基于DNA四面體的微流控芯片用于致病性大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)

朱福琳 卞曉軍 田潤(rùn) 李亮 顏娟 劉剛

摘?要?設(shè)計(jì)了一種微流控芯片，在其通道表面修飾DNA四面體，并通過(guò)生物素-鏈霉親和素反應(yīng)連接適配體作為捕獲探針，用于大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7，E.coli O157∶H7）的檢測(cè)研究。微流控芯片魚(yú)骨形結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)降低了細(xì)菌捕獲時(shí)受到的剪切力;在其表面修飾DNA四面體，可進(jìn)一步調(diào)節(jié)探針之間的距離，提高探針對(duì)細(xì)菌的識(shí)別效率。瓊脂糖凝膠電泳表征結(jié)果證實(shí)了DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的成功制備和DNA四面體-適配體捕獲體系的構(gòu)建。采用熒光顯微鏡對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步成像分析，并將此微流控芯片檢測(cè)平臺(tái)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。結(jié)果表明，不需要大型儀器或設(shè)備及其它信號(hào)放大技術(shù)的輔助，在普通光學(xué)顯微鏡下，利用此檢測(cè)系統(tǒng)即能實(shí)現(xiàn)濃度為10 CFU/mL的E.coli O157∶H7的檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)耗時(shí)少于2 h。實(shí)際樣品的檢測(cè)回收率為88.3%～108.3%。本研究基于DNA四面體納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建的微流控平臺(tái)，不僅為食源性致病菌的檢測(cè)提供了一種有效的檢測(cè)方法，在其它食品安全隱患、疾病早期診斷等研究領(lǐng)域也具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞?DNA四面體;微流控芯片;適配體;大腸桿菌O157∶H7

1?引 言

食品安全是全世界共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，近年來(lái)，由于微生物引起的食源性疾病在食品安全事件中的比例不斷上升，對(duì)人類(lèi)健康和生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。這些致病微生物在食物中生存生長(zhǎng)和代謝導(dǎo)致食物變質(zhì)，而一些致病菌分泌有毒物質(zhì)，直接或間接導(dǎo)致疾病。常見(jiàn)的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium，S. typhimurium）、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）等[2]。食源性疾病的預(yù)防與控制已引起了世界各國(guó)關(guān)注，在工業(yè)環(huán)境、臨床和醫(yī)學(xué)診斷、水和環(huán)境質(zhì)量控制，以及在資源有限的環(huán)境中快速檢測(cè)致病菌對(duì)于減少食品和水傳播疾病的爆發(fā)至關(guān)重要[3]。目前，快速檢測(cè)食源性致病菌的方法主要有免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)，如酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[4，5]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）等[6，7]。然而，這些方法也有自身的局限性，如檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果;有的則需要大型儀器設(shè)備、昂貴的試劑和專(zhuān)業(yè)操作人員，其應(yīng)用范圍受到限制。

近年來(lái)，各種生物傳感器，包括電化學(xué)傳感器[8～10]、比色傳感器[11～13]等，特別是基于適配體（Aptamer）的生物傳感器，已被開(kāi)發(fā)用于致病菌的檢測(cè)[14～16]。寡核苷酸適配體是通過(guò)體外選擇技術(shù)（即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX））篩選出來(lái)的對(duì)靶標(biāo)具有特異性的單鏈寡核苷酸[17]，與抗原抗體相比，適配體具有更高的生物穩(wěn)定性[18，19]。Fang等[20]提出了一種簡(jiǎn)單靈敏的基于適配體的生物傳感器，用于快速檢測(cè)腸道沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis，S. enteritidis）。此方法避免了繁瑣的DNA提取和純化過(guò)程，大大減少了基于傳統(tǒng)DNA擴(kuò)增法導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)概率，為傳統(tǒng)方法提供了簡(jiǎn)便、快速的替代方法。然而，這些方法需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過(guò)程，仍具有明顯的應(yīng)用局限性。

微流控平臺(tái)作為一種生物傳感器，在微米尺度通道內(nèi)對(duì)液體進(jìn)行操縱和控制[21]。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，微流控芯片技術(shù)以其高度的集成化、微型化、分析速度快、準(zhǔn)確度高、成本低等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[22～24]。如Wang等[25]提出基于磁珠的微流控芯片用于耐甲氧基西林S. aureus的檢測(cè)，此方法將核酸提取和目標(biāo)核酸的等溫?cái)U(kuò)增集成到一張基于磁珠的微流控芯片中，能與S. aureus的DNA相結(jié)合的核酸片段連接在磁珠上作為捕獲DNA的工具，檢測(cè)成本低，分析時(shí)間短。但是，由于磁珠的不透明性，無(wú)法在芯片內(nèi)檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，只能通過(guò)離心后測(cè)OD值或者電泳判定反應(yīng)結(jié)果，實(shí)用性不強(qiáng)。因此，合理設(shè)計(jì)具有理想識(shí)別效率和靈敏度的生物傳感器一直是生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是微流控平臺(tái)面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

近年來(lái)，基于DNA納米技術(shù)已經(jīng)發(fā)展出許多具有良好生物相容性的新型DNA納米結(jié)構(gòu)，如DNA自組裝制備的DNA四面體[26～28]。DNA四面體是一種具有良好剛性的DNA三維結(jié)構(gòu)，有效提高了DNA探針在表面分布排列的均一性，實(shí)現(xiàn)了DNA探針之間距離的精確調(diào)控，提高了生物檢測(cè)的靈敏性和特異性[29～32]。目前，已有研究提出基于DNA四面體納米結(jié)構(gòu)功能化的微通道用于快速、靈敏的重金屬離子的檢測(cè)[33]，DNA四面體的存在增強(qiáng)了分子間的相互作用，提高了其探針的識(shí)別能力。但是，基于DNA四面體的微流控芯片用于細(xì)菌檢測(cè)的研究較少。本研究基于DNA四面體的微流控系統(tǒng)，提出了檢測(cè)致病菌的方法。E.coli O157∶H7是一種廣泛存在于環(huán)境、食品、人和動(dòng)物中的致病性革蘭氏陰性菌，并且已經(jīng)有篩選出的具有高親和力的DNA適配體[34，35]。將丙烯酰胺修飾的DNA四面體通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)固定在聚二甲氧基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）微通道的表面[36]，為特異性的DNA探針提供了剛性支架。為了提高識(shí)別效率，微通道中還設(shè)計(jì)了魚(yú)骨形結(jié)構(gòu)的圖案，增加特異性的適配體與目標(biāo)細(xì)菌的生物識(shí)別幾率。在最佳條件下，此基于DNA四面體的微流控平臺(tái)可顯著提高E.coli O157∶H7的檢測(cè)靈敏度，為食品安全領(lǐng)域中食源性致病菌的檢測(cè)提供了一種新方法，同時(shí)也為新型DNA納米結(jié)構(gòu)在生物傳感器制備、生物分析等研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新思路。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

UV-2540紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）;FS-5熒光分光光度計(jì)（英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司）;瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）;生物快速原子力顯微鏡（美國(guó)Bio-FastScan公司）;BPZ-6063LC真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;PDC-MG型等離子體清洗機(jī)（成都銘恒科技發(fā)展有限公司）;CKX-41倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

DNA由上海生工生物工程有限公司合成純化，序列見(jiàn)表1;PDMS預(yù)聚體（美國(guó)Dow Coming公司）;3-甲氧基巰基丙基硅烷（Methoxy mercaptopropyl silane，MPS，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）;牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA，美國(guó)Amresco公司）;10×TM緩沖液（500 mmol/L Tris-HCI，80 mmol/L Mg2SO4，pH 7.5）、50×TAE緩沖液（2 mol/L Tris-acetic acid;100 mmol/L EDTA，pH 8.4）、瓊脂糖III（TM）、4S Red Plus核酸凝膠染色劑（10000×，0.1 mL）、鏈霉親和素（Streptavidin），磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS，20×，pH 7.4）、LB肉湯培養(yǎng)基（LB broth powder）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar）均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;SYTO 9綠色熒光核酸染料（SYTO 9 Green，美國(guó)賽默飛公司）。 實(shí)驗(yàn)用的細(xì)菌包括E.coli O157∶H7（ATCC 43889）、大腸桿菌O6（E.coli O6，ATCC 25922）、李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes，ATCC 19115）、S. aureus（，ATCC 25923），以及S. typhimurium（ATCC 19585），均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。 所用化學(xué)試劑至少為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?微流控芯片的設(shè)計(jì)和制備?本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的微流控芯片如圖1A所示，根據(jù)微流控芯片的設(shè)計(jì)采用SU-8負(fù)性光刻法制作了模具[37]，利用模具制作成PDMS芯片，具體制作過(guò)程如圖2所示，首先，將模具放在培養(yǎng)皿中，將PDMS單體和固化劑按照質(zhì)量比10∶1攪拌混勻，倒在SU-8模具上，然后將培養(yǎng)皿水平放置在真空干燥器內(nèi)，通過(guò)抽真空除盡氣泡，確保體系內(nèi)沒(méi)有氣泡之后放在恒溫真空干燥箱中，80℃固化1 h。將固化后的PDMS從模具上剝離，打孔，切割整齊。將清潔后的此層PDMS與空白PDMS經(jīng)氧等離子體清洗機(jī)處理后貼合在一起，進(jìn)行永久性封接，形成具有密封通道的完整的PDMS芯片，完成微流控設(shè)備的制作。PDMS芯片通道內(nèi)依次用無(wú)水乙醇、超純水沖洗后，備用。

2.2.2?DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的制備?按文獻(xiàn)[38]報(bào)道的方法，用4條DNA鏈自組裝合成DNA四面體。首先，用超純水溶解丙烯酰胺修飾的DNA單鏈，DNA單鏈溶液的濃度通過(guò)測(cè)定其在260 nm處的紫外吸收值進(jìn)行定量分析，然后將4條DNA單鏈溶液按1∶1∶1∶1的比例混合于1×TM 緩沖液中，每條DNA單鏈的終濃度均為1 μmol/L?；旌暇鶆蚝螅糜赑CR儀中，按照設(shè)定好的程序95℃保持10 min，然后迅速降溫至4℃，保持25 min，得到濃度為1 μmol/L的DNA四面體，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）進(jìn)行表征。DNA四面體于4℃保存，備用。

2.2.3?PDMS芯片表面的改性?將制備的PDMS芯片用無(wú)水乙醇清洗3次，加入20 μL 2% （V/V）無(wú)水乙醇配制的MPS溶液，室溫反應(yīng)0.5 h，反應(yīng)完成后將剩余溶液抽干，用無(wú)水乙醇和PBS（1×，pH 7.4）分別清洗3次，成功將巰基修飾在PDMS通道表面。加入20 μL丙烯酰胺修飾的DNA四面體（0.1 μmol/L）室溫反應(yīng)2 h，反應(yīng)完成后抽干剩余溶液，用 PBS（1×，pH 7.4）沖洗3次，成功將DNA四面體固定在PDMS通道表面。為了減少PDMS芯片表面的非特異性吸附位點(diǎn)，加入1% BSA溶液37℃孵育2 h進(jìn)行封閉，用 PBS（1×，pH 7.4）沖洗，加入鏈霉親和素溶液（0.5 μmol/L ）孵育。最后，加入生物素標(biāo)記的大腸桿菌適配體（Biotin-aptamer）溶液（1 μmol/L），通過(guò)生物素-鏈霉親和素反應(yīng)連接到DNA四面體修飾的PDMS表面，反應(yīng)完成后，用 PBS（1×，pH 7.4）沖洗3次，洗去未反應(yīng)的適配體，得到修飾有DNA四面體-?Streptavidin-Aptamer結(jié)構(gòu)的PDMS芯片。

2.2.4?E.coli O157∶H7的捕獲?E.coliO157∶H7首先用SYTO 9綠色熒光核酸染料（SYTO 9 Green）標(biāo)記（200 r/min，37℃），然后將E.coli O157∶H7細(xì)胞懸浮液稀釋到101～105 CFU/mL，分別注入到修飾后的PDMS芯片通道內(nèi)，37℃孵育2 h。E.coli O157∶H7細(xì)胞被適配體特異性捕獲后，加入PBS（1×，pH 7.4）洗去未被捕獲的E.coli O157∶H7細(xì)胞，重復(fù)洗滌3次，用CKX-41倒置熒光顯微鏡觀察成像。

3?結(jié)果與討論

3.1?微流控芯片的設(shè)計(jì)和制備

微流控芯片的設(shè)計(jì)包含有6個(gè)相同的結(jié)構(gòu)單元，呈環(huán)形陣列排布，每個(gè)結(jié)構(gòu)單元為獨(dú)立的“蛇形”微通道[39]，通道包含有魚(yú)骨形結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)基于誘導(dǎo)溶液低雷諾數(shù)（Re）條件下混合的策略[40]，與傳統(tǒng)的直通道微流控裝置相比，魚(yú)骨形圖案誘導(dǎo)通道內(nèi)流動(dòng)的液體產(chǎn)生渦流，打破了流體的層流狀態(tài)，有利于流體在微通道內(nèi)均勻混合，增加了細(xì)菌細(xì)胞在捕獲過(guò)程中與不同壁面的Aptamer的生物識(shí)別幾率，降低了其所受的剪切力，從而降低了細(xì)菌在捕獲過(guò)程中的損傷。

3.2?基于Aptamer-Streptavidin-DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的細(xì)菌捕獲系統(tǒng)的構(gòu)建

生物素標(biāo)記的Aptamer通過(guò)生物素-鏈霉親和素連接到DNA四面體上，此過(guò)程對(duì)后續(xù)細(xì)菌的特異性捕獲至關(guān)重要。DNA四面體結(jié)構(gòu)的制備通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和AFM成像進(jìn)行表征。如圖3A所示，瓊脂糖凝膠電泳圖中，泳道1、2、3、4分別為DNA四條鏈組合、三條鏈組合、兩條鏈組合和單鏈經(jīng)過(guò)相同條件的熱變性得到的產(chǎn)物。隨著參與自組裝的DNA鏈的增加，制備得到產(chǎn)物的遷移速率減慢。泳道1是四條DNA鏈組裝形成的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)，因其堿基數(shù)最多，遷移速率也最慢，并且只在上游出現(xiàn)了微弱的雜帶，這與之前報(bào)道的結(jié)果一致[41]，說(shuō)明DNA四面體的合成率較高。如圖3B所示，實(shí)驗(yàn)組AFM圖像的視野范圍內(nèi)出現(xiàn)了大量相似且相對(duì)獨(dú)立的納米結(jié)構(gòu)，高度約3 nm;而在對(duì)照組中，由兩條DNA鏈自組裝形成的產(chǎn)物大部分平鋪在表面（圖3C），可進(jìn)一步確定DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的成功制備。

優(yōu)化了Aptamer-Streptavidin-DNA四面體納米結(jié)構(gòu)中DNA四面體和鏈霉親和素的結(jié)合比例，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征。如圖4A所示，隨著鏈霉親和素用量的增加，產(chǎn)物的分子量也在增加，說(shuō)明生成了更多的Streptavidin-DNA四面體產(chǎn)物。利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步表征了Aptamer-Streptavidin-DNA四面體結(jié)構(gòu)的細(xì)菌捕獲系統(tǒng)的構(gòu)建，如圖4B所示，Streptavidin-DNA四面體（泳道5）和Aptamer-Streptavidin（泳道6）復(fù)合物與沒(méi)有連接鏈霉親和素的單獨(dú)的DNA四面體（泳道1）和Aptamer（泳道2）相比，由于連接鏈霉親和素之后的產(chǎn)物分子量增加，條帶位置顯著不同。此外，泳道6和泳道7相比，泳道6中存在游離的生物素標(biāo)記的Aptamer，而泳道7中沒(méi)有，說(shuō)明Aptamer與Streptavidin-DNA四面體復(fù)合物結(jié)合，并在泳道7樣品孔處出現(xiàn)明顯的Aptamer-Streptavidin-DNA四面體復(fù)合物的條帶。

3.3?基于Aptamer-Streptavidin-DNA四面體結(jié)構(gòu)的微流控芯片用于E.coliO157∶H7的檢測(cè)分析

在設(shè)計(jì)DNA四面體的序列時(shí)，DNA四面體的1個(gè)頂點(diǎn)標(biāo)記了生物素，其它3個(gè)頂點(diǎn)分別標(biāo)記了丙烯酰胺基團(tuán)。因此，DNA四面體納米結(jié)構(gòu)可通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)固定在巰基修飾的PDMS表面。如圖5所示，具有魚(yú)骨型圖案的微通道采用1% BSA溶液進(jìn)行封閉后，單獨(dú)注入Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素（Cy3-Streptavidin）進(jìn)行孵育（圖5A），微通道內(nèi)無(wú)明顯的熒光信號(hào)，向微通道中注入頂點(diǎn)沒(méi)有標(biāo)記丙烯酰胺基團(tuán)的DNA四面體，與Cy3-Streptavidin孵育也產(chǎn)生了類(lèi)似的結(jié)果（圖5B）。只有注入頂點(diǎn)標(biāo)記丙烯酰胺基團(tuán)的DNA四面體并通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)牢牢固定在PDMS表面，再與Cy3-Streptavidin孵育后產(chǎn)生了明顯的熒光信號(hào)（圖5C）。3種方式產(chǎn)生的熒光信號(hào)的強(qiáng)度比較也進(jìn)一步說(shuō)明，采用BSA封閉處理微通道可有效降低非特異性吸附產(chǎn)生的背景（圖5），鏈霉親和素可特異性地與固定在PDMS表面的DNA四面體結(jié)合。

進(jìn)一步驗(yàn)證了基于Aptamer-Streptavidin-DNA四面體結(jié)構(gòu)的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)E.coli O157∶H7的特異性識(shí)別能力。綠色熒光核酸染料SYTO 9 用于E.coli O157∶H7的染色;紅色熒光染料Cy3標(biāo)記于適配體序列。當(dāng)具備此捕獲系統(tǒng)的微流控芯片完成E.coliO157∶H7的捕獲后（細(xì)菌濃度為105 CFU/mL），熒光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察、成像，結(jié)果如圖6所示。圖6A中綠色熒光表明利用此芯片可實(shí)現(xiàn)E.coliO157∶H7的成功捕獲;圖6B紅色熒光則為同一視野下，Aptamer-Streptavidin-DNA四面體結(jié)構(gòu)所在位置;兩者的疊加結(jié)果見(jiàn)圖6C，表明Cy3-Aptamer-Streptavidin-DNA四面體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的紅色熒光信號(hào)與同一視野下綠色熒光標(biāo)記的E.coli O157∶H7細(xì)胞的分布一致。此數(shù)據(jù)充分驗(yàn)證了基于Aptamer-Streptavidin-DNA四面體結(jié)構(gòu)的微流控系統(tǒng)對(duì)E.coli O157∶H7細(xì)胞的良好特異識(shí)別能力和捕獲能力。

靈敏度和檢測(cè)限是影響微流控捕獲系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)。采用此微流控芯片裝置檢測(cè)不同濃度的E.coli O157∶H7，結(jié)果如圖7中A1～A5所示，隨著E.coliO157∶H7細(xì)胞濃度增加，普通光學(xué)顯微鏡下即可觀察到細(xì)菌數(shù)量也隨之增加，當(dāng)濃度為10 CFU/mL時(shí)，仍然可觀察到1～2個(gè)E.coliO157∶H7細(xì)胞（圖7A5）。圖7中B1～B5為相應(yīng)的熒光成像結(jié)果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此微流控芯片裝置的檢測(cè)性能，在不修飾DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，向PDMS芯片內(nèi)直接注入標(biāo)記丙烯酰胺基團(tuán)的Aptamer，用于不同濃度的E.coliO157∶H7細(xì)胞濃度的檢測(cè)。對(duì)比兩種檢測(cè)模式所得熒光信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度可知，基于DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的微流控裝置的檢測(cè)信號(hào)明顯高于基于單鏈Aptamer修飾的微流控裝置的檢測(cè)信號(hào)（圖7C），信號(hào)強(qiáng)度最高增加了約30倍（105 CFU/mL濃度下兩種檢測(cè)方法的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，基于DNA四面體檢測(cè)模式的E.coliO157∶H7細(xì)胞的相對(duì)熒光檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度與此菌濃度在101～105 CFU/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系（圖7D）。

以上結(jié)果表明，在無(wú)其它信號(hào)放大技術(shù)輔助的條件下，僅通過(guò)DNA四面體納米結(jié)構(gòu)與微流控的整合，即可實(shí)現(xiàn)濃度為10 CFU/mL的E.coliO157∶H7的檢測(cè)靈敏度。DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)已在許多文獻(xiàn)中報(bào)道[42～45]，例如，為了解決固定在底物表面的單鏈DNA探針容易相互纏繞、聚集等難題，通過(guò)改變DNA四面體的大小，在納米尺度上精確調(diào)控DNA探針之間的橫向距離。本研究采用的DNA四面體的每條邊包含13個(gè)堿基對(duì)，長(zhǎng)度l ≈ 4.42 nm，假設(shè)修飾在PDMS芯片表面的DNA四面體緊密排列，則DNA四面體緊密排列在邊長(zhǎng)L=1 cm的正方形面積上的密度為5.12×1012/cm2，計(jì)算公式如下，S表示邊長(zhǎng)L=1 cm正方形的面積：

DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的存在縮短了識(shí)別時(shí)間，提高了識(shí)別效率，從而提高了此微流控平臺(tái)檢測(cè)細(xì)菌的靈敏度。回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了此檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性。將不同濃度的E.coliO157∶H7細(xì)胞添加到空白樣品（橙汁）中，依照2.2.4節(jié)的方法，在此微流控芯片細(xì)菌捕獲系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示，回收此外，選擇濃度為103 CFU/mL的E.coliO157∶H7細(xì)菌懸液與其它4種細(xì)菌，包括E.coli O6、S. typhimurium、S. aureus、L. monocytogenes，對(duì)基于Aptamer-?Streptavidin-DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)的特異性進(jìn)行了研究。如圖8所示，非特異性細(xì)菌的濃度是E.coliO157∶H7濃度的100倍時(shí)，與E.coliO157∶H7產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度相比，也可忽略不計(jì)。此結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了基于Aptamer-Streptavidin-DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的微流控檢測(cè)系統(tǒng)不僅具有較高的靈敏度，而且具有很好的選擇性。

4?結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于Aptamer-Streptavidin-DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的微流控檢測(cè)系統(tǒng)，并成功實(shí)現(xiàn)了E.coli O157∶H7的高靈敏檢測(cè)，可檢測(cè)細(xì)菌濃度低至10 CFU/mL。與現(xiàn)有的細(xì)菌檢測(cè)方法相比，本方法具有以下優(yōu)點(diǎn)： DNA四面體納米結(jié)構(gòu)的存在可精確調(diào)控了Aptamer之間的距離，為細(xì)菌細(xì)胞檢測(cè)提供了理想的生物識(shí)別效率和靈敏度;?DNA四面體與PDMS芯片通道內(nèi)魚(yú)骨形圖案的設(shè)計(jì)，在提高細(xì)菌細(xì)胞與特異性適配體的識(shí)別幾率的同時(shí)，也降低了細(xì)菌在捕獲過(guò)程中受到的剪切力，減少了細(xì)胞損傷;不需要大型儀器或設(shè)備，不需要額外信號(hào)放大技術(shù)輔助，也不需要繁瑣的DNA提取或純化步驟，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，成本較低。本研究不僅為食源性致病微生物的檢測(cè)提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的有效方法，同時(shí)，微流控芯片6個(gè)獨(dú)立通道單元的設(shè)計(jì)可通過(guò)修飾不同的適配體進(jìn)行功能化，實(shí)現(xiàn)不同目標(biāo)物的檢測(cè)，在食品安全、公共衛(wèi)生安全、臨床醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。

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