時(shí),持續(xù)14天)、恢復(fù)組(RS組,注射方式及時(shí)間同SS組,14天注射完畢后停止,并繼續(xù)正常喂養(yǎng)14天)、對(duì)照組(NS組,腹腔注射等量生理鹽水,注射劑量、方式及時(shí)間同SS組),每組6只;水楊酸鈉購于上海Sigma-Aldrich 公司,以生理鹽水溶解為100 g/L溶液。

    1.2聽覺驚跳反射前刺激抑制試驗(yàn)(gap-prepulse inhibition of the acoustic startle reflex,GPIAS)[9]對(duì)照組、慢性組在第15天上午(距末次給藥間隔大于8小時(shí))、急性組在單次給藥后8小時(shí)、恢復(fù)組在注射完畢后第15天上午分別行GPIAS檢測(cè),檢測(cè)各組大鼠是否有耳鳴樣行為,所有大鼠在檢測(cè)前均禁食8小時(shí)。

    檢測(cè)前,先將大鼠置于透明有孔的樹脂玻璃制動(dòng)物固定裝置內(nèi),限制其活動(dòng),然后將其放入載有敏感壓電轉(zhuǎn)換器的隔音箱內(nèi)(MED-ASRPRO1,美國MED公司);聲刺激信號(hào)由TDT(RZ6,美國Tucker Davis Technologies公司)產(chǎn)生,通過懸掛在固定器側(cè)方10 cm的高頻喇叭傳出。當(dāng)動(dòng)物發(fā)生驚跳反射后,身體的重力改變會(huì)通過壓電傳感器傳入系統(tǒng),產(chǎn)生相應(yīng)波形,并自動(dòng)記錄和計(jì)算峰值。GPIAS實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)程的間隙空白插在刺激噪聲前100 ms,刺激噪聲為100 dB SPL的白噪聲,上升/下降時(shí)間5 ms,持續(xù)時(shí)間50 ms,背景噪聲為65 dB SPL的3個(gè)不同頻率(6、12、16 kHz)純音。實(shí)驗(yàn)間隔為30~35 s,以避免前面刺激產(chǎn)生的不應(yīng)期而影響動(dòng)物對(duì)后面刺激的反應(yīng);無間隙空白的實(shí)驗(yàn)與上述順序一樣,間隙空白設(shè)為0 ms;每只大鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)間約為30 min。GPIAS主要檢測(cè)指標(biāo)是前刺激抑制率(%),表示聽覺驚跳反射間隔前刺激對(duì)驚跳反射的抑制程度,公式為GPIAS% =(1-gap/no gap)×100%,其中g(shù)ap表示有間隙空白作為前刺激時(shí)誘發(fā)的波幅,no gap表示沒有空白僅有驚跳刺激時(shí)所誘發(fā)的波幅。

    1.3各組動(dòng)物下丘組織取材 各組大鼠分別完成GPIAS檢測(cè)后,斷頭處死并迅速分離下丘,立即置于液氮中,并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。

    1.4Western Blot 法檢測(cè)各組動(dòng)物下丘GDNF、RET、P-PI3K p85α、P-AKT蛋白表達(dá)量 組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2~3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器中;加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑,冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中,振蕩,冰浴30 min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保勻漿液完全裂解;4 ℃ 12 000 rpm離心5 min,收集上清液,即為總蛋白溶液,使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度。Western blot檢測(cè)蛋白定量,分別用8%分離膠和5%濃縮膠、10%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行電泳,于PVDF膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1小時(shí),分別用GAPDH多克隆抗體(稀釋度1∶10 000,abcam)、GDNF多克隆抗體(稀釋度1∶1 000,abcam)、RET多克隆抗體(稀釋度1∶1 000,abcam)P-PI3K p85α多克隆抗體(稀釋度1∶500,abcam)、P-AKT多克隆抗體(稀釋度1∶1 000,CST)進(jìn)行4 ℃過夜孵育;TBST洗滌3次,每次10分鐘,用山羊抗兔多克隆熒光二抗(稀釋度1∶10 000,KPL)室溫孵育1小時(shí),TBST洗滌3次,每次10分鐘,根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件,顯影、定影,將膠片進(jìn)行掃描存檔,用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

    1.5熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)各組動(dòng)物下丘GDNF、RET、PI3K、AKT1 mRNA表達(dá)量 采用Trizol法分別提取總RNA,紫外分光檢測(cè)其濃度純度。第一鏈cDNA的合成采用EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行(ELK Biotechnology,EQ003),在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR儀上完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR,每個(gè)樣品均作3個(gè)復(fù)孔,使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行(ELK Biotechnology,EQ001)。引物與探針的設(shè)計(jì)與合成 在Genbank數(shù)據(jù)庫中查找大鼠GDNF、RET、PI3K、AKT1基因序列,使用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)大鼠目的基因及內(nèi)參,見表1。

    表1 引物與探針的設(shè)計(jì)與合成

    1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組大鼠GPIAS結(jié)果 與對(duì)照組相比,SS組大鼠GPIAS值在12和16 kHz明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明SS組大鼠出現(xiàn)耳鳴樣行為,耳鳴模型建立成功。AS組和RS組各頻率GPIAS值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明單次注射水楊酸鈉未引起大鼠耳鳴樣行為,而大鼠耳鳴樣行為在停止水楊酸鈉注射14天后消失(表2)。

    表2 四組大鼠不同頻率純音背景聲下的GPIAS值

    注:*與同頻率其他組比較,P<0.05

    2.2Western Blot法檢測(cè)四組動(dòng)物下丘GDNF、RET、P-PI3K p85α、P-AKT蛋白表達(dá) 與其他組大鼠相比較,SS組大鼠下丘GDNF、RET、P-PI3K p85α、P-AKT蛋白表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

    表3 各組大鼠下丘GDNF、RET、P-PI3K p85α、P-AKT蛋白表達(dá)水平的比較 (n=6)

    注:*與NS組比較,P<0.05;△與RS組比較,P<0.05

    2.3RT-qPCR法檢測(cè)四組動(dòng)物下丘GDNF、RET、PI3K、AKT1 mRNA表達(dá) 與其他三組相比,SS組大鼠下丘GDNF、RET、PI3K、AKT1mRNA表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

    表4 各組大鼠GDNF、RET、PI3K、AKT1 mRNA表達(dá)水平的比較(n=6)

    注:*與NS組比較,P<0.05;#與AS組比較,P<0.05;▲與RS組比較,P<0.05

    3 討論

    目前常用的耳鳴行為學(xué)模型為聽覺驚跳反射刺激前抑制試驗(yàn)(GPIAS)[9]。本研究通過對(duì)大鼠行慢性腹腔注射水楊酸鈉,運(yùn)用GPIAS試驗(yàn)驗(yàn)證其發(fā)生了耳鳴樣行為,說明成功建立了大鼠耳鳴模型。

    耳鳴發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性決定了對(duì)其治療的困難程度[10],因此,對(duì)于耳鳴發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。耳鳴的病變部位包括外周和中樞,聽覺通路的任何部位異常均可能導(dǎo)致耳鳴[11]。下丘在上行聽覺通路中幾乎是強(qiáng)制性轉(zhuǎn)換器,幾乎涵蓋了所有丘系和外側(cè)丘系上行傳入信息[2]。因此,下丘中的病理生理變化幾乎可以改變聽覺感知的所有方面,下丘被推定為構(gòu)成主觀耳鳴中心機(jī)制的重要結(jié)構(gòu)[12]。研究顯示耳鳴大鼠下丘內(nèi)多巴胺水平顯著降低,多巴胺能通路可能參與了耳鳴的情感調(diào)控,多巴胺能藥物可提升丘腦內(nèi)感覺信號(hào)放電[13]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明GDNF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有高度親和力,是多巴胺能神經(jīng)元高度特異性神經(jīng)營養(yǎng)因子,對(duì)其有明顯的營養(yǎng)、支持、保護(hù)和分化作用,使神經(jīng)元胞體增大,可誘導(dǎo)其軸突出芽和重建[13],且對(duì)黑質(zhì)、紋狀體多巴胺能系統(tǒng)亦具有保護(hù)和修復(fù)作用。GDNF通過二聚體的形式與受體GFRα結(jié)合后觸發(fā)其與跨膜蛋白R(shí)et結(jié)合,并引起Ret活化,形成GDNF/GFRα/Ret復(fù)合物[14],從而引起特異性底物磷酸化,介導(dǎo)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。GDNF結(jié)合受體后可介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路并對(duì)其基因表達(dá)產(chǎn)生影響,在PI3K/Akt信號(hào)通路中,PI3K激活后,在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP2,PIP2磷酸化成為PIP3,再由PIP3與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白Akt結(jié)合,使Akt活化,活化的Akt通過磷酸化作用進(jìn)一步激活下游的mTOR信號(hào)通路,最終實(shí)現(xiàn)基因表達(dá),并起到神經(jīng)營養(yǎng)、支持、保護(hù)和分化作用[14]。

    本研究結(jié)果表明,SS組大鼠下丘GDNF及其受體RET,P-PI3K p85α、P-AKT蛋白表達(dá)量較其他組大鼠均降低,提示長期慢性水楊酸鈉注射可引起GDNF表達(dá)量降低,導(dǎo)致其受體RET磷酸化減少,激活態(tài)降低,從而抑制其下游PI3K/Akt信號(hào)通路,GDNF、RET、PI3K、AKT1 mRNA表達(dá)量亦減少,最終導(dǎo)致GDNF神經(jīng)營養(yǎng)作用受抑制,多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育、存活和維持受抑制。本研究中,GPIAS檢測(cè)結(jié)果表明AS組、RS組大鼠均未引出耳鳴樣行為,但AS組、RS組大鼠下丘GDNF及其下游受體各蛋白、mRNA表達(dá)量較NS組均顯著降低,推測(cè)水楊酸鈉急性注射AS組大鼠可引起GDNF蛋白及mRNA表達(dá)量降低,但單次注射不足以引起耳鳴實(shí)質(zhì)性病理生理的改變;而RS組大鼠隨水楊酸鈉注射停止,GDNF及其下游受體蛋白表達(dá)量逐漸回升,耳鳴樣行為隨GDNF及其下游受體對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用增強(qiáng)而消失;此結(jié)果也證實(shí)了GDNF對(duì)于耳鳴的抑制作用。

    綜上所述,水楊酸鈉所致耳鳴大鼠通過抑制GDNF表達(dá),抑制其受體RET的活化,從而抑制其下游PI3K/Akt信號(hào)通路,抑制了下丘及下丘內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)作用,從而在耳鳴的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此,通過進(jìn)一步研究GDNF激動(dòng)劑對(duì)水楊酸鈉所致耳鳴大鼠中下丘內(nèi)GDNF及其下游信號(hào)通路的影響,可更加深入探究下丘中GDNF對(duì)耳鳴發(fā)生發(fā)展及持續(xù)的作用機(jī)制,從而為臨床治療耳鳴提供新的方向。

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