烏龍茶多糖脫色和脫蛋白工藝研究

黃秀紅 劉麗辰 阮懌航 彭啟良 程博思 林金科，2＊

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 福州 350002）

茶多糖是茶葉中一種有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、清除自由基、抗疲勞、抗凝血、抗血栓作用、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抑菌、抗病毒活性等功能[1-4]。

茶葉粗多糖中含有蛋白質(zhì)等多種雜質(zhì)，因此需要進(jìn)行脫蛋白處理。目前常采用的脫蛋白方法有酶法、Savage法、NaOH 法、三氟三氯乙烷法、等電點(diǎn)法、陰離子交換樹脂法、三氯乙酸法等[5-8]。

茶葉中含有多種色素，其中多酚類物質(zhì)在多糖的提取分離中影響最大，酚類物質(zhì)容易氧化，對(duì)茶多糖的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理具有重要的影響，所以需要對(duì)茶多糖進(jìn)行脫色處理[9]。目前植物多糖常用的脫色方法有活性炭法、過氧化氫法、纖維素層析法、分級(jí)沉淀法、大孔樹脂脫色法等方法[6，10-11]。

為了獲得更高多糖提取率尋求安全綠色環(huán)保茶多糖脫色脫蛋白工藝，本實(shí)驗(yàn)以烏龍茶多糖為研究對(duì)象，比較活性炭、木瓜蛋白酶、AB-8樹脂、D101樹脂、PHD500樹脂的脫色脫蛋白效果，篩選出安全的烏龍茶多糖脫色脫蛋白方法，為茶多糖的提取純化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏龍茶：購(gòu)買于福建惜緣茶葉有限公司；考馬斯亮蘭試劑盒：南京建成生物工程研究所；D-半乳糖醛酸：上海麥克林生物化學(xué)有限公司；雙縮脲法蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒：索萊寶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶：北京Solarbio公司；AB-8樹脂、D-101樹脂、 PHD-500樹脂、活性炭：鄭州勤實(shí)科技有限公司；無(wú)水乙醇、重蒸苯酚、濃硫酸、乙酸乙酯、葡萄糖；購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

恒溫水浴鍋(HH-6)：國(guó)華電器有限公司；水浴搖床(MQS-30S)：旻泉儀器有限公司；電子天平(GL-124-1SCNsartorius)：上海精天電子儀器有限公司；可見分光光度計(jì)(721N)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī) (LGJ-12)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗烏龍茶多糖的制備

將干燥的烏龍茶用高速粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，放冰箱備用。精確稱取2.00 g茶粉于離心管中，按料液比1：20 g/mL的比例加蒸餾水，于60℃下恒溫浸提，用抽濾機(jī)抽濾，再用高速離心機(jī)離心30 min(3500 r/min)取上清液，將上清液濃縮，加入5倍體積的無(wú)水乙醇，靜置過夜，次日離心30 min(3500 r/min)收集沉淀，分別用無(wú)水乙醇、乙酸乙酯洗滌沉淀，每次洗滌充分?jǐn)嚢?，最后高速離心機(jī)離心30 min(3500 r/min)取沉淀，將沉淀置于真空冷凍干燥機(jī)中，得到粗烏龍茶多糖，粗多糖的得率為4.63%。

1.2.2 脫色工藝的研究

1.2.2.1 活性炭脫色 參照劉力萍[7]的方法進(jìn)行略微修改。

1.2.2.2 大孔樹脂脫色

大孔樹脂的預(yù)處理 參照馬若影[10]的方法進(jìn)行大孔樹脂的預(yù)處理。

篩選最佳大孔樹脂 參照馬若影[10]的方法進(jìn)行。

1.2.2.3 測(cè)定方法 按照馬若影[10]的方法進(jìn)行。

1.2.2.4 脫色效果評(píng)價(jià)方法 參照劉力萍等[7]的方法進(jìn)行。

1.2.3 脫蛋白工藝研究

1.2.3.1 木瓜蛋白酶脫蛋白 參照陳麗娟[13]的方法進(jìn)行。

1.2.3.2 大孔樹脂脫蛋白 參照馬若影[10]的方法進(jìn)行并稍微修改。

1.2.3.3 測(cè)定方法

蛋白脫除率 根據(jù)考馬斯亮蘭試劑盒說明書的方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.3.4 脫蛋白效果評(píng)價(jià)方法 參照賈文聰?shù)萚14]的方法進(jìn)行。

1.2.4 茶多糖化學(xué)成分分析

中性糖含量的測(cè)定 參照苯酚-硫酸法[12]進(jìn)行測(cè)定。

蛋白質(zhì)含量的的測(cè)定 根據(jù)雙縮脲法蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試盒說明書的方法，于波長(zhǎng)540nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

糖醛酸含量的測(cè)定 參照邵淑宏[6]的方法測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法

所有的試驗(yàn)均平行重復(fù)3次，使用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中p＜0.05具有顯著性差異，p＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫色方法對(duì)烏龍茶多糖脫色效果差異分析

2.1.1 活性炭脫色

在0.03-0.12g/mL時(shí)，隨著活性炭用量的增加，烏龍茶多糖的脫色率先快速增加后緩慢增加，而多糖保留率逐漸減少(見圖1)。當(dāng)活性炭用量在0.03-0.06 g/mL時(shí)，脫色率增加明顯，在0.06-0.12 g/mL時(shí)，脫色率增加緩慢，但是多糖保留率下降較快。當(dāng)活性炭用量為0.06g/mL，烏龍茶多糖的脫色率為72.11%，多糖的保留率為39.62%。因此，活性炭的最佳用量為0.06 g/mL。

圖1 活性炭用量對(duì)茶多糖脫色率的影響

2.1.2大孔樹脂脫色

當(dāng)AB-8樹脂在0.2-0.8g/mL時(shí)，隨著樹脂用量的增加，烏龍茶多糖的脫色率在上升，多糖保留率在下降（見圖2）。當(dāng)樹脂在0.2-0.6g/mL時(shí)，脫色率增加緩慢，多糖保留率明顯下降。在0.6-0.8g/mL時(shí)，脫色率增加緩慢，且多糖保留率低。當(dāng)樹脂用量在0.2g/mL時(shí)，烏龍茶多糖的脫色率為26.99%，多糖的保留率為67.44%。綜合來看，AB-8樹脂的最佳用量為0.2g/mL。

圖2 AB-8樹脂用量對(duì)茶多糖脫色率的影響

當(dāng)D101樹脂在0.2-0.8g/mL時(shí)，隨著樹脂用量的增加，烏龍茶多糖的脫色率先緩慢增加后快速增加，而多糖保留率逐漸減少（見圖3）。當(dāng)樹脂用量在0.2g/mL時(shí)，烏龍茶多糖的脫色率為19.04%，多糖的保留率為69.67%。此時(shí)，樹脂用量少，但是脫色率效果較好，且多糖率較高。綜合來看，D101樹脂的最佳用量為0.2g/mL。

圖3 D101樹脂用量對(duì)茶多糖脫色率的影響

在0.2-0.8g/mL時(shí)，隨著樹脂用量的增加，烏龍茶多糖的脫色率先緩慢增加后快速增加，而多糖保留率逐漸減少（見圖4）。當(dāng)樹脂用量在0.2g/mL時(shí)，烏龍茶多糖的蛋白脫除率為23.19%，多糖的保留率為70.78%。此時(shí)，樹脂用量少，但是脫色率效果較好，且多糖率較高。綜合來看，樹脂PHD500的最佳用量為0.2g/mL。

圖4 PHD500樹脂用量對(duì)茶多糖脫色率的影響

2.1.3不同脫色方法脫色效果評(píng)價(jià)

以脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，比較四種脫色劑的脫色效果。結(jié)果如表1，活性炭的脫色率最好（P＜0.05），但是多糖保留率也最低（P＜0.05）；AB-8樹脂的脫色率低于活性炭（P＜0.05），高于D101樹脂（P＜0.05）和PHD500樹脂，但是多糖保留率低于活性炭（P＜0.05）、D101樹脂和PHD500樹脂（P＜0.05）。D101樹脂的脫色率最低，與活性炭、AB-8樹脂和PHD500樹脂差異顯著(P＜0.05）。從加權(quán)評(píng)分法分析可以看出活性炭的評(píng)分最高，PHD500樹脂次之。但是從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用活性炭脫色過程中會(huì)有黑色素殘留。綜合考察，選擇PHD500樹脂對(duì)烏龍茶多糖進(jìn)行脫色處理。

表1 4種脫色方式脫色結(jié)果比較

2.2 不同脫蛋白方法對(duì)烏龍茶多糖脫蛋白效果差異分析

2.2.1 木瓜蛋白酶脫蛋白

當(dāng)木瓜蛋白酶添加量在2-8%時(shí)，隨著酶添加量的增加蛋白脫除率在上升，多糖保留率在下降（見圖5）。當(dāng)木瓜蛋白酶添加量在2-6%時(shí)，蛋白脫除率有明顯的增加。在6-8%時(shí)，蛋白脫除率仍有增加，并且多糖保留率下降緩慢。當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為8%時(shí)，烏龍茶多糖的蛋白脫除率為56.03%，多糖的保留率為56.85%。因此，木瓜蛋白酶的最佳添加量為8%。

圖5 木瓜蛋白酶添加量對(duì)茶多糖蛋白脫除率的影響

2.2.2 大孔樹脂脫蛋白

當(dāng)AB-8樹脂用量在0.2-0.8g/mL時(shí)，隨著樹脂用量的增加，多糖保留率下降（見圖6）。當(dāng)樹脂用量在0.2g/mL時(shí)，烏龍茶多糖的蛋白脫除率為57.76%，多糖的保留率為66.44%。此時(shí)，樹脂用量少，但是脫色率效果較好，且多糖率較高。綜合來看，樹脂AB-8的最佳用量為0.2g/mL。

圖6 AB-8樹脂用量對(duì)茶多糖蛋白脫除率的影響

當(dāng)D101樹脂在0.2-0.8g/mL時(shí)，隨著樹脂用量的增加蛋白脫除率在上升，多糖保留率在下降（見圖7）。當(dāng)樹脂用量在0.8g/mL時(shí)，烏龍茶多糖的蛋白脫除率為51.19%，多糖的保留率為49.99%。此時(shí)，樹脂用量少，但是脫色率效果較好，且多糖率較高。綜合來看，樹脂D101的最佳用量為0.8g/mL。

圖7 D101樹脂用量對(duì)茶多糖蛋白脫除率的影響

當(dāng)PHD500樹脂在0.2-0.8g/mL時(shí)，隨著樹脂用量的增加蛋白脫除率在上升，多糖保留率在下降（見圖8）。當(dāng)樹脂在0.2-0.4g/mL時(shí)，蛋白脫除率增加緩慢，多糖保留率下降明顯。在0.4-0.8g/mL時(shí)，雖然蛋白脫除率增加快，但是多糖保留率低。當(dāng)樹脂用量在0.2g/mL時(shí)，烏龍茶多糖的蛋白脫除率為15.48%，多糖的保留率為66.86%。因此，樹脂PHD500的最佳用量為0.2g/mL。

圖8 PHD500樹脂用量對(duì)茶多糖蛋白脫除率的影響

2.3 不同脫蛋白方法脫蛋白效果評(píng)價(jià)

以蛋白脫除率和多糖保留率為指標(biāo)，比較四種脫蛋白方法。結(jié)果如表2，木瓜蛋白酶的蛋白脫除率低于AB-8樹脂，多糖保留率高于D101樹脂；AB-8樹脂的蛋白脫除率最好，但是多糖保留率低于PHD500樹脂（P＜0.05）；D101樹脂的蛋白脫除率低于木瓜蛋白酶和AB-8樹脂（P＜0.05），且D101樹脂的多糖保留率最低（P＜0.05）；PHD500樹脂的蛋白脫除率最低（P＜0.05），但是多糖保留率最好（P＜0.05）。從加權(quán)評(píng)分法分析可以看出AB-8樹脂的評(píng)分最高。因此，選擇AB-8樹脂對(duì)烏龍茶多糖進(jìn)行脫蛋白處理。

表2 4種脫蛋白方式脫蛋白結(jié)果比較

2.4 茶多糖化學(xué)成分分析結(jié)果

為確定烏龍茶多糖的理化指標(biāo)，選取蛋白質(zhì)、中性糖、和糖醛酸3個(gè)指標(biāo)，計(jì)算各理化指標(biāo)的含量(見表3)。由表3可知，烏龍茶多糖中蛋白質(zhì)含量為18.04%，中性糖含量為33.23%，糖醛酸含量為39.35%，表明茶多糖中主要為中性糖和糖醛酸，并且含有蛋白質(zhì)。

表3 烏龍茶多糖的化學(xué)成分

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以脫色率和脫色率與多糖保留率為指標(biāo)，通過比較4種脫色劑對(duì)烏龍茶多糖進(jìn)行脫色，確定PHD500樹脂的脫色率效果最好，脫色率效果評(píng)分最高；以蛋白脫除率和多糖保留率為指標(biāo)，對(duì)4種脫蛋白方法進(jìn)行比較，確定AB-8樹脂的脫蛋白效果最好，蛋白脫除率效果評(píng)分最高。AB-8是弱極性樹脂，比較適用于弱極性物質(zhì)的提取分離和純化，PHD500是極性樹脂，面對(duì)極性大的物質(zhì)吸附能力較強(qiáng)，而色素和蛋白的極性較強(qiáng)。綜合考慮，選用AB-8為了提高脫色率、脫蛋白率的效果，節(jié)省材料，減少多糖損失率和簡(jiǎn)化工藝流程，確定采用AB-8樹脂用于烏龍茶多糖脫色脫蛋白工藝，可以為烏龍茶多糖在分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定等方面的進(jìn)一步發(fā)展提供相應(yīng)的技術(shù)支持。