仇笑笑
(山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院,山西太原 030025)
臨床中沙門菌是一種廣泛分布在自然界中的革蘭氏陰性桿菌,可導(dǎo)致貝類、羊、豬、雞、鴨等多種動(dòng)物和人患病[1]。目前多采用抗生素抑制沙門菌增殖,但近年來隨著抗生素藥品的濫用,沙門菌耐藥性顯著提升,給國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí),沙門菌作為一種常見的食源性致病菌,對(duì)人類身體健康也產(chǎn)生了一定程度的影響[2]。臨床中噬菌體能夠特異性侵染細(xì)菌,通過自身特定配體同細(xì)菌表層特定受體相結(jié)合的途徑裂解細(xì)菌,從而抑制病菌增殖,且沙門菌噬菌體僅會(huì)影響沙門菌合成,并不會(huì)對(duì)正常菌群產(chǎn)生不良影響,不受細(xì)菌耐藥性的制約,屬于天然、安全的抑菌劑[3-4]。為了探討抗沙門菌的有效方法,利用噬菌體治療細(xì)菌感染,就沙門菌烈性噬菌體的分離鑒定與生物學(xué)特性進(jìn)行如下探討。
選自臨病死雞中分離出的沙門氏菌菌株,墊料、糞便均源于山西省尖草坪區(qū)、長子縣、高平市、臨猗縣和壺關(guān)縣等地商品肉雞場。
日立Hitachi H-9500透射電子顯微鏡;LB培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基購于北京陸橋公司;Beckman Coulter Avanti J-26S離心機(jī);蘇瑞電子設(shè)備(北京)有限公司提供的DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱;Millex-GV SLGVX13NL 1000細(xì)菌過濾器;上海知楚儀器有限公司提供的ZQZY-88BV型全溫振蕩培養(yǎng)箱。全部研究材料和用品均處于有效期內(nèi),器械性能正常。
1.2.1 處理樣本
采集雞糞和墊料30 g,加入200 mL無菌生理鹽水內(nèi),確保浸泡充分,自然沉降240 min后取上清液,12000 r/min離心處理15 min,再使用濾器過濾(0.22 μm),以濾液作為分離噬菌體的母液。
1.2.2 菌種復(fù)蘇與菌懸液制備
復(fù)蘇冷凍保存的沙門菌,挑取生長菌落轉(zhuǎn)移至LB肉湯內(nèi),放置在全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng),制備好菌懸液,備用。
1.2.3 采用雙層平板法分離噬菌體
在操作過程中取1.2.1中的母液3 mL和增殖后的沙門菌菌懸液200 μL,均勻混合,震蕩培養(yǎng),維持溫度37 ℃,過夜后采集培養(yǎng)后的增殖液在10 000 r/min條件下進(jìn)行離心處理5 min,再使用細(xì)菌濾器(0.22 μm)進(jìn)行過濾處理。取濾液200 μL與菌懸液100 μL均勻混合后,放置在37 ℃溫箱內(nèi)孵育5 min。將混合液添加至融化后冷卻到45 ℃左右的含瓊脂(0.7%)LB上層瓊脂內(nèi),均勻混合,將上層瓊脂倒進(jìn)下層營養(yǎng)瓊脂中,等待凝固,再放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)8~10 h,溫度37 ℃,觀察噬菌斑生長情況。
1.2.4 純化噬菌體
使用無菌鑷子扣取培養(yǎng)基內(nèi)的單個(gè)噬菌斑,將其放置在裝有1 mL生理鹽水的無菌離心管,水浴30 min,溫度40 ℃,待水浴完畢立即在10 000 r/min條件下予以離心處理5 min,適度稀釋浸出液,將其與宿主菌鋪在雙層平板上,重復(fù)扣取單個(gè)噬菌斑實(shí)施純化操作,直至獲取形態(tài)、大小均一的蝕斑為止,共純化7代。
1.2.5 測定噬菌體效價(jià)
使用液體增值法測定效價(jià),扣取單個(gè)噬菌斑后制備噬菌體浸出液,采集浸出液500 μL和宿主菌懸液200 μL,與LB肉湯均勻混合后震蕩培養(yǎng),溫度37 ℃。取增值液在10 000 r/min條件下進(jìn)行離心處理5 min,適度稀釋后采集200 μL并與宿主菌100 μL鋪雙層平板進(jìn)行效價(jià)檢測。
1.2.6 測定噬菌體裂解譜
使用點(diǎn)樣法進(jìn)行檢測,采集待測菌懸液100 μL,轉(zhuǎn)移至瓊脂平板上,使用無菌棉簽涂勻,確認(rèn)菌液吸收完全后取噬菌體增值液2.5 μL,點(diǎn)涂至涂好菌的瓊脂培養(yǎng)基上,確認(rèn)噬菌體增值液被完全吸收后,將瓊脂培養(yǎng)基放置在溫箱內(nèi)孵育10 h,溫度37 ℃。
1.2.7 觀察噬菌體形態(tài)
取15 μL噬菌體增值液,添加至微孔銅網(wǎng)上進(jìn)行自然沉降,15 min后借助濾紙吸收多余液體,再滴加2%磷鎢酸10 μL實(shí)施染色處理,使用濾紙吸除多余液體,自然干燥后利用電鏡觀察噬菌體形態(tài)。
1.2.8 噬菌體溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)
取噬菌體增值液150 μL,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,放置在 40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和 80 ℃的水浴中,掌握水浴作用20 min、40 min和60 min的效價(jià)變化,各溫度梯度重復(fù)2次,觀察噬菌體效價(jià)在不同溫度梯度中的變化情況。
經(jīng)本次實(shí)驗(yàn),成功分離到噬菌體1株,命名為CR5,經(jīng)過7代純化處理后,通過增殖進(jìn)行效價(jià)測定,發(fā)現(xiàn)效價(jià)為109PFU/mL。
CR5可成功裂解實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的33株沙門菌中的17株,屬于寬裂解譜噬菌體。
經(jīng)透射電鏡可清晰觀察到噬菌體CR5由多平面體頭部及細(xì)長尾部構(gòu)成,頭部呈六邊形,直徑約為50 nm,尾部長度約為110 nm,詳見圖1。
觀察噬菌體效價(jià)在不同溫度梯度中的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),噬菌體CR5效價(jià)隨溫度變化會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化,具體情況如下:在40 ℃作用1 h后,噬菌體CR5仍可維持原有活性,在50 ℃、60 ℃狀態(tài)中20 min后效價(jià)下降,但仍可達(dá)到109PFU/mL;在70 ℃狀態(tài)下20 min后,CR5效價(jià)快速下降,降至106PFU/mL,在作用1 h后效價(jià)降至25 PFU/mL;在80 ℃狀態(tài)中20 min后即完全失活。溫度對(duì)噬菌體CR5的影響見圖2。
圖1 噬菌體CR5電鏡下形態(tài)
圖2 噬菌體CR5的熱穩(wěn)定性
近年來,多重耐藥沙門菌在全球各地均有報(bào)道,因此有效防控沙門菌感染已成為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)關(guān)注的重要問題,相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,噬菌體可有效抑制沙門菌感染,與抗生素比較無耐藥性缺陷,可依賴宿主菌完成復(fù)制,具有使用劑量小、專一性強(qiáng)、對(duì)正常菌群副作用低的優(yōu)勢[5]。噬菌體在自然環(huán)境中分布廣泛,為人類提供豐富抗菌資源庫,目前被分離、利用的噬菌體較少。有學(xué)者[6]研究后發(fā)現(xiàn),噬菌體能夠在宿主菌上吸附,并在宿主菌內(nèi)部生長、增殖,對(duì)耐藥宿主菌進(jìn)行裂解,為沙門菌臨床抗感染治療提供了思路,具有重要的參考意義。本次研究中分離得到的噬菌體CR5效價(jià)達(dá)到109PFU/mL,且電鏡觀察結(jié)果提示,噬菌體CR5呈長尾狀。分析后可知,雙層平板上裂解性噬菌體的蝕斑邊緣清晰、形狀規(guī)則、透亮,能夠清晰觀察噬菌體形態(tài),發(fā)現(xiàn)噬菌體CR5由頭部和尾部兩部分組成,屬于長尾科。而裂解性噬菌體能夠通過裂解宿主菌細(xì)胞,加快細(xì)菌死亡,在致病菌防控中發(fā)揮著積極的作用。本次分離得到的噬菌體CR5對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的33株沙門菌中的17株進(jìn)行了成功裂解,裂解性較好,但仍有部分沙門菌未得到裂解,提示CR5僅能夠裂解部分種類的沙門菌,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
江艷華[7]對(duì)分離到的一株沙門菌噬菌體進(jìn)行生物學(xué)特性分析后發(fā)現(xiàn),噬菌體具有較好的溫度耐受性,可逐漸降低宿主菌數(shù)目,能夠作為生物抑菌劑防控沙門菌感染。陳義寶等[8]實(shí)踐后發(fā)現(xiàn),使用雙層平板法篩選、純化沙門菌噬菌體,并利用電鏡觀察噬菌體形態(tài),可了解沙門菌噬菌體的生物學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)該噬菌體對(duì)不同溫度均具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力,裂菌效果良好,可作為抗沙門菌制劑進(jìn)行開發(fā)。噬菌體CR5不同溫度下的活性試驗(yàn)證實(shí)該種噬菌體具有較好的溫度耐受性,在低溫環(huán)境中可有效降低宿主菌數(shù)量,在較高溫度條件下(40~60 ℃)可于一定時(shí)間內(nèi)(1 h)降低宿主菌數(shù)目,之后受殘留宿主菌繁殖速度超過噬菌體裂解速度因素影響,導(dǎo)致抑菌效果受限。因此在宿主菌處于抑制條件時(shí)具有良好的裂菌效果,臨床中可通過調(diào)控溫度與聯(lián)合使用其他抗菌制劑的方式,增強(qiáng)抑菌效果。
對(duì)分離到的噬菌體實(shí)施純化、裂解譜檢測、效價(jià)檢測、電鏡形態(tài)觀察后發(fā)現(xiàn),沙門菌噬菌體溫度耐受性較好,屬于一種長尾科、強(qiáng)裂解性噬菌體,能夠有效發(fā)揮抑制沙門菌的效用,具有積極的應(yīng)用意義。