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    肝癌模型小鼠中線粒體源外泌體 基因的差異性表達(dá)分析

    2020-05-18 20:24:38龍曉芳李根亮唐玉蓮倪安妮陸瑞群李曙波韋海聞藍(lán)丹陳榮彬
    右江醫(yī)學(xué) 2020年4期
    關(guān)鍵詞:差異表達(dá)基因肝細(xì)胞癌外泌體

    龍曉芳 李根亮 唐玉蓮 倪安妮 陸瑞群 李曙波 韋海聞 藍(lán)丹 陳榮彬

    【摘要】 目的 探討線粒體源外泌體基因參與肝細(xì)胞癌(HCC)病理過程的可能分子機(jī)制。

    方法 通過RNA-seq和生物信息學(xué)手段,分析HCC中差異表達(dá)的線粒體源外泌體基因(DEMEs)及其生物學(xué)功能。

    結(jié)果 HCC組織中共鑒定出93個(gè)DEMEs,其中74個(gè)表達(dá)下調(diào),19個(gè)表達(dá)上調(diào)。表達(dá)下調(diào)的DEMEs經(jīng)功能富集,共富集到4個(gè)生物學(xué)過程(biological process,BP)、4個(gè)細(xì)胞組分(cellular component,CC)、2個(gè)分子活性(molecular function,MF)、1個(gè)信號(hào)通路(KEGG pathway,KG)和4個(gè)蛋白位點(diǎn)序列特征(UP_SEQ_FEATURE,US)。它們參與了氧化還原、脂質(zhì)代謝等過程,且大量DEMEs還具有線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽功能。而上調(diào)表達(dá)的DEMEs,除了富集到1個(gè)CC,即線粒體組分,還發(fā)現(xiàn)其中一些參與了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)過氧化氫和對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)過程,有些還具有轉(zhuǎn)移酶活性和ATP結(jié)合能力,并參與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等病理過程。

    結(jié)論 線粒體源外泌體基因在HCC腫瘤組織與非腫瘤組織存在差異性表達(dá),生物信息學(xué)分析顯示這種差異性表達(dá)的基因涉及多個(gè)生物學(xué)過程,提示它們可能通過多種途徑影響HCC的發(fā)生。

    【關(guān)鍵詞】 肝細(xì)胞癌;外泌體;線粒體;差異表達(dá)基因

    中圖分類號(hào):R735.7?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A?? DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2020.04.002

    Analysis of differential expression of mitochondrion-derived exosomal genes in hepatocellular carcinoma model mice

    LONG Xiaofang1,LI Genliang2,TANG Yulian2,NI Anni2,LU Ruiqun2,LI Shubo2,WEI Haiwen1,LAN Dan1,CHEN Rongbin1

    (1.Clinical Medicine of Grade 2016,2.Department of Biochemistry and Molecular Cell Biology,Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,Guangxi,China)

    【Abstract】 Objective To investigate the possible molecular mechanism of mitochondrion-derived exosomal exosome genes(DEMEs) involved in the pathological process of hepatocellular carcinoma(HCC).

    Methods The?? DEMEs in HCC and their biological functions were analyzed by RNA-seq and bioinformatics methods.

    Results 93 DEMEs were identified in HCC,among which 74 were down-regulated and 19 were upregulated.The down-regulated DEMEs were functionally enriched to 4 biological processes(BPs),4 cellular components (CCs),2 molecular functions (MFs),1 signal pathway (KG) and 4 UP-Seq features (USs).They involved in redox and lipid metabolism and majority of DEMEs had mitochondrial transport peptide-encoding sequences.The up-regulated DEMEs,in addition to the enrichment of 1 CC,i.e.mitochondrial component,were also found to be involved in the transmembrane transport,the reaction to hydrogen peroxide and mechanical stimulation,some of them also had transferase activity and the? ATP binding ability,and involved in the occurrence and metastasis of cancer and other pathological processes.

    Conclusion Mitochondrion-derived exosomal genes are differentially expressed in HCC tumor and non-tumor tissues.Bioinformatics analysis shows that the DEMEs are involved many biological processes,suggesting that they may affect the development of HCC in various ways.

    【Key words】 HCC;exosomes;mitochondria;differentially expressed genes

    肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界高發(fā)的癌癥之一。據(jù)報(bào)道,2018年全球HCC新發(fā)病例約84.2萬(wàn)人,死亡病例78.2萬(wàn)人[1]。外泌體是細(xì)胞分泌的小囊泡,在人體生理病理過程中發(fā)揮著重要作用,廣泛參與細(xì)胞間通訊、血管再生、細(xì)胞遷移、免疫應(yīng)答及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2~5]。來自腫瘤細(xì)胞的外泌體能將來源于母體腫瘤細(xì)胞的信息傳遞給正常細(xì)胞或惡性細(xì)胞[6]。線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心,線粒體功能障礙與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7~9]。但線粒體源外泌體基因通過何種機(jī)制參與HCC的發(fā)展這一問題還有待進(jìn)一步研究。本文旨在通過分析HCC腫瘤組織和非腫瘤組織中差異表達(dá)的線粒體源外泌體基因(differentially expressed mitochondrion-derived exosomal genes,DEMEs),探討其參與HCC發(fā)展的可能分子機(jī)制,為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

    肝癌腫瘤組織取自本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的肝癌模型小鼠(n=40)。肝癌模型小鼠構(gòu)建方法如下:選取40只鼠齡7周左右、體重25 g左右的健康昆明小鼠于雙前肢腋下一次性注射H22肝癌細(xì)胞株(濃度=10 5個(gè)細(xì)胞/mL),每只注射0.2 mL,正常飼養(yǎng)1個(gè)月后,成瘤小鼠即為肝癌模型小鼠,取其腫瘤組織為腫瘤樣本組織。同法,取另40只健康小鼠無菌生理鹽水注射(0.2 mL/只)作為對(duì)照組,取健康肝組織對(duì)照。取同組內(nèi)樣本組織等量混合約50 g,提取總RNA(Eastep Super總RNA提取試劑盒,中國(guó)上海),送公司進(jìn)行測(cè)序分析。RNA-seq質(zhì)量檢測(cè)及clean reads篩選按常規(guī)程序完成[10]。

    1.2 DEMEs的篩選

    分析RNA-seq數(shù)據(jù),篩選HCC腫瘤組織和非腫瘤肝組織之間的差異表達(dá)基因,差異表達(dá)基因篩選以RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads,每百萬(wàn)測(cè)序堿基中每千個(gè)轉(zhuǎn)錄子測(cè)序堿基中所包含的測(cè)序片斷數(shù))比值≥2或≤0.5為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而后以“癌癥(cancer or carcinoma)、外泌體(exosome or exosomal)及線粒體(mitochondria or mitochondrial)”為關(guān)鍵詞,在NCBI中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進(jìn)行檢索,獲得癌癥線粒體源外泌體基因作為背景基因。將背景基因與RNA-seq數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)基因進(jìn)行比對(duì),獲得DEMEs。

    1.3 DEMEs的功能分析

    利用DAVID 6.8在線軟件(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)DEMEs進(jìn)行功能富集分析,并對(duì)富集到的生物學(xué)程序(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子活性(molecular function,MF)、信號(hào)通路(KEGG pathway,KG)、蛋白位點(diǎn)序列特征(UP_SEQ_FEATURE,US)和功能部位(Interpro)等進(jìn)行功能注釋聚類,以FDR值(false discovery rate,錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    1.4 DEMEs編碼蛋白的互作分析

    通過STRING11.0版本軟件(https://string-db.org/)在線對(duì)DEMEs編碼蛋白進(jìn)行互作分析,以評(píng)價(jià)其在分布和功能上的相關(guān)性。

    2 結(jié)? 果

    2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)

    肝癌腫瘤組織和非腫瘤肝組織樣本通過RNA-seq分別獲得了5.86 G base(39.99 M clean reads)和6.35 G base (43.33 M clean reads)的測(cè)序數(shù)據(jù)。二者的Q30分別為93.62%和93.62%,表明堿基測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.1%,測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量好,測(cè)序的覆蓋度和深度較高,可用于后續(xù)分析使用。經(jīng)過分析,在兩樣本之間共發(fā)現(xiàn)4483個(gè)差異表達(dá)基因。

    2.2 DEMEs篩選

    在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得了5435個(gè)癌癥相關(guān)線粒體源外泌體基因。與測(cè)序數(shù)據(jù)中的4483個(gè)差異表達(dá)基因比對(duì),共篩選出93個(gè)DEMEs,其中表達(dá)上調(diào)的19個(gè)(見表1),表達(dá)下調(diào)的74個(gè)(見表2)。

    2.3 DEMEs的生物學(xué)功能

    對(duì)篩選出的DEMEs通過DAVID 6.8軟件進(jìn)行了功能富集。其中,在HCC中下調(diào)表達(dá)的74個(gè)DEMEs共富集到4個(gè)BP、4個(gè)CC、2個(gè)MF、1個(gè)KG和4個(gè)US(圖1)。從BP可以看出,24個(gè)基因參與了氧化還原過程,16個(gè)基因參與了脂類代謝過程等。從MF可以看出,這些分子具有氧化還原酶活性和催化活性等。且表達(dá)下調(diào)的這74個(gè)DEMEs中,73個(gè)屬于線粒體組分,且其中31個(gè)具有線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽功能。而表達(dá)上調(diào)的DEMEs,僅富集到了1個(gè)CC,即線粒體組分(見圖1)。另外,上調(diào)表達(dá)的DEMEs中,SFXN3、SLC25A24和SLC25A4 三個(gè)基因參與了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn);SRC和MMP2兩個(gè)基因參與了對(duì)過氧化氫及對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng);RIPK3、ALDH18A1、OXCT1、PDSS1、AGPS和SRC等6個(gè)基因還具有轉(zhuǎn)移酶活性;RIPK3、SPATA5、ALDH18A1、RAD51、SRC等5個(gè)基因具有ATP結(jié)合能力。DEMEs編碼蛋白的互作關(guān)系見圖2。

    3 討? 論

    外泌體是包涵蛋白質(zhì)、RNA和miRNA等多種物質(zhì)的胞外膜囊細(xì)胞器。外泌體內(nèi)容物并不是由細(xì)胞隨機(jī)裝配而分泌到細(xì)胞外環(huán)境中,而是受到細(xì)胞的精細(xì)調(diào)節(jié),其內(nèi)容物反映了來源細(xì)胞的功能,并參與細(xì)胞間的各種信息傳遞及物質(zhì)交換[11]。線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心,與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。而外泌體攜帶的線粒體相關(guān)基因則可能會(huì)影響靶標(biāo)組織細(xì)胞的能量代謝。

    本研究通過RNA-seq和生物信息學(xué)手段及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,在HCC組織中共鑒定出93個(gè)DEMEs,其中74個(gè)基因表達(dá)下調(diào),19個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。這些DEMEs的功能也主要富集于下調(diào)表達(dá)基因中。這一結(jié)果也得到了這些基因編碼蛋白互作關(guān)系的驗(yàn)證。這些功能包括氧化還原過程、脂質(zhì)代謝過程、氧化還原酶活性、催化活性等。尤其值得一提的是,在下調(diào)表達(dá)的DEMEs中,有31個(gè)基因具有線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽功能。這些結(jié)果表明,HCC組織中外泌體攜帶的線粒體相關(guān)基因有顯著減少的趨勢(shì),且這些減少的基因參與了重要的能量代謝過程。也就是說,線粒體源外泌體基因在正常組織中可能通過外泌體的運(yùn)輸,以轉(zhuǎn)運(yùn)肽介導(dǎo)的方式定位于新靶標(biāo)細(xì)胞的線粒體膜上,從而參與有氧呼吸過程的能量代謝。由于癌細(xì)胞的能量代謝主要是通過無氧呼吸提供的[12],因此DEMEs在HCC中的減少可能有利于癌組織的無氧呼吸,從而有利于癌細(xì)胞的生存。但是,HCC中DEMEs的減少是癌變的結(jié)果,還是癌變的原因,這還有待進(jìn)一步研究。無論是癌變的結(jié)果還是原因,都為我們提示了一條抑制癌細(xì)胞增殖的可能新途徑,即通過外泌體途徑增加癌組織中的DEMEs,從而促進(jìn)HCC組織中的有氧呼吸,來抑制HCC細(xì)胞的增殖。

    而上調(diào)表達(dá)的DEMEs除了富集到1個(gè)CC即線粒體組分外,沒有富集到其他功能,表明上調(diào)表達(dá)的DEMEs對(duì)HCC的能量代謝影響較小。但是,上調(diào)表達(dá)的基因還參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)過氧化氫和對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng),有些還具有轉(zhuǎn)移酶活性和ATP結(jié)合能力。其中,ALDH5A1不僅與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[13],還與卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。還有MMP2是Ⅳ型膠原酶,參與血管系統(tǒng)重塑、血管生成、組織修復(fù)、腫瘤浸潤(rùn)、炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂等多種功能,除降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白外,還可以作用于多種非基質(zhì)蛋白,例如大內(nèi)皮1和促進(jìn)血管收縮的Β型CGRP。此外,有報(bào)道稱MMP2還能通過調(diào)節(jié)GSK3β的活性促進(jìn)心肌氧化應(yīng)激,參與心肌細(xì)胞死亡途徑。這些結(jié)果表明,上調(diào)表達(dá)的DEMEs在HCC中可能具有利用ATP參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及參與對(duì)過氧化氫和對(duì)機(jī)械刺激反應(yīng)的生理功能,進(jìn)而影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展和遷移。該現(xiàn)象也為我們提示了另一條抑制癌細(xì)胞增殖的可能新途徑,即通過抑制利用ATP參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、參與對(duì)過氧化氫和對(duì)機(jī)械刺激反應(yīng)相關(guān)的DEMEs,來抑制HCC細(xì)胞的活性。

    綜上所述,我們的結(jié)果顯示線粒體源外泌體基因在HCC腫瘤組織與非腫瘤組織存在差異性表達(dá),生物信息學(xué)分析顯示這種差異性表達(dá)的基因涉及多個(gè)生物學(xué)過程,提示它們可能通過多種方式影響HCC的發(fā)生。在HCC中,差異表達(dá)的線粒體源外泌體基因可能主要是通過減弱HCC組織中的有氧呼吸和增強(qiáng)利用ATP參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)過氧化氫和對(duì)機(jī)械刺激反應(yīng),來影響癌癥的病理過程。研究結(jié)果為我們提示了2條可能抑制癌細(xì)胞增殖的新途徑,即通過外泌體途徑增加癌組織中有氧呼吸相關(guān)的DEMEs,或抑制利用ATP參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、參與對(duì)過氧化氫和對(duì)機(jī)械刺激反應(yīng)相關(guān)的DEMEs,來促進(jìn)HCC組織中的有氧呼吸和抑制HCC細(xì)胞的活性。今后,我們將持續(xù)探討這2條抑制癌細(xì)胞增殖的可能新途徑,以期對(duì)其作用機(jī)制有更深入的了解,為臨床肝癌的治療和預(yù)防提供更可靠的理論依據(jù)。另外對(duì)于本實(shí)驗(yàn)獲得的差異性表達(dá)基因沒有提供qPCR驗(yàn)證分析,可能是本研究的一個(gè)缺陷,由于我們此次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)樣本與本實(shí)驗(yàn)室前期的一項(xiàng)研究[10]所用樣本為同一批次樣本,測(cè)序數(shù)據(jù)相同,前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證,驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果與qPCR結(jié)果是一致的。故此次實(shí)驗(yàn)未對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證分析。

    參 考 文 獻(xiàn)

    [1] ?向陽(yáng)林,馮智浩,龔建平.外泌體在肝癌發(fā)生發(fā)展中的研究新進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2019,16(17):2575-2578.

    [2] ?ZHAO L W,GU C Y,GAN Y,et al.Exosome-mediated siRNA delivery to suppress postoperative breast cancer metastasis[J].J Control Release,2020,318:1-15.

    [3] ?LU Y,DUAN Y,XU Q,et al.Circulating exosome-derived bona fide long non-coding RNAs predicting the occurrence and metastasis of hepatocellular carcinoma[J].J Cell Mol Med,2020,24(2):1311-1318.

    [4] ?AN T X,QIN S H,XU Y,et al.Exosomes serve as tumour markers for personalized diagnostics owing to their important role in cancer metastasis[J].J Extracell Vesicles,2015,4:27522.

    [5] ?WHITESIDE T L.Exosomes and tumor-mediated immune suppression[J].J Clin Invest,2016,126(4):1216-1223.

    [6] ?BOYIADZIS M,WHITESIDE T L.Information transfer by exosomes:a new frontier in hematologic malignancies[J].Blood Rev,2015,29(5):281-290.

    [7] ?莊昊.GLDC調(diào)控cofilin泛素化影響肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2018.

    [8] ?孫瑞,胡元昭,商容磊,等.線粒體脫氧鳥苷激酶在肺癌腫瘤發(fā)生中的作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)科學(xué)(生命科學(xué)),2019,49(7):893-901.

    [9] ?張利桃,楊利軍,楊濤.線粒體核糖體蛋白質(zhì)與人類惡性腫瘤[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2019,35(6):620-624.

    [10] ?LI G? L,NI A N,YU M Y.Pretumor microenvironment of hepatocellular carcinoma: Cancerization or anticancerization? [J].Gene,2019,701:46-54.

    [11] ?宋蕙晨,李偉利,褚丹萍,等.肝癌細(xì)胞外泌體蛋白組成分析[J].生命科學(xué)儀器,2017,15(1):26-31.

    [12] ?WARBURG O.ber den heutigen Stand des Carcinomproblems[J].Naturwissenschaften,1927,15(1):1-4.

    [13] ?高菲,周斌,徐俊馳,等.LGR5和ALDH1A1在非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展和預(yù)后中的作用[J].中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志,2018,38(5):325-330.

    [14] ?田訓(xùn).ALDH5A1對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)影響及與卵巢漿液性乳頭狀腺癌預(yù)后關(guān)系的研究[D].武漢:華中科技大學(xué),2017.

    (收稿日期:2019-12-02 修回日期:2020-02-14)

    (編輯:潘明志)

    基金項(xiàng)目:廣西大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201810599096);2020年廣西學(xué)位與研究生教育改革課題(JGY2020164);廣西自然科學(xué)基金(2016GXNSFAA380177,2015GXNSFAA139219)

    作者簡(jiǎn)介:龍曉芳,女,在讀本科生。E-mail:437443986@qq.com

    通信作者:李根亮。E-mail:ligenliang@163.com

    [本文引用格式]龍曉芳,李根亮,唐玉蓮,等.肝癌模型小鼠中線粒體源外泌體基因的差異性表達(dá)分析[J].右江醫(yī)學(xué),2020,48(4):246-251.

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