款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及其指紋圖譜研究△

許洪波，楊康，高春暉，毛晶晶， 4，蔡興航，張娛，許懷禮，張鷺，唐志書*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021；3.安康北醫(yī)大制藥股份有限公司，陜西 安康 725000；4.楊凌科森生物制藥有限責(zé)任公司，陜西 楊凌 712100

款冬花為菊科植物款冬TussliagofarfaraL.的干燥花蕾，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2]?？疃ㄎ缎?，性溫，歸肺經(jīng)，具有潤肺下氣，止咳化痰的功效[1]，是臨床常用中藥。2015版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)收載含款冬花的制劑有13個，如二母安嗽丸、川貝雪梨膏等。現(xiàn)代藥理研究表明，款冬花對呼吸、消化系統(tǒng)有一定作用[3-4]，此外，它還有鎮(zhèn)咳祛痰[5]和抗炎[6]等藥理作用。國內(nèi)外研究表明，款冬花的化學(xué)成分主要為倍半萜[7-9]、黃酮[10-12]、生物堿[13-14]、皂苷[7]和揮發(fā)油[15-16]等，其中倍半萜類成分款冬酮 (tussilagone) 被認(rèn)為是款冬花的特征成分，加之該化合物還具有抗炎、升壓等藥理作用[17-18]，其作為指標(biāo)成分被廣泛應(yīng)用于款冬花的質(zhì)量評價[18-19]。2015年版《中國藥典》即以款冬酮作為款冬花藥材和飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)，并規(guī)定其量不得少于0.070%。

目前，隨著中藥飲片形式的創(chuàng)新發(fā)展，破壁飲片、配方顆粒等多種現(xiàn)代中藥用藥形式不斷出現(xiàn)，一定程度上彌補了傳統(tǒng)中藥飲片攜帶和服用不便的諸多缺陷。其中，中藥配方顆粒以“凈、便、小、恵、精、穩(wěn)”的優(yōu)勢正方興未艾，但配方顆粒至今仍無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，各廠家產(chǎn)品質(zhì)量亦良莠不齊，故加強配方顆粒生產(chǎn)過程管控，統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)顯得尤為重要[20]。2016年，國家藥典委員會發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》 (以下簡稱《要求》)，提出將標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)、參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑，可作為一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)體系，標(biāo)化新型中藥制劑，保證其質(zhì)量穩(wěn)定、均一，確保臨床用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性[21]。與飲片相比，標(biāo)準(zhǔn)湯劑能夠體現(xiàn)煎煮工藝的影響；與配方顆粒相比，標(biāo)準(zhǔn)湯劑沒有輔料的干擾，更加接近臨床上直接服用的湯劑[22]。因此，《要求》中明確規(guī)定，中藥配方顆粒的所有藥學(xué)研究均須與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行對比，以保證與標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量一致性。

本研究以花類飲片——款冬花為研究對象，進(jìn)行其標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究，以《要求》為指導(dǎo)原則，收集款冬花3個道地產(chǎn)區(qū)的15批飲片制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，考察標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率，并建立其含量測定和指紋圖譜分析方法，計算指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率，以期為款冬花配方顆粒的制備和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀 (包含CBM-20A控制器、SPD-20A紫外檢測器、LC-20AT雙泵、CTO-20A柱溫箱、LC-solution色譜工作站)；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵、OLSB-5L/10L低溫冷卻液循環(huán)泵 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；HT-2109型電磁爐 (美的生活電器制造有限公司)；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (東京理化器械株式會社)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；Zirbus-Vaco5冷凍干燥機(jī) (德國Zirbus)；CPA2250型電子天平 (賽多利斯，精度：0.01 mg)。

1.2 試藥

甲醇、乙腈為色譜純 (德國默克公司)；實驗用水均為純凈水；款冬酮對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號：111884-201704，純度：99.1%)；其余試劑均為分析純。

本研究共收集甘肅、內(nèi)蒙古、河北3個產(chǎn)地共15批款冬花飲片，每個產(chǎn)地各5批，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王薇教授鑒定，同時按照《中國藥典》2015版一部款冬花項下薄層鑒別方法進(jìn)行鑒別。結(jié)果表明，本研究所收集的15批款冬花飲片均為菊科植物款冬T.farfaraL.的干燥花蕾。15批樣品分別編號為：S1～S15，其中S1～S5的產(chǎn)地為甘肅，S6～S10的產(chǎn)地為內(nèi)蒙古，S11～S15的產(chǎn)地為河北。

2 方法與結(jié)果

2.1 款冬花飲片浸出物測定

按照2015年版《中國藥典》中醇溶性浸出物測定法 (通則 2201) 項下的第二法進(jìn)行測定，測得15批款冬花飲片的浸出物為20.9%～27.4%，平均浸出物為24.5%。結(jié)果表明，15批樣品均符合《中國藥典》關(guān)于款冬花飲片浸出物不得少于20.0%的規(guī)定。

2.2 款冬花飲片中款冬酮的含量測定

按《中國藥典》2015年版一部款冬花飲片項下含量測定方法進(jìn)行檢測[1]，得款冬酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.146%～0.420% (見表1)，由結(jié)果可知，15批樣品均符合《中國藥典》中款冬花含量測定要求 (含款冬酮不得少于0.070%)。

表1 款冬花飲片測定結(jié)果 %

2.3 款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取款冬花飲片50 g，加入12倍量水浸泡30 min，煎煮30 min，趁熱過濾，藥渣再加入10倍量水，煎煮20 min，過濾，合并濾液；減壓濃縮至適量，進(jìn)行冷凍干燥，即得款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑中款冬酮的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Thermo ODS Hypersil(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-水(85∶15)為流動相[1]；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為220 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣20 μL。在此條件下，供試品溶液中款冬酮分離較好，其他成分無干擾 (見圖1)。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱定款冬酮對照品11.20 mg，加入流動相制成每1 mL含55.5 μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 提取溶劑的篩選：在《中國藥典》方法的基礎(chǔ)上，比較使用甲醇和乙醇進(jìn)行提取時的差異。1)藥典法[1]：取款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末1.0 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，精確加入10 mL乙醇；稱質(zhì)量，超聲處理1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液測定。2)甲醇提取法：在上述方法基礎(chǔ)上，僅將溶劑乙醇換為甲醇。采用同批次樣品 (S5) 進(jìn)行供試品制備，各制備3份供試品分別測定。結(jié)果表明，同批次樣品經(jīng)2種方法制備供試品后，《中國藥典》方法所得樣品中款冬酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.011 9%，甲醇提取所得樣品中款冬酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.012 0%，含量無明顯差異。本研究以甲醇為提取溶劑 (見表2)。

表2 不同提取方法款冬酮含量測定結(jié)果 %

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密移取對照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，按2.4.1方法進(jìn)樣，分別測定款冬酮的峰面積，以進(jìn)樣濃度 (μg·mL-1) 為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得款冬酮回歸方程為Y=26 323.81X+ 48.927，r=0.999 9，線性范圍為2.78～55.50 μg·mL-1。

2.4.5 精密度試驗 取同一份款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液 (S5)，按2.4.1色譜條件重復(fù)測定6次，計算款冬酮峰面積的RSD為0.79%。表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液 (S5)，分別在第0、2、4、8、12、24 h測定，計算款冬酮峰面積的RSD為2.42%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗 按照2.4.3方法平行制備6份供試品溶液 (S5)，按2.4.1色譜條件測定，計算款冬酮峰面積的RSD為2.74%。表明建立的方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收試驗 取已知含量的款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品 (S5) 6份，精密稱定，加入相同量的款冬酮，按照2.4.3項下方法制備供試品溶液，再按照2.4.1方法測定。計算供試品溶液中款冬酮回收率為97.64%～101.10%，平均加樣回收率為99.53%，RSD為1.30%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及轉(zhuǎn)移率

2.5.1 出膏率 本研究通過2.3項下方法制備款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑干浸膏，按公式(1)計算出膏率(見表3)。結(jié)果表明，15批款冬花出膏率為25.20%～44.08%，平均值為36.41%，RSD為4.21%。

出膏率=(干膏質(zhì)量/飲片質(zhì)量)×100%

(1)

2.5.2 款冬酮轉(zhuǎn)移率 按照公式(2)計算指標(biāo)成分款冬酮的轉(zhuǎn)移率 (見表3)，結(jié)果表明：15批款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分款冬酮的轉(zhuǎn)移率為0.60%～3.85%，平均轉(zhuǎn)移率為2.01%。

轉(zhuǎn)移率=(標(biāo)準(zhǔn)湯劑中款冬酮含量×出膏率)/飲片中款冬酮含量×100%

(2)

2.5.3 款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備數(shù)據(jù) 根據(jù)以上建立的色譜方法，對15批款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑測定結(jié)果 %

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 色譜條件 色譜柱為Thermo ODS Hypersil(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.03%甲酸溶液 (A) 和乙腈 (B)，梯度洗脫 (0～15 min，3%～15%B；15～20 min，15%～25%B；20～21 min，25%～35%B；21～30 min，35%～85%B；35 min，100%B)；流速為1 mL·min-1；柱溫為25 ℃；檢測波長為240 nm[18]，進(jìn)樣5 μL，測定，記錄對照品和供試品色譜圖 (見圖2)。

注：A.混合對照品；B.款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品；6.蘆?。?1.款冬酮。圖2 混合對照品、款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品HPLC 圖

2.6.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取款冬酮和蘆丁對照品適量，置于容量瓶中，用甲醇溶解定容，配置成每1 mL溶液含25 μg款冬酮、20 μg蘆丁的混合對照品溶液。

2.6.3 供試品溶液的制備 按照2.4.3項下方法制備，即得。

2.6.4 方法學(xué)考察 精密度試驗：取同一份款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品 (S5)，按照2.6.1項下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，并以款冬酮色譜峰為參照峰 (11號峰)，結(jié)果顯示：各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1.35%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一份款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品 (S5)，分別在0、2、4、8、12、24 h 按2.6.1項下條件進(jìn)樣測定。以款冬酮色譜峰為參照峰 (11號峰)，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一份款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品 (S5) 6 份，按2.6.3項下方法制備供試品溶液，按照2.6.1項下條件測定，以款冬酮色譜峰為參照峰 (11號峰)，結(jié)果表明：各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于2.7%，表明該方法重復(fù)性良好 (RSD<3%)。

2.6.5 樣品檢測及分析 取上述15批款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，分別按2.6.3項下方法制備供試品溶液，再按2.6.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。將15 批供試品色譜圖分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”(版本：2012.130723)，時間窗設(shè)為0.1，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜 (見圖3)，其中共有峰11個，通過對照品比對指認(rèn)2個，分別是6號峰 (蘆丁) 和11號峰 (款冬酮)。S1～S15指紋圖譜與共有模式對照指紋圖譜相似度分別為：0.937、0.990、0.981、0.996、0.990、0.992、0.963、0.981、0.986、0.983、0.992、0.988、0.983、0.981、0.994，均在0.90以上，符合指紋圖譜相似度要求，表明各批次款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較好的一致性 (見表4)。

3 討論

湯劑是中醫(yī)臨床最常用的傳統(tǒng)劑型之一，在治療和預(yù)防疾病方面發(fā)揮著重要作用。但傳統(tǒng)湯劑煎煮工藝粗放、攜帶服用不便、質(zhì)量不均和監(jiān)管困難等問題也日益凸顯，特別是《中國藥典》規(guī)定的藥材及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以直接反映湯劑的質(zhì)量，因此開展湯劑標(biāo)準(zhǔn)化研究對于中藥的臨床應(yīng)用具有重要意義[23]。2016 年，陳士林等[24]提出采用中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑來標(biāo)化不同用藥形式，以提高臨床用藥的準(zhǔn)確性和療效的一致性。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備必須以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，與臨床實際應(yīng)用保持一致 (傳統(tǒng)用藥習(xí)慣、煎煮方法及服用方法等)。同年，國家藥典委員會發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求 (征求意見稿)》為中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究提供了重要參考依據(jù)。

注：A.款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜；B.對照指紋圖譜。圖3 15批款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜及其對照指紋圖譜

表4 15批款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度

本研究所采用的款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝是遵照《要求》中的相關(guān)規(guī)定，經(jīng)煎煮、固液分離、低溫減壓濃縮、冷凍干燥后制得。本研究共收集了3個產(chǎn)地15批款冬花飲片樣品，樣品具有一定的代表性。在實驗前對飲片進(jìn)行了檢測，樣品符合2015年版《中國藥典》款冬花中的規(guī)定，同時在標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備過程中遵循統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化操作，以保障所得標(biāo)準(zhǔn)湯劑具備衡量臨床不同用藥形式的能力。

款冬花中含有的特征性成分為倍半萜類化合物，目前，已從款冬花中發(fā)現(xiàn)的此類化合物僅有10余個，其中款冬酮為此類型成分中含量較高的化合物[25]，2015 年版《中國藥典》將款冬酮作為款冬花藥材和飲片含量測定的指標(biāo)成分，并規(guī)定該成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.070%?？紤]到款冬酮的特征性及與《中國藥典》中款冬花飲片含量測定的一致性，本研究選擇款冬酮作為指標(biāo)成分，用于款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。但實驗結(jié)果表明，以款冬酮計算的15批款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率為0.60%～3.85%，平均轉(zhuǎn)移率為2.01%，轉(zhuǎn)移率較低，這與文獻(xiàn)報道的脂溶性成分在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的轉(zhuǎn)移率較低相一致[23，26]。該結(jié)果進(jìn)一步提示，在中藥產(chǎn)品如標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒等的質(zhì)量控制中，要充分考慮到產(chǎn)品的組成成分與藥材或飲片不同，其質(zhì)量評價方法不能完全參照《中國藥典》規(guī)定的藥材或飲片的質(zhì)控方法，特別是選擇脂溶性成分為指標(biāo)時，需要慎重。

此前，關(guān)于款冬花多指標(biāo)成分含量測定及指紋圖譜的研究雖已有報道[18，27]，但研究多針對其醇提取部位，未能較好地反映其傳統(tǒng)用藥形式——湯液的質(zhì)量。本研究構(gòu)建了款冬花水煎液的HPLC指紋圖譜方法，結(jié)果表明該方法簡便準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制。通過對15批款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其共有峰11個，且相似度良好，表明所得款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)輪廓相似度高。

總之，本研究根據(jù)《要求》中相關(guān)描述，確定了款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的相應(yīng)工藝參數(shù)，制備了15批不同產(chǎn)地的款冬花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并從指標(biāo)性成分的測定及其轉(zhuǎn)移率、出膏率和指紋圖譜建立方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，研究結(jié)果可為款冬花標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的制備及質(zhì)量控制提供參考，同時也為款冬花的不同臨床用藥形式之間的評價提供數(shù)據(jù)資料。