玫瑰花 玫瑰茄 枸杞子復(fù)合發(fā)酵液化學(xué)成分的HPLC-HRMS分析△

王喻淇，梅曉丹，李潔，劉子菡，馬濤，林峰，*，張加余

1.濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 260040；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；3.江蘇菌鑰生命科技發(fā)展有限公司，江蘇 鹽城 100176

許多藥用植物富含黃酮、多糖、皂苷和有機(jī)酸等多種有效成分?，F(xiàn)代研究也已證明，這些有效成分具有提高免疫力、抗疲勞、抗衰老等調(diào)節(jié)人體機(jī)體平衡的功效[1-3]。傳統(tǒng)中藥憑借其豐富的藥效成分、廣泛的藥用資源和源遠(yuǎn)流長(zhǎng)的“藥食同源”文化，在為中藥類產(chǎn)品研發(fā)提供基礎(chǔ)的同時(shí)也已成為藥物開(kāi)發(fā)的化學(xué)資源庫(kù)。已有研究表明，利用微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化的方法可以增加中藥活性成分的含量，提高化合物結(jié)構(gòu)多樣性，有利于有效成分轉(zhuǎn)化成活性更好的物質(zhì)，從而發(fā)揮更強(qiáng)的藥理作用[4-5]。因此，通過(guò)微生物發(fā)酵傳統(tǒng)中藥已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

玫瑰花RosarugosaThunb.又稱刺玫花、穿心玫瑰等，屬于薔薇科植物。而重瓣紅玫瑰是一種在中國(guó)被廣泛食用的玫瑰，花瓣香甜、極具芬芳，被譽(yù)為“中國(guó)傳統(tǒng)玫瑰的代表”，其具有行氣解郁、疏肝理氣、活血散瘀等多種功效[6-7]。玫瑰茄HibiscussabdariffaL.又名洛神花、紅果梅以及紅角葵等，為錦葵科1年生草本植物，素有“植物紅寶石”的美譽(yù)，富含大量的有機(jī)酸，例如木槿酸、檸檬酸和原兒茶酸等。其中，木槿酸作為玫瑰茄花萼中所含的1種特殊物質(zhì)，對(duì)心臟病、高血壓、動(dòng)脈硬化等有很好的療效[8-9]。枸杞子LyciumbarbarumL.又稱枸杞紅實(shí)，屬于茄科植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益類名貴中藥。枸杞子除了含有脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素外，還含有枸杞多糖、牛磺酸和甜菜堿等有效成分，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目、潤(rùn)肺止咳和延緩衰老等功效[10-11]。

由于玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子資源豐富，風(fēng)味獨(dú)特，且均具有“藥食兩用”功能，常被制成風(fēng)味飲品供人們?nèi)粘ｏ嬘?。目前，市?chǎng)上已出現(xiàn)以3者為原料的復(fù)合發(fā)酵飲品，然而其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，本研究以玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子為發(fā)酵底物，腸膜明串株菌腸膜亞種為發(fā)酵菌種，采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)將3者有機(jī)結(jié)合制成復(fù)合發(fā)酵液，并應(yīng)用高效液相色譜-現(xiàn)行離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(HPLC-LTQ-Orbitrap MS)分析鑒定復(fù)合物提取液及發(fā)酵液中的化學(xué)成分，從而為玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子的深度開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀與LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站(美國(guó)Thermo Scientific公司)；R200D型電子分析天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；KQ-250 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BXM-30R 高壓蒸汽滅菌鍋(西安儀創(chuàng)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子藥材購(gòu)自亳州市華云中藥飲片有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張媛副教授鑒定為正品。質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈和甲酸購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，超純水由Millipore Synergy UV型超純水機(jī)制備。沒(méi)食子酸、阿魏酸、槲皮素、原兒茶酸、蘆丁和矢車菊-3-O-桑布糖苷等6種對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度均不低于98%。

2 方法

2.1 溶液配制

混合對(duì)照品溶液的制備：分別取上述6種對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇制成質(zhì)量濃度約為100 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，用時(shí)稀釋成濃度適宜的混合對(duì)照品溶液。

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子復(fù)合提取液的制備：取枸杞子10 g，加入200 mL純凈水浸泡30 min后，采用榨汁機(jī)進(jìn)行均勻打漿，得到枸杞勻漿；取玫瑰花粉末40 g、玫瑰茄粉末20 g，精密稱定，加入300 mL水，得到混合勻漿；將兩者混合后攪拌均勻；加入K2HPO4調(diào)節(jié)pH至4.5～5.0；然后向混合液中添加2 g纖維素酶、2 g果膠酶，50 ℃下酶解90 min；加入NaHCO3等調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0后加入20 g蛋白胨、80 g白砂糖，加入純水定容至1000 mL。溶液在90 ℃條件下高壓滅菌30 min后，以0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

玫瑰花、玫瑰茄及枸杞子復(fù)合發(fā)酵液的制備：復(fù)合提取液制備方法同上，待溫度降至室溫，接種腸膜明串株菌腸膜亞種發(fā)酵(培養(yǎng)溫度25 ℃，發(fā)酵20 d)。取發(fā)酵后溶液過(guò)濾，濾液以0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得復(fù)合發(fā)酵液。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～10 min，5%B；10～16 min，5%～14%B；16～66 min，14%～51%B；66～70 min，51%～55%B；70%～75 min，55%～90%B)；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源，負(fù)離子檢測(cè)模式；流動(dòng)相經(jīng)柱分流后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器的流速為0.3 mL·min-1；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣流速9 L·min-1；輔助氣流速3 L·min-1；噴霧電壓3.0 kV；毛細(xì)管電壓-35 V；管透鏡電壓-110 V；源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)裂解池碰撞能量(CID)35%。樣品采用高分辨全掃描(FT)，1級(jí)掃描分辨率為30 000，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1200，隔離寬度2 Da；二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，選取上一級(jí)豐度最高的2個(gè)峰進(jìn)行CID碎片離子掃描，激活能量單位0.25 q，激活時(shí)間30 ms。

2.3 數(shù)據(jù)處理

利用Xcalibur 2.1工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用分子式預(yù)測(cè)模塊預(yù)測(cè)所有母離子的分子式，相關(guān)參數(shù)設(shè)定為C[0～35]、H[0～50]、O[0～30]、環(huán)不飽和雙鍵數(shù)(RDB equivalent value)[0～15]，質(zhì)量精度誤差在±5×10-6以內(nèi)。

3 結(jié)果與討論

本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS對(duì)玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子復(fù)合物提取液發(fā)酵前后的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定。根據(jù)所獲得的精確分子量，同時(shí)結(jié)合相應(yīng)的色譜保留行為、質(zhì)譜裂解規(guī)律、特征碎片離子、對(duì)照品比對(duì)以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，最終鑒定了48個(gè)化學(xué)成分，其中有6個(gè)化學(xué)成分可被準(zhǔn)確鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC-LTQ-Orbitrap MS分析玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子復(fù)合提取液發(fā)酵前后總離子流圖

3.1 有機(jī)酸類成分的鑒定

有機(jī)酸類化合物均含羧基，在質(zhì)譜裂解過(guò)程中易發(fā)生脫水和脫羰基反應(yīng)。本研究從復(fù)合發(fā)酵液中鑒定的有機(jī)酸類化合物主要為綠原酸和小分子酚酸類。該類化合物是玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子所共有的，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集等藥理作用，對(duì)心血管疾病防治具有重要的臨床價(jià)值[13]。本研究從復(fù)合物提取液中共鑒定出30個(gè)有機(jī)酸類化合物；從復(fù)合物發(fā)酵液中鑒定了35個(gè)有機(jī)酸類成分，結(jié)果見(jiàn)表1。

根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在保留時(shí)間2.63 min下，C1準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z207.014 53，計(jì)算其精確分子式為C6H8O8，相對(duì)分子質(zhì)量為208.022 46 Da。在負(fù)離子模式下，二級(jí)碎片離子m/z189是由準(zhǔn)分子離子峰脫去1分子水(18 Da)產(chǎn)生的。m/z189進(jìn)一步丟失1分子CO2產(chǎn)生m/z127的二級(jí)碎片離子，故推測(cè)C1為木槿酸。

在保留時(shí)間4.77 min下，C2的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z191.019 55，計(jì)算其精確分子式為C6H8O7，相對(duì)分子質(zhì)量為192.027 55 Da。在負(fù)離子模式下，二級(jí)碎片離子m/z173是由準(zhǔn)分子離子脫掉1分子水產(chǎn)生。m/z173繼續(xù)丟掉1分子CO2生成m/z129碎片離子，繼而再又丟失1分子水生成m/z111碎片離子，故可將C2鑒定為檸檬酸。

化合物 C3、C5、C6、C9、C10、C13和C14的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z169.013 14，計(jì)算其精確分子式為C7H5O5，誤差均小于5×10-6。經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解，m/z169丟失44 Da 產(chǎn)生m/z125[M-H-CO2]-的ESI-MS2基峰離子。結(jié)合對(duì)照品比對(duì)結(jié)果，可將C3準(zhǔn)確鑒定為沒(méi)食子酸，將其他6個(gè)化合物鑒定為沒(méi)食子酸的同分異構(gòu)體。

根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，C4的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z125.024 50，推斷其精確分子式為C6H5O3，誤差為4.43×10-6。其ESI-MS2譜產(chǎn)生特征離子m/z107[M-H-H2O]-和m/z97[M-H-CO]-，因此推測(cè)C4為5-羥甲基糠醛。

在保留時(shí)間11.34、23.95、32.76、38.76 min下，C7、C16、C25和C32均產(chǎn)生負(fù)離子模式準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z191.055 01(C7H12O6，誤差≤ 5×10-6)。二級(jí)碎片離子m/z173由準(zhǔn)分子離子m/z191脫掉1分子水產(chǎn)生；m/z173繼續(xù)丟掉1分子水和1分子CO生成碎片離子m/z127，因此可將化合物 C7、C16、C25和C32鑒定為奎寧酸及其同分異構(gòu)體。

化合物C8和C11準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z153.019 67和153.019 29，推斷其最可能的分子式為C7H5O4，誤差均小于5×10-6。其產(chǎn)生二級(jí)碎片離子m/z109[M-H-CO2]-和125[M-H-CO]-，故將其鑒定為原兒茶酸。并經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，確定化合物C11為原兒茶酸，并將C8鑒定為原兒茶酸的同分異構(gòu)體。

在負(fù)離子模式下，化合物C12、C21和C30的準(zhǔn)分子離子峰為m/z163.038 97[M-H]-。根據(jù)元素組成分析，推斷它們的化合物分子式為C9H7O3。ESI-MS2譜主要的碎片離子有m/z145、135和119。其中，m/z145為母離子失去1分子H2O產(chǎn)生的；m/z135為母離子丟失1分子CO產(chǎn)生的，m/z119則是母離子丟失1分子CO2產(chǎn)生的。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[13]，可推測(cè)化合物C12、C21和C30為對(duì)香豆酸及其同分異構(gòu)體。

在保留時(shí)間23.83、34.70 min下，化合物C15和C28的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z179.035 17和179.035 05(C9H7O4，誤差≤±5×10-6)。通過(guò)碰撞誘導(dǎo)，m/z179產(chǎn)生了特征性碎片離子m/z135[M-H-CO2]-和m/z107[M-H-CO2-CO]-。因此，可推測(cè)化合物C15和C28為咖啡酸及其同分異構(gòu)體。

根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜精確相對(duì)分子質(zhì)量以及多級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息，推斷化合物C17、C24和C29為單咖啡酰奎寧酸類化合物。它們的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z353.086 70，誤差均小于5×10-6，推斷其最可能的分子式為 C16H17O9。單咖啡?？鼘幩犷惢衔锏腅SI-MS2譜中多產(chǎn)生m/z191[quinic acid-H]-、179[caffiec acid-H]-和173[quinic acid-H-H2O]-等特征碎片離子。當(dāng)咖啡?；诳鼘幩崮负松蠟?-位取代時(shí)，ESI-MS2譜的基峰離子為m/z173，因此化合物C29為隱綠原酸。當(dāng)咖啡?；诳鼘幩崮负松蠟?-位和5-位取代時(shí)，它們的基峰離子均為m/z191，其中3-位取代時(shí)m/z179的豐度約為40%，5-位取代時(shí)m/z179的豐度約為 5%，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，由此可鑒定化合物C17為新綠原酸，化合物C24是綠原酸。

在負(fù)離子模式下，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)，化合物 C18、C19、C23和C27準(zhǔn)分子離子[M-H]-均為m/z515.139 53，所有的元素組成為C22H27O14。根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，化合物經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后均減少162 Da，分別產(chǎn)生m/z353[M-H-caffeoyl/glu]-、335[M-H-caffeoyl/glu-H2O]-、191[quinic acid-H]-，表明化合物具有1分子葡萄糖基。因此，化合物 C18、C19、C23和C27推斷為單咖啡?？鼘幩崞咸烟擒铡?/p>

在保留時(shí)間26.88、43.48 min，化合物C20和C37的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z197.045 79和m/z197.045 90。根據(jù)元素組成分析，可推斷化合物分子式為C9H9O5。m/z197產(chǎn)生了特征性碎片離子m/z182[M-H-CH3]-和m/z157[M-H-CO2]-，表明化合物具有1分子甲氧基。因此，可將化合物C20和C37鑒定為丁香酸。

根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，化合物C22、C33和C34的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-均為m/z337.091 79，誤差均小于5×10-6，推斷最可能的分子式為C16H17O8。它們的二級(jí)質(zhì)譜主要特征碎片離子為m/z191[quinic acid-H]-、173[quinic acid-H-H2O]-和163[p-coumaric acid-H]-。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，當(dāng)對(duì)香豆酰基的酯化位置在3、4或5位時(shí)，所產(chǎn)生的ESI-MS2基峰離子分別為m/z163、m/z173和m/z191，因此分別將C22、C33和C34鑒定為3-對(duì)香豆?？鼘幩?、5-對(duì)香豆酰奎寧酸和4-對(duì)香豆?？鼘幩?。

化合物C26和C31的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-均為m/z193.049 53，根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜精確相對(duì)分子質(zhì)量以及多級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息，推斷最可能的元素組成為C10H9O4，誤差均小于5×10-6。在ESI-MS2譜中，它們的準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后產(chǎn)生碎片離子m/z178，質(zhì)量數(shù)減少15 Da，即丟失1分子甲基，同時(shí)丟失1分子CO2產(chǎn)生m/z149 的碎片離子，而m/z149進(jìn)一步丟失1分子甲基產(chǎn)生m/z134的碎片離子。結(jié)合對(duì)照品比對(duì)，可確定化合物C26 為阿魏酸，鑒定化合物C31為阿魏酸或其同分異構(gòu)體。

在保留時(shí)間42.38、42.94 min，化合物C35和C36的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z367.103 88和m/z367.103 79，推斷最可能的元素組成為C17H19O9，誤差分別為4.14×10-6和3.89×10-6。通過(guò)碰撞誘導(dǎo)裂解后，m/z367產(chǎn)生了特征性碎片離子：m/z193[ferulic acid-H]-、191[quinic acid-H]-和173[quinic acid-H-H2O]-，故推斷兩者屬于阿魏?？鼘幩犷惓煞帧Ｇ捌谘芯勘砻鱗16]，4-阿魏酰奎寧酸的MS2基峰離子為m/z173，5-阿魏酰奎寧酸的MS2基峰離子為m/z191，因此可推測(cè)化合物C35為5-阿魏?？鼘幩?，C36為4-阿魏?？鼘幩?。

在負(fù)離子模式下，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)，化合物 C38和C39準(zhǔn)分子離子[M-H]-均為m/z300.997 89，元素組成為C14H5O8。根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，化合物經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后分別產(chǎn)生m/z300[M-2H]-、273[M-H-CO]-和257[M-H-CO2]-。因此可推測(cè)化合物C38和C39為鞣花酸或其同分異構(gòu)體。

表1 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 對(duì)玫瑰花、玫瑰茄、枸杞復(fù)合發(fā)酵液發(fā)酵前后有機(jī)酸成分的鑒定分析

續(xù)表1

注：*與對(duì)照品比對(duì)鑒定；+表示檢出；-表示未檢出；#表示該目標(biāo)化合物或其同分異構(gòu)體，下同。

3.2 黃酮類成分的鑒定

復(fù)合物中的黃酮類成分主要來(lái)自于玫瑰花和玫瑰茄，是以槲皮素或山柰酚為苷元的黃酮苷。黃酮糖苷類化合物的質(zhì)譜裂解一般為糖苷鍵斷裂，糖完全脫去后產(chǎn)生豐度最大的苷元離子，同時(shí)在ESI-MS2譜產(chǎn)生黃酮苷元開(kāi)環(huán)裂解后的一系列碎片離子峰。結(jié)果表明，復(fù)合物經(jīng)發(fā)酵后黃酮類成分由4種增加為6種，增加的2種均為黃酮苷元，分別是兒茶素和槲皮素，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，化合物F1的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z289.071 60，推斷其最可能的分子式為C15H13O6，誤差為1.38×10-6?；衔锝?jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后產(chǎn)生碎片離子m/z245[M-H-CO2]-，同時(shí)產(chǎn)生m/z203[M-H-C2H2O-CO2]-和m/z179[M-H-C2H2O-C3O2]-等特征碎片離子，結(jié)合對(duì)照品比對(duì)及文獻(xiàn)報(bào)道[17]，確定化合物F1為兒茶素。

化合物F2和F4的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-均為m/z609.145 01，根據(jù)所獲得的高分辨質(zhì)譜精確相對(duì)分子質(zhì)量以及多級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息，推斷最可能的元素組成為C27H29O16，誤差分別為1.91×10-6和1.31×10-6。研究表明，蕓香糖為鼠李糖基(1～6)葡萄糖基連接結(jié)構(gòu)，經(jīng)誘導(dǎo)裂解后，蕓香糖苷類物質(zhì)易直接失去蕓香糖殘基(308 Da)，產(chǎn)生[M-H-308]-離子。在化合物F2和F4的ESI-MS2譜中，它們的準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后產(chǎn)生m/z429[M-H-Glu-H2O]-、301[M-H-Rha-Glu]-、300[M-2H-Rha-Glu]-和255[M-H-Rha-Glu-H2O-CO]-等碎片離子。經(jīng)對(duì)照品及文獻(xiàn)[18]比對(duì)，化合物F4裂解途徑與蘆丁相似，其可能裂解途徑見(jiàn)圖2，因此推斷化合物F4為蘆丁，F(xiàn)2為其同分異構(gòu)體。

在負(fù)離子模式下，化合物F5的準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.035 06，誤差為2.59×10-6，元素組成為C15H9O7。化合物F5經(jīng)誘導(dǎo)裂解后連續(xù)丟失1分子CO2和1分子H2O產(chǎn)生m/z273的基峰離子。結(jié)合對(duì)照品比對(duì)，可將F5準(zhǔn)確鑒定為槲皮素。化合物F3的準(zhǔn)分子離子峰為m/z463.087 10，推斷其最可能的分子式為C21H19O12，其母離子經(jīng)裂解后產(chǎn)生碎片離子m/z301，質(zhì)量數(shù)減少162 Da，即丟失1分子葡萄糖殘基。而m/z301離子進(jìn)一步破裂產(chǎn)生的碎片離子與槲皮素一致，因此鑒定化合物F3為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

在保留時(shí)間71.37 min，化合物F6的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為593.129 82，根據(jù)元素組成分析，其分子式為C30H25O13。該離子在進(jìn)一步的質(zhì)譜裂解過(guò)程中丟失了308 Da，產(chǎn)生 ESI-MS2苷元基峰離子m/z285，表明其屬于蕓香糖苷。根據(jù)F6苷元離子進(jìn)一步裂解產(chǎn)生的碎片離子，推斷化合物F6為山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

3.3 花青素類成分的鑒定

花青素是一種存在于植物中的水溶性天然色素，安全性高，常用作食品的功能性天然色素，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抑制癡呆癥的發(fā)生和預(yù)防腦細(xì)胞變性等作用[19]?；ㄇ嗨厥敲倒寤懊倒迩训闹饕锘钚猿煞种?，其主要包括飛燕草素和矢車菊素的糖苷。本實(shí)驗(yàn)從復(fù)合物提取液中鑒定了3個(gè)花青素類成分；從復(fù)合物發(fā)酵液中鑒定了2個(gè)花青素類成分，結(jié)果見(jiàn)表3。

在負(fù)離子模式下，化合物A1和A2準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為m/z595.130 31和m/z595.130 55，保留時(shí)間分別為50.64、52.6 min，計(jì)算其精確分子式為C26H27O16，誤差均小于5×10-6。在其ESI-MS2譜中，m/z595經(jīng)誘導(dǎo)裂解后產(chǎn)生碎片離子m/z301，質(zhì)量數(shù)減少294 Da，即丟失1分子桑布雙糖(Sam)殘基。同時(shí)，還進(jìn)一步生成了m/z300[M-2H-Sam]-及255[M-H-Sam-H2O-CO]-等碎片離子，由此可將化合物 A1和A2鑒定為飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷。

圖2 蘆丁的裂解途徑(負(fù)離子模式)

表2 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 對(duì)玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子復(fù)合發(fā)酵液發(fā)酵前后黃酮類成分的鑒定分析

表3 HPLC-LTQ-Orbitrap MS 對(duì)玫瑰花、玫瑰茄、枸杞子復(fù)合發(fā)酵液發(fā)酵前后花青素類成分的鑒定分析

同理，化合物A3的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z579.135 93，推斷它最可能的分子式為C26H27O15，誤差為2.56×10-6。在其ESI-MS2譜中，m/z447離子中性丟失1分子桑布雙糖殘基，產(chǎn)生m/z285[M-H-Sam]-、284[M-2H-Sam]-和 223[M-H-Sam-CO2-H2O]-等碎片離子。結(jié)合對(duì)照品比對(duì)，可將A3準(zhǔn)確鑒定為矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷。

4 結(jié)論

現(xiàn)代中藥發(fā)酵研究是中藥領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵的過(guò)程中，發(fā)酵菌種通過(guò)產(chǎn)生多種酶類以及其他初級(jí)、次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)中藥進(jìn)行分解代謝，將許多人體不能直接吸收利用的大分子化合物降解成小分子化合物，并產(chǎn)生新的活性物質(zhì)和新的功能[20]；或產(chǎn)生破壁酶對(duì)中藥細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，促進(jìn)有效物質(zhì)的溶出，提高了其活性成分的濃度，有利于有效成分在人體的吸收和利用[21-22]。

本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子復(fù)合提取液和發(fā)酵液中的48種植物源性化學(xué)成分進(jìn)行了篩選鑒定，其中包括39種有機(jī)酸、6種黃酮以及3種花青素類成分。結(jié)果表明，復(fù)合提取液經(jīng)發(fā)酵后，各類成分種類及含量均發(fā)生不同程度的變化，如槲皮素及其糖苷衍生物。前期研究證明，脂溶性的槲皮素在胃部、小腸各段及結(jié)腸均可以被有效吸收，繼而發(fā)生進(jìn)一步的代謝轉(zhuǎn)化[23]；槲皮素糖苷類物質(zhì)的吸收則需要在體內(nèi)水解酶(如乳糖根皮苷酶)的作用下去糖基化，釋放出槲皮素再吸收[24]。本研究在玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子復(fù)合提取液中僅檢測(cè)到槲皮素-3-O-葡萄糖苷；而在發(fā)酵液中，既檢測(cè)到槲皮素-3-O-葡萄糖苷，也檢測(cè)到槲皮素，這可能是苷類成分在發(fā)酵菌種腸膜明串株菌腸膜亞種的作用下發(fā)生了水解，將糖苷類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子苷元，更利于有效成分在體內(nèi)發(fā)生廣泛的代謝和轉(zhuǎn)化。綜上所述，本研究為玫瑰花、玫瑰茄和枸杞子進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了新依據(jù)，并對(duì)現(xiàn)代中藥微生物發(fā)酵研究提供參考。